熊小琴，羅思，吳本麗,3，王劍偉

1.中國科學(xué)院水生生物研究所，武漢430072

2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049

3.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，合肥230031

不同硬度條件下Cd2+和Cu2+對稀有鮈鯽的急性毒性

熊小琴1,2，羅思1,2，吳本麗1,2,3，王劍偉1,*

1.中國科學(xué)院水生生物研究所，武漢430072

2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049

3.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，合肥230031

為研究水體硬度對稀有鮈鯽Cd2+和Cu2+毒性效應(yīng)的影響，開展了96 h急性毒性試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水體硬度(以CaCO3計(jì)，下同)為50 mg·L-1、250 mg·L-1、450 mg·L-1時，Cd2+對稀有鮈鯽的96 h半數(shù)致死濃度(96 h-LC50)分別為4.30 mg·L-1、12.06 mg·L-1、19.99 mg·L-1,對應(yīng)的安全濃度(SC)依次為0.430 mg·L-1、1.206 mg·L-1、1.999 mg·L-1；Cu2+對稀有鮈鯽的96 h-LC50分別為0.046 mg·L-1、0.148 mg·L-1、0.228 mg·L-1，對應(yīng)的SC依次為0.0046 mg·L-1、0.0148 mg·L-1、0.0228 mg·L-1。計(jì)算得到Cd2+對稀有鮈鯽急性毒性與水體硬度的擬合方程為ln 96 h-LC50=0.687 lnH-1.243(r=0.998)；Cu2+對稀有鮈鯽急性毒性與水體硬度的擬合方程為ln 96 h-LC50=0.727 lnH-5.923(r=0.999)，Cd2+和Cu2+對稀有鮈鯽的硬度斜率分別為0.687和0.727。這些結(jié)果表明，水體硬度可有效降低Cd2+和Cu2+對稀有鮈鯽的急性毒性，且稀有鮈鯽的硬度斜率與其他物種差異較大。在評估不同硬度水體下Cd2+和Cu2+的生物毒性及其生態(tài)風(fēng)險時，應(yīng)根據(jù)測試物種特異的硬度斜率而定。

水體硬度；Cd2+；Cu2+；稀有鮈鯽；急性毒性

熊小琴,羅思,吳本麗,等.不同硬度條件下Cd2+和Cu2+對稀有鮈鯽的急性毒性[J].生態(tài)毒理學(xué)報，2016,11(3):316-322

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隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，排污量逐漸增加，我國水體重金屬污染問題已十分突出，江河湖庫底質(zhì)的污染率高達(dá)80.1%[1]。以長江水系為例，各個江段均已受到不同程度的重金屬污染[2]。水體中的重金屬濃度過高時可對生物產(chǎn)生直接毒性作用。此外，由于重金屬具有親脂性、高富集性和難降解性等特點(diǎn)，它們進(jìn)入水體后極易在水生生物體內(nèi)積累，并隨著生物營養(yǎng)級的升高而增大，進(jìn)一步增加其潛在危害[3-4]。有研究表明，在已知的人類疾病中70%～80%與水體重金屬污染有關(guān)[5]。在我國，重金屬被認(rèn)為是嚴(yán)重威脅生態(tài)環(huán)境和人類健康的污染物之一[6]。

