向陽(yáng)，李霞,2,*，秦艷杰，單莉娟，楊艷津

1.大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,大連116023

2.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,大連116023

殺蟲(chóng)單對(duì)不同倍性泥鰍鰭細(xì)胞系的毒性作用

向陽(yáng)1，李霞1,2,*，秦艷杰1，單莉娟1，楊艷津1

1.大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,大連116023

2.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,大連116023

以泥鰍鰭二倍體(DIMF)和三倍體(TRMF)細(xì)胞系為受試細(xì)胞，研究殺蟲(chóng)單對(duì)2種細(xì)胞系的毒性作用。采用噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)得DIMF與TRMF 24 h半致死濃度分別為119.73 mg·L-1、146.26 mg·L-1。DIMF的敏感性明顯高于TRMF。經(jīng)殺蟲(chóng)單處理的活體細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞伸長(zhǎng)，空泡化和脫落并游離于培養(yǎng)基表面的現(xiàn)象。2種細(xì)胞系酶活力測(cè)定的結(jié)果顯示：殺蟲(chóng)單濃度為0～100 mg·L-1時(shí)，SOD和GST活力隨著濃度的增加而增加，100～200 mg·L-1濃度組酶活力逐漸降低；0～200 mg·L-1時(shí)，AChE活力與殺蟲(chóng)單濃度呈負(fù)相關(guān)，并且三倍體3種酶活力均高于二倍體。微核試驗(yàn)結(jié)果顯示：50 mg·L-1殺蟲(chóng)單就能對(duì)細(xì)胞核造成損傷并形成微核，微核率隨殺蟲(chóng)單濃度增加而增加。當(dāng)殺蟲(chóng)單濃度達(dá)到200 mg·L-1時(shí)，微核率出現(xiàn)最大值，DIMF和TRMF分別為3.3‰和3.7‰，2種細(xì)胞的測(cè)試結(jié)果無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。電鏡觀察結(jié)果顯示：對(duì)照組DIMF和TRMF超微結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差異；DIMF和TRMF病理變化情況相似：染色質(zhì)凝集趨邊，細(xì)胞核分解成多個(gè)，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡和凋亡小體，表現(xiàn)出凋亡的特征。研究表明殺蟲(chóng)單的細(xì)胞毒性機(jī)制是通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)酶活性從而誘導(dǎo)凋亡，不同倍性細(xì)胞系之間的差異主要與多倍體細(xì)胞體積大，胞內(nèi)物質(zhì)多，分裂快，生長(zhǎng)旺盛等有關(guān)。

殺蟲(chóng)單；泥鰍鰭細(xì)胞系；二倍體；三倍體；酶活力；微核率；超微結(jié)構(gòu)；凋亡

向陽(yáng),李霞,秦艷杰,等.殺蟲(chóng)單對(duì)不同倍性泥鰍鰭細(xì)胞系的毒性作用[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2016,11(3):308-315

Xiang Y,Li X,Qin Y J,et al.In vitro cytotoxicity test of monosultap using different ploidy loach fin cell lines[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016, 11(3):308-315(in Chinese)

農(nóng)藥的使用，雖然給農(nóng)業(yè)的增產(chǎn)增收提供了保障，卻給水生生物以及人類健康帶來(lái)了嚴(yán)重威脅[1]。相關(guān)農(nóng)藥毒性研究較多是利用魚(yú)類個(gè)體開(kāi)展的，近年來(lái)利用魚(yú)類細(xì)胞系的進(jìn)行農(nóng)藥及海洋污染物的毒性研究越來(lái)越受到重視。陸續(xù)報(bào)道的有褐色大頭鯰BB細(xì)胞系[2]、虹鱒RTG-2細(xì)胞系[3]、鱸魚(yú)心臟細(xì)胞系[4]、真鯛鰭細(xì)胞系[4]、牙鲆鰓細(xì)胞系[5]、褐點(diǎn)石斑魚(yú)鰭細(xì)胞系[6]、大黃魚(yú)鰭細(xì)胞系[7]等用于農(nóng)藥及海洋污染物的毒性分析。殺蟲(chóng)單(monosultap)化學(xué)名稱1-硫代磺酸鈉基-2-二甲氨基-3-硫代磺酸基丙烷，是一種對(duì)昆蟲(chóng)具有觸殺和胃毒作用的人工合成沙蠶毒類殺蟲(chóng)劑[8]，主要用于水稻害蟲(chóng)的防治。目前較多報(bào)道是殺蟲(chóng)單在環(huán)境中殘留的檢測(cè)方法[9-10]，而利用細(xì)胞系對(duì)殺蟲(chóng)單的檢測(cè)尚未見(jiàn)報(bào)道。

泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)作為一種環(huán)境污染指示生物，具有對(duì)農(nóng)藥敏感的特點(diǎn)，成為毒理學(xué)研究較為理想的實(shí)驗(yàn)材料[11-13]。泥鰍毒理學(xué)研究多集中于重金屬、農(nóng)藥等的毒性效應(yīng)[13]。已有報(bào)道如Hg、Cu、Pb和Zn四種重金屬對(duì)泥鰍胚胎發(fā)育與仔魚(yú)成活影響的研究[14]，甲胺磷與敵枯雙對(duì)泥鰍紅細(xì)胞微核的誘導(dǎo)的影響[15]等。而關(guān)于殺蟲(chóng)單對(duì)泥鰍毒理學(xué)的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本文采用實(shí)驗(yàn)室建立的泥鰍鰭二倍體和三倍體細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)材料，研究了殺蟲(chóng)單對(duì)其存活率、細(xì)胞形態(tài)、酶活力、微核率和超微結(jié)構(gòu)損傷的影響。目的是探討殺蟲(chóng)單的細(xì)胞毒性機(jī)制，從而建立殺蟲(chóng)單農(nóng)藥的體外毒性檢測(cè)體系。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的60-70代泥鰍鰭二倍體細(xì)胞系(DIMF)和三倍體細(xì)胞系(TRMF)由大連海洋大學(xué)細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室2012年建立。細(xì)胞在含20%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)(25℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱)。

實(shí)驗(yàn)所用的90%殺蟲(chóng)單可溶性粉劑購(gòu)于西華農(nóng)藥廠。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰酶均為Hyclone公司產(chǎn)品。MTT粉、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)置于上海生工。超氧化物歧化酶(SOD)、乙酰膽堿酯酶(AChE)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在超凈工作臺(tái)上取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、狀態(tài)良好的60-70代DIMF細(xì)胞和TRMF細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)· mL-1，以每孔100 μL接種于96孔板或等密度接種5 mL到25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h后，棄掉原培養(yǎng)基。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，已確定濃度達(dá)到350 mg·L-1時(shí)二倍體與三倍體細(xì)胞全部死亡，故設(shè)置殺蟲(chóng)單濃度梯度0、50、100、150、200、250、300、350 mg·L-1，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)重復(fù)，用于MTT檢測(cè)。培養(yǎng)瓶中加入5 mL濃度為0、50、100、150、200 mg·L-1殺蟲(chóng)單，用于酶活性、微核的研究。以上細(xì)胞均在CO2培養(yǎng)箱(5%，25℃)中培養(yǎng)24 h。

1.2.2 殺蟲(chóng)單對(duì)泥鰍鰭細(xì)胞系毒性作用的MTT檢測(cè)

按照1.2.1方法染毒24 h后，加入20 μL的5 mg·L-1MTT溶液于96孔板中，25℃孵育4 h，棄掉培養(yǎng)基，用預(yù)熱到37℃磷酸緩沖液(PBS)輕輕快速清洗2次，每孔加入150 μL DMSO溶解甲臜溶液，室溫震蕩10 min，在酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)下測(cè)各孔吸光值，計(jì)算其平均值。

細(xì)胞存活率計(jì)算公式：細(xì)胞存活率=(處理組吸光度值-空白對(duì)照組吸光度值)/(陰性對(duì)照組吸光度值-空白對(duì)照組吸光度值)×100%。