銅和鎘是我國水體中2個較為常見的重金屬污染物。鎘(Cd2+為主)由于能使蛋白質(zhì)變性，且無法通過水體的自凈作用去除，是一種會對環(huán)境、水生生物和人體健康造成潛在危害的重金屬[[7]。美國毒性管理委員會(ATSRD)把鎘列為第六大危害人體健康的有毒物質(zhì)，聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署(DNFP)將鎘列入重點(diǎn)研究的環(huán)境污染物，世界衛(wèi)生組織(WTO)把鎘作為優(yōu)先研究的食品污染物。相比之下，由于藻類控制劑硫酸銅(CuSO4)的廣泛使用已使銅(Cu2+為主)成為養(yǎng)殖水體重要的污染物[8]。近年來，我國水體已受到不同程度的鎘和銅污染[9-12]，從我國七大水系的調(diào)研結(jié)果可以看出，長江水系Cd污染僅次于Hg、COD、BOD和揮發(fā)酚；黃河水系有16.7%的斷面總Cd含量超標(biāo)；淮河干流總Cd含量超標(biāo)率為16.7%；海灤河總Cd含量平均超標(biāo)率為16.7%～83.9%；大遼河水系污染較輕，在對所統(tǒng)計(jì)的26個國控湖泊、水庫的監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)了不同程度的Cd污染，污染程度仍次于Hg[13]。非污染水體中銅含量在2 μg·L-1以下，但在污染較嚴(yán)重的礦區(qū)附近沉積物中的銅含量可高達(dá)5 000 mg·kg-1以上，如江西德興銅礦區(qū)、湖北大冶市銅綠山礦區(qū)、浙江哩鋪銅礦區(qū)附近沉積物中銅含量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了國家環(huán)境二級標(biāo)準(zhǔn)[14]。因此，開展Cd2+和Cu2+的生物毒性測試及其生態(tài)風(fēng)險評估對于水質(zhì)基準(zhǔn)制定和生態(tài)環(huán)境保護(hù)具有重要的意義。

大量研究表明，水體理化因子如溫度、硬度、堿度、有機(jī)碳含量、pH等[15-18]，以及生物因子如生長期、攝食等[19-20]都可能對重金屬的生物毒性測試造成影響，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性和有效性[21]。盡管水體硬度減緩重金屬生物毒性的作用機(jī)制存在爭議[18,22,23]，水體硬度對重金屬生物毒性的減緩作用已被廣為認(rèn)可。王偉莉等[24]研究發(fā)現(xiàn)，Cd2+和Cu2+對金鯽魚的急性毒性均隨著水體硬度的增加而減低。此外，周永欣等[25]還研究發(fā)現(xiàn)，水體硬度對Cu2+生物毒性的減緩作用在不同物種之間存在差異，水體硬度對鰱的保護(hù)作用明顯大于對大鱗副泥鰍的保護(hù)作用。中國地表水總硬度范圍較廣在4.5～ 15 600 mg·L-1(以CaCO3計(jì))之間，小于150 mg·L-1的軟水和極軟水面積占42%，150～300 mg·L-1的適度硬水占34%，300～450 mg·L-1的硬水占11%，大于450 mg·L-1的極硬水占13%[26]。以流域分，總硬度從高到低的排列順序?yàn)椋褐榻饔?、長江流域、紅河流域、怒江流域、瀾滄江流域、伊洛瓦底江流域[27]。從全國范圍來看，受干旱程度和降水大小的影響，總硬度的變化趨勢為：從東到西逐漸降低,從南到北逐漸升高。

稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)是我國《化學(xué)品測試方法》和《水和廢水檢測方法》推薦使用的測試生物中唯一的本土魚類，其魚類急性毒性測試方法已形成國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 29763-2013)。目前，稀有鮈鯽已被廣泛應(yīng)用于重金屬、有機(jī)污染物等毒性效應(yīng)測試及其生態(tài)風(fēng)險評估的研究中[28]。本研究通過96 h急性毒性試驗(yàn)，測定了不同硬度條件下重金屬Cd2+和Cu2+對稀有鮈鯽的急性毒性，旨在為稀有鮈鯽的毒性測試方法的規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

受試生物稀有鮈鯽取自中國科學(xué)院水生生物研究所自行培育的封閉群Ihb:IHB第8代，體長(2.51± 0.09)cm，體重(0.258±0.037)g。受試毒物CdCl2·2.5 H2O購自Geel(Belgium)公司，ACS級，用去離子水配成濃度為10 g·L-1(以Cd2+計(jì))的儲備液；CuCl2· 2H2O購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純(AR)級，用去離子水配成濃度為5 g·L-1(以Cu2+計(jì))的儲備液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