1.2.3 殺蟲(chóng)單對(duì)泥鰍鰭細(xì)胞系超氧化物歧化酶(SOD)、乙酰膽堿酯酶(AChE)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)活性檢測(cè)

按照1.2.1方法染毒，培養(yǎng)24 h后，用胰酶消化并收集細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，1 500 r·min-1離心l0 min，將沉淀用PBS重懸后，在冰浴中用超聲波破碎儀破碎細(xì)胞(工作3 s，間隙3 s，處理10 min)，將破碎后的細(xì)胞懸液于2 000 r·min-1，4℃離心10 min，離心收集上清液，分別按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行酶活力測(cè)定。

1.2.4 細(xì)胞微核率的測(cè)定

按照1.2.1染毒方法處理細(xì)胞24 h后，胰酶消化并收集培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min，去上清，用0.5 mL PBS重懸細(xì)胞。將細(xì)胞滴于干凈的載玻片上，采用45°推片的方法快速推片，甲醇固定10 min，用Giemsa染液(PBS:Giemsa 9:1)染色5 min，蒸餾水沖洗，晾干，鏡檢。每個(gè)片計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞以上，記錄微核細(xì)胞數(shù)。微核率=有微核的細(xì)胞數(shù)/觀察到的細(xì)胞總數(shù)×1000‰。

1.2.5 電鏡樣品制備及觀察

取對(duì)照組和半致死濃度組的DIMF和TRMF細(xì)胞，用胰酶處理細(xì)胞并收集在離心管中，1 500 r· min-1離心10 min，去上清，加入3%戊二醛固定，4℃固定6 h以上。棄去固定液，固定好的樣品用PBS漂洗3次，每次5 min。再用1%鋨酸于4℃固定1.5 h，然后用乙醇系列脫水，用環(huán)氧樹(shù)脂Epon812對(duì)樣品包埋后切片，超薄切片經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸各染色30 min，置于HITACHI-600透射電鏡下觀察拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 17.0軟件分析處理數(shù)據(jù)。使用t-test進(jìn)行組間顯著性差異分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P＜0.05表示顯著差異，P＜0.01表示極顯著差異。

2 結(jié)果（Results）

2.1 殺蟲(chóng)單對(duì)DIMF和TRMF細(xì)胞存活率的影響

圖1給出了不同濃度殺蟲(chóng)單處理DIMF和TRMF細(xì)胞24 h后的存活率曲線。從圖中可以看出2種細(xì)胞變化規(guī)律基本一致。細(xì)胞存活率與濃度自然對(duì)數(shù)間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其回歸方程分別為：y=-56.981x+322.67(R2=0.9871)，y=-48.845x+ 293.51(R2=0.9810)，計(jì)算得出DIMF和TRMF 24 h半致死濃度分別為119.71 mg·L-1、146.26 mg·L-1。50 mg·L-1殺蟲(chóng)單即可引起細(xì)胞死亡，此時(shí)兩者的存活率分別為95.89%與97.93%，隨著濃度的增加，其存活率逐漸降低，且存在明顯的濃度依賴性。當(dāng)殺蟲(chóng)單濃度達(dá)到300 mg·L-1時(shí)，二倍體全部死亡，當(dāng)濃度達(dá)到350 mg·L-1時(shí)，三倍體全部死亡?？傮w來(lái)看，二倍體各濃度組死亡率比三倍體要高一些。

圖1 殺蟲(chóng)單對(duì)泥鰍鰭二倍體細(xì)胞系（DIMF）和三倍體細(xì)胞系（TRMF）存活率的影響

2.2 殺蟲(chóng)單處理DIMF與TRMF細(xì)胞的光鏡觀察結(jié)果

在倒置顯微鏡下觀察染毒后細(xì)胞的變化，正常細(xì)胞排列緊密，呈纖維樣，貼壁生長(zhǎng)(圖2A，D)。染毒24 h后細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化，二倍體和三倍體細(xì)胞變化一致。100 mg·L-1殺蟲(chóng)單濃度組部分細(xì)胞胞體伸長(zhǎng)呈線狀，200 mg·L-1殺蟲(chóng)單濃度組中多數(shù)細(xì)胞胞體伸長(zhǎng)，細(xì)胞輪廓模糊，有些細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡或脫離培養(yǎng)瓶壁，懸浮在培養(yǎng)液中(見(jiàn)圖2B，E)，當(dāng)殺蟲(chóng)單濃度達(dá)250 mg·L-1時(shí)多數(shù)細(xì)胞變圓脫落、貼壁的很少(見(jiàn)圖2C，F(xiàn))。