急性毒性試驗(yàn)方法參照GB/T 29763-2013。分別進(jìn)行了不同水體硬度(以CaCO3計(jì)，全文同)條件下Cd2+和Cu2+對稀有鮈鯽的急性毒性試驗(yàn)。試驗(yàn)用水為曝氣48 h后的稀釋水，稀釋水由CaCl2· 2H2O、MgSO4·7H2O、NaHCO3、KCl和去離子水配制[25]。實(shí)驗(yàn)容器為無縫玻璃缸(8 L，20 cm×20 cm× 20 cm)，每個實(shí)驗(yàn)容器盛放實(shí)驗(yàn)液5 L，每缸10尾，每個濃度設(shè)置3個平行，并設(shè)空白對照。采用半靜態(tài)試驗(yàn)方法，每隔24h更換一半試驗(yàn)液。試驗(yàn)溫度為(25± 1)℃，光照周期為12 h:12 h。分別于24 h、48 h、72 h、96 h記錄各組魚死亡數(shù)目。死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)為：玻璃棒反復(fù)觸動無任何反應(yīng)。試驗(yàn)期間，采用水質(zhì)分析儀(Hach 30Qd,USA)在換水前后測量各個試驗(yàn)組的水溫、電導(dǎo)率、pH和溶氧及其氧飽和度等水質(zhì)參數(shù)。

根據(jù)美國國家環(huán)境保護(hù)局(US EPA)技術(shù)文件對水質(zhì)基準(zhǔn)中硬度斜率毒性數(shù)據(jù)的計(jì)算要求[25]，同時，結(jié)合中國各個地區(qū)水硬度差異較大的實(shí)情，設(shè)置低硬度50 mg·L-1，中等硬度250 mg·L-1，和高硬度450 mg·L-1。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定在不同水體硬度條件下受試魚全部死亡的最低濃度和全部存活的最高濃度，以此來設(shè)置正式實(shí)驗(yàn)濃度范圍，按幾何級數(shù)設(shè)置試驗(yàn)濃度組(表1)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行半數(shù)致死劑量的計(jì)算，主要得出24 h、48 h、72 h和96 h的半致死濃度及其95%置信區(qū)間，采用經(jīng)驗(yàn)公式推算安全濃度，SC=0.1×96 h LC50，并通過一元線性回歸分析半致死濃度與硬度的相關(guān)性。數(shù)據(jù)分析中所用濃度均為設(shè)置濃度。

2 結(jié)果（Results）

2.1 水質(zhì)

實(shí)驗(yàn)暴露期間的硬度、溫度、pH、電導(dǎo)率、溶氧及其氧飽和度等水質(zhì)參數(shù)見表2。實(shí)測硬度值與預(yù)設(shè)硬度值差別不大。

2.2 中毒癥狀

表1 不同水體硬度條件下Cd2+和Cu2+的濃度設(shè)置Table 1 Concentrations of Cd2+and Cu2+under different water hardness

表2 毒性實(shí)驗(yàn)中的水質(zhì)參數(shù)Table 2 Physical and chemical characteristics of the test waters

實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，對照組中稀有鮈鯽游動自如，行為正常，無死亡發(fā)生。處理組中稀有鮈鯽在接觸毒物后，可觀察到明顯的中毒癥狀，尤其是高濃度組中試驗(yàn)魚暴露2 h左右表現(xiàn)為：浮頭、局促不安、四處亂串、上下游動和打轉(zhuǎn)等現(xiàn)象；隨后，魚體運(yùn)動遲緩，身體逐漸失去平衡，直至死亡。死亡時，沉于缸底，身體有不同程度的彎曲，口和鰓蓋多呈張開狀態(tài)，鰭基部有充血現(xiàn)象等。中毒癥狀隨著暴露濃度和暴露時間的增加而愈發(fā)明顯。

2.3 不同水體硬度條件下Cd2+和Cu2+對稀有鮈鯽的急性毒性

Cd2+和Cu2+對稀有鮈鯽的半致死濃度(LC50)及安全濃度見表3和表4。Cd2+和Cu2+對稀有鮈鯽的96 h-LC50值均隨著水體硬度的增加而降低，即隨著水體硬度的增加，2種重金屬離子對稀有鮈鯽的急性毒性逐漸下降。水體硬度從50 mg·L-1升高至250 mg·L-1時，Cd2+對稀有鮈鯽的急性毒性降低約2.8倍，從250 mg·L-1升高至450 mg·L-1時，Cd2+對稀有鮈鯽的急性毒性降低約1.7倍。相比之下，水體硬度從50 mg·L-1升高至250 mg·L-1時，Cu2+對稀有鮈鯽的急性毒性降低約3倍，從250 mg·L-1升高至450 mg·L-1時，Cu2+對稀有鮈鯽的急性毒性降低約1.5倍。通過線性擬合發(fā)現(xiàn)，水體硬度值與Cd2+和Cu2+對稀有鮈鯽的96 h-LC50值的自然對數(shù)均呈正相關(guān)關(guān)系，擬合方程分別為ln96 h-LC50=0.687lnH-1.243(r= 0.998)，ln96 h-LC50=0.727 lnH-5.923(r=1)，Cd2+和Cu2+的生物毒性硬度斜率依次為0.687和0.727。