圖2 不同濃度殺蟲(chóng)單處理后泥鰍鰭DIMF與TRMF的形態(tài)變化

2.3 殺蟲(chóng)單對(duì)泥鰍鰭細(xì)胞系酶活性的影響

2.3.1 殺蟲(chóng)單對(duì)細(xì)胞系SOD的影響

圖3為不同濃度殺蟲(chóng)單處理DIMF和TRMF細(xì)胞24 h后的SOD活力圖，50 mg·L-1殺蟲(chóng)單濃度組引起了SOD酶活力增加，100 mg·L-1殺蟲(chóng)單濃度組SOD活性最高，和對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.05)，以后隨濃度升高酶活性降低，各濃度組三倍體細(xì)胞系酶活力均高于二倍體細(xì)胞系(P＜0.05)。

圖3 不同濃度殺蟲(chóng)單處理后泥鰍鰭DIMF和TRMF的SOD酶活力

圖4 不同濃度殺蟲(chóng)單處理后泥鰍鰭DIMF和TRMF的AChE酶活力

2.3.2 殺蟲(chóng)單對(duì)細(xì)胞系A(chǔ)ChE的影響

在0～200 mg·L-1時(shí)，在二倍體與三倍體AChE酶活力與對(duì)照組比均顯著性降低(P＜0.05)，并具有濃度依賴性。但三倍體酶活力均高于二倍體細(xì)胞(P＜0.05)。

2.3.3 殺蟲(chóng)單對(duì)細(xì)胞系GST的影響

殺蟲(chóng)單處理24 h后，50 mg·L-1濃度組并未引起二倍體GST活性的顯著變化。當(dāng)濃度達(dá)100 mg· L-1時(shí)酶活力顯著升高，達(dá)到最大值，與對(duì)照組比較差異顯著，(P＜0.01)，隨著殺蟲(chóng)單濃度增加酶活性又逐漸降低，各濃度組三倍體細(xì)胞系酶活性均高于二倍體細(xì)胞系(P＜0.05)。

圖5 不同濃度殺蟲(chóng)單處理后泥鰍鰭DIMF和TRMF的GST酶活力

2.3.4 殺蟲(chóng)單對(duì)細(xì)胞系微核率的影響

殺蟲(chóng)單處理后的DIMF與TRMF均出現(xiàn)微核，兩者的變化規(guī)律較一致，微核出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中，呈圓形且邊緣光滑，與細(xì)胞核染色一致，如圖6A、B所示。由表一可知，經(jīng)殺蟲(chóng)單處理后DIMF和TRMF微核率與對(duì)照組比較有顯著提高，當(dāng)濃度達(dá)到200 mg·L-1時(shí)，兩者的微核率最大，分別為3.3‰和3.7‰，分別為對(duì)照組的10倍和11.2倍。隨著濃度增加，在同一濃度下，二倍體與三倍體之間微核率差異不顯著(P＞0.05)。

圖6 殺蟲(chóng)單處理后泥鰍鰭DIMF（A）與TRMF（B）細(xì)胞核的形態(tài)

表1 不同濃度殺蟲(chóng)單對(duì)泥鰍鰭DIMF和TRMF微核率的影響Table 1 The effect of different concentrations of monosultap on the micronucleus rates of loach fin DIMF and TRMF

2.4 殺蟲(chóng)單對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)照組中DIMF細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，有明顯可見(jiàn)的核，核膜完整，細(xì)胞核邊界明顯，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)完整，有大量線粒體。TRMF細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與DIMF相似，只是核體積較DIMF大，細(xì)胞中空泡較多。(見(jiàn)圖7A，B)。經(jīng)半致死濃度殺蟲(chóng)單處理的細(xì)胞，DIMF和TRMF病理變化一致，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變：細(xì)胞核分解成多個(gè)，線粒體、核糖體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器消失(見(jiàn)圖7C)，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡(見(jiàn)圖7D)，出現(xiàn)凋亡小體(見(jiàn)圖7E，F(xiàn))，表現(xiàn)出凋亡的特征。

圖7 殺蟲(chóng)單處理后泥鰍鰭DIMF和TRMF超微結(jié)構(gòu)變化

3 討論（Discussion）

殺蟲(chóng)單可引起細(xì)胞形態(tài)發(fā)生較大變化。正常的泥鰍鰭細(xì)胞為成纖維樣，貼壁生長(zhǎng)。低濃度殺蟲(chóng)單處理的泥鰍鰭細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞伸長(zhǎng)，透明度降低等早期變化，隨著殺蟲(chóng)單濃度的增加，細(xì)胞表現(xiàn)為空泡化，顆粒樣物質(zhì)增多，細(xì)胞間空隙加大，最后脫離培養(yǎng)瓶底等晚期變化。作者認(rèn)為泥鰍鰭細(xì)胞系早、晚期形態(tài)的改變等特征可作為環(huán)境中殺蟲(chóng)單的檢測(cè)指標(biāo)。超微結(jié)構(gòu)變化顯示經(jīng)殺蟲(chóng)單處理的DIMF和TRMF細(xì)胞，細(xì)胞核分解成多個(gè)，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡，并伴隨著凋亡小體產(chǎn)生，上述變化符合細(xì)胞凋亡的特征[16-17]。殷立成和郭華榮[5]在探討丁草胺對(duì)牙鲆鰓細(xì)胞系急性毒性作用中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)的改變與細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)活性有直接的關(guān)系。Peikert等[18]在研究呼吸道上皮細(xì)胞的凋亡和脫落與誘發(fā)哮喘之間的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，SOD的活性與呼吸道上皮細(xì)胞脫落或凋亡的發(fā)生呈線性關(guān)系，也即是說(shuō)SOD活性增加時(shí)能夠保護(hù)細(xì)胞不致脫落或凋亡。本實(shí)驗(yàn)中100～200 mg·L-1濃度組，隨殺蟲(chóng)單濃度的增加，SOD酶活力逐漸降低，證明細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化與SOD活性有關(guān)。GST作為生物體重要的解毒酶，可催化脂溶性物質(zhì)的甲基與谷胱甘肽(GSH)結(jié)合，來(lái)降低農(nóng)藥對(duì)細(xì)胞的損傷。過(guò)高的殺蟲(chóng)單濃度會(huì)造成細(xì)胞自身抗氧化能力不足，導(dǎo)致氧化酶系統(tǒng)損傷，同時(shí)抑制AChE酶活性，使細(xì)胞不能及時(shí)地對(duì)外界刺激做出反應(yīng)，還能將底物GSH耗盡，細(xì)胞內(nèi)GST無(wú)法誘導(dǎo)，使細(xì)胞表現(xiàn)出一系列的急性中毒癥狀[19-22]。所以殺蟲(chóng)單的細(xì)胞毒性機(jī)制是破壞細(xì)胞的代謝平衡和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖停滯，使細(xì)胞內(nèi)酶活性改變從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