3 討論（Discussion）

3.1 銅和鎘對稀有鮈鯽的急性毒性

本研究測定了不同硬度水體下Cd2+和Cu2+對稀有鮈鯽的急性毒性。在水體硬度為250 mg·L-1時，稀有鮈鯽對Cd2+和Cu2+的96 h-LC50分別為12.06mg·L-1和0.148 mg·L-1。這與吳本麗等[28]所報道的Cd2+對稀有鮈鯽急性毒性結(jié)果一致。國家環(huán)保部1986年制訂的《生物監(jiān)測技術(shù)規(guī)范(水環(huán)境部分)》中將化學(xué)物質(zhì)對魚類的毒性分為5個等級：LC5010 000 mg·L-1，微毒或無毒。參照此毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，對稀有鮈鯽而言，Cu2+和Cd2+分別為劇毒和高毒；其對稀有鮈鯽的急性毒性大小依次為Cu2+>Cd2+。

我國漁業(yè)相關(guān)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)包括《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB 11607-1989)、《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3838-2002)、《海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3097-1997)和《無公害水產(chǎn)品產(chǎn)地環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)》(GB/T 18407.4-2001)等。進(jìn)行一般性的漁業(yè)生態(tài)環(huán)境水質(zhì)評價時，主要依據(jù)《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》，選取其中的項(xiàng)目和濃度限值，而《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》中沒有規(guī)定的項(xiàng)目，則參考其他相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。一般按照水域類別和不同功能區(qū)劃分選擇《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》和《海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》中的項(xiàng)目及相應(yīng)級別的濃度限值。鎘和銅在國家《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》中最高允許排放濃度分別為0.005和0.01 mg·L-1，而在國家《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中的最高允許濃度分別為0.01和1.0 mg·L-1。本研究中，稀有鮈鯽在所設(shè)硬度條件下銅的安全濃度均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于1.0 mg·L-1。顯然，含銅地表水如果執(zhí)行國家《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，將有可能對魚類及其他水生生物帶來較大的危害。未來標(biāo)準(zhǔn)修訂中是否應(yīng)該對銅進(jìn)行更嚴(yán)格的控制，值得進(jìn)一步研究。

表3 不同硬度條件下Cd2+對稀有鮈鯽的急性毒性Table 3 Acute toxicity of Cd2+toG.rarusunder different water hardness

表4 不同硬度條件下Cu2+對稀有鮈鯽的急性毒性Table 4 Acute toxicity of Cu2+toG.rarusunder different water hardness