微核是藥物作用于分裂期細(xì)胞的紡錘體，使染色體斷裂、丟失、結(jié)構(gòu)破壞[23]而產(chǎn)生的。樓允東和吳萍[15]在研究甲胺磷和敵枯雙2種農(nóng)藥對(duì)泥鰍紅細(xì)胞微核影響時(shí)發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi)，微核細(xì)胞率與農(nóng)藥濃度呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中50 mg·L-1殺蟲(chóng)單就能對(duì)細(xì)胞核產(chǎn)生損傷，形成微核，而且微核率隨殺蟲(chóng)單濃度增加而增加，在200 mg·L-1時(shí)，微核率出現(xiàn)最大值。農(nóng)藥能誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷，但氧化損傷對(duì)微核的形成影響較小[24]。DNA損傷導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂時(shí)染色體發(fā)生斷裂，在細(xì)胞間期喪失著絲粒的染色體片段滯留在主核外形成微小染色質(zhì)塊。當(dāng)農(nóng)藥作用后，誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷，但DNA通過(guò)合成與修復(fù)作用，損傷部位能得到快速修復(fù)，另一方面，氧化劑主要是導(dǎo)致DNA單鏈斷裂，損傷的正確修復(fù)率大大提高，并且DNA單鏈斷裂對(duì)微核的形成影響很小。微核率檢測(cè)對(duì)揭示農(nóng)藥對(duì)水生生物體的潛在危害及作用本質(zhì)具有重要意義，可以將微核率作為檢測(cè)殺蟲(chóng)單對(duì)細(xì)胞損傷的指標(biāo)。

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In Vitro Cytotoxicity Test of Monosultap Using Different Ploidy Loach Fin Cell Lines

Xiang Yang1,Li Xia1,2,*,Qin Yanjie1,Shan Lijuan1,Yang Yanjin1

1.Key Laboratory of Marine Bio-resource Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China
2.Key Laboratory of Mariculture of Agriculture Ministry,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China

13 May 2015 accepted 22 October 2015

In this study,loach findiploid cell line(DIMF)and triploid cell line(TRMF)were used to assess toxicity of monosultap in vitro.The 24 h semi-lethal concentrations of DIMF and TRMF measured by thiazole blue(MTT) method were 119.73 mg·L-1and 146.26 mg·L-1,respectively.DIMF was more sensitive to monosultap than TRMF. After exposure to monosultap,the cellular morphology showed the phenomenon with elongation,vacuolization andexfoliation.When the monosultap concentration was 0-100 mg·L-1,the activities of superoxide dismuta(SOD)and glutathione S-transferase(GST)in two cell lines were increased with the increase of concentration,however,while the concentration was 100-200 mg·L-1,the activities of both enzymes gradually decreased.When the concentration was 0-200 mg·L-1,the activity of acethlcholine esterase(AChE)in two cell lines was negatively correlated with the concentration of monosultap.The activties of three enzymes in TRMF were higher than those in DIMF.Micronucleus test showed that 50 mg·L-1monosultap could cause the nucleus damage and form micronucleus.The rate of micronucleus increased with the increase of monosultap concentration.When monosultap concentration was 200 mg ·L-1,the maximum micronucleus rates of DIMF and TRMF were 3.3‰and 3.7‰,respectively,and no significant differences were observed between two cell lines(P＞0.05).The electron microscopic observations showed that DIMF and TRMF presented similar pathological changes,showing chromatin condensation,margination and cell nucleus decomposition.The numbers of mitochondria,ribosomes and endoplasmic reticulum reduced.Vacuoles and apoptotic bodies appeared in cells,which showed the characteristic of apoptosis.The present results showed that the cytotoxic mechanism of monosultap was inducing apoptosis by changing the intracellular enzyme activity.Differences between two ploidy cell lines were mainly related to the large cell volume,much intracellular substance,rapid cell division and vigorous growth of triploid.

monosultap;loach;fin;cell lines;diploid;triploid;enzyme activity;micronucleus rate;ultrastructure; apoptosis

2015-05-13 錄用日期：2015-10-22

1673-5897（2016）3-308-08

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150513002

簡(jiǎn)介：李霞(1961—)，女，海洋生物學(xué)碩士，教授，主要研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物繁育學(xué)，水產(chǎn)動(dòng)物發(fā)育學(xué)，細(xì)胞工程等，出版專著和教材4部，發(fā)表學(xué)術(shù)論文百余篇。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31272650)

向陽(yáng)(1991-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯鷳B(tài)毒理學(xué)，E-mail:aliaswork@163.com

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:lx@dlou.edu.cn