3.2 水體硬度對Cd2+和Cu2+急性毒性的影響

10～250 mg·L-1CaCO3的高質(zhì)量自然水、飲用水以及標(biāo)準(zhǔn)稀釋水"ISO7346/3"[29]常被用作稀有鮈鯽的養(yǎng)殖和試驗(yàn)用水，而有關(guān)水體硬度對稀有鮈鯽毒性測試結(jié)果的影響還未見報道。本研究結(jié)果表明，水體硬度可有效減低Cd2+和Cu2+對稀有鮈鯽的急性毒性。Cd2+和Cu2+在低硬度條件下導(dǎo)致100%死亡(EC100)的最低濃度在中等硬度條件下均無一尾死亡；中等硬度條件下，Cd2+的EC100在高硬度水體中的死亡率約為25%，Cu2+的EC100在高硬度水體中的死亡率約為55%。水體硬度越高，Cd2+和Cu2+對稀有鮈鯽的急性毒性越弱，這與先前的研究結(jié)果一致[22,24-25]。對于水體硬度能有效減弱重金屬毒性效應(yīng)的機(jī)理，一般認(rèn)為在較高硬度水體中，碳酸根、重碳酸根離子與重金屬離子形成絡(luò)合態(tài)離子或者沉淀，以及和鈣鎂離子共同作用形成更多不溶性碳酸鹽或碳酸鈣吸附在鰓上，從而降低生物對重金屬的吸收[18,30-31]；有學(xué)者提出Ca2+、Mg2+和重金屬離子在細(xì)胞膜上存在競爭吸附關(guān)系，高硬度水體中Ca2+和Mg2+濃度的增加減少了重金屬離子進(jìn)入生物膜的通道，進(jìn)而降低了生物對重金屬的吸收[22,32-33]；還有學(xué)者認(rèn)為Ca2+和Mg2+比例的改變影響了生物膜的滲透性，從而影響了重金屬離子的被動運(yùn)輸過程[34]。不過，也有部分研究發(fā)現(xiàn)水體硬度對重金屬積累和毒性沒有影響[35-37]，甚至還有研究表明水體硬度與重金屬毒性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[23]。筆者認(rèn)為這可能與不同測試物種、測試方法以及相關(guān)的檢測指標(biāo)有關(guān)。

盡管重金屬生物毒性的影響因素很多，但水體硬度對重金屬毒性的影響最具廣泛性。因此，US EPA將水體硬度作為研究重金屬安全閾值(水質(zhì)基準(zhǔn))時必須考慮的因素之一，大部分重金屬的水質(zhì)基準(zhǔn)都與水體硬度有函數(shù)關(guān)系。通過對不同硬度條件下生物毒性的數(shù)據(jù)分析，可以計(jì)算出硬度斜率用于表征硬度對污染物毒性效應(yīng)影響的大小。US EPA制定的Cd2+和Cu2+基準(zhǔn)的硬度斜率分別為1.0166和0.942[38-39]。閆振廣等[40]研究得到Cd2+對我國淡水水生生物的硬度斜率分別為1.1530。王偉莉等[24]研究得到Cd2+對金鯽魚毒性硬度斜率為0.513和0.923。Bjerselius等[22]研究發(fā)現(xiàn)，Cu2+對鮭鱒魚的硬度斜率為0.91。周永欣等[25]研究發(fā)現(xiàn)，Cu2+對草魚、鰱魚和大鱗副泥鰍的硬度斜率分別為0.9051，1.0207和0.7506。本研究中Cd2+和Cu2+對稀有鮈鯽的硬度斜率分別為0.697和0.727，這些數(shù)值均明顯低于上述研究結(jié)果。稀有鮈鯽是我國《化學(xué)品測試方法》推薦使用的測試物種之一，且作為唯一的本土測試魚類，在重金屬毒性測試及其風(fēng)險評估中具有重要的作用。采用上述研究所得的硬度斜率推算重金屬的生物毒性時勢必會低估其在低硬度水體的生態(tài)風(fēng)險以及高估其在高硬度水體下的生態(tài)風(fēng)險。因此，在評估不同硬度水體下Cd2+和Cu2+的生物毒性及其生態(tài)風(fēng)險時，應(yīng)根據(jù)測試物種特異的硬度斜率而定。

致謝：感謝中國科學(xué)院水生生物研究所周炳升研究員在文章修改中給予的幫助。

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Acute Toxicity of Cadmium and Copper to Gobiocypris rarus under Different Water Hardness

Xiong Xiaoqin1,2,Luo Si1,2,Wu Benli1,2,3,Wang Jianwei1,*

1.Institute of Hydrobiology,Chinese Academy of Sciences,Hubei 430042,China
2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China
3.Fisheries Research Institute,Anhui Academy of Agricultural Sciences,Anhui 230031,China

2 September 2015 accepted 23 November 2015

In the present study,the effects of water hardness(as CaCO3)on the acute toxicity to Chinese rare minnow(Gobiocypris rarus)were investigated.For cadmium(Cd),the 96-h median lethal concentration(96h-LC50) was 4.30,12.06,19.99 mg·L-1,under 50,250 and 450 mg·L-1concentrations of CaCO3,respectively,and the corresponding safety concentration(SC)was 0.430,1.206 and 1.999 mg·L-1.For copper(Cu),the 96 h-LC50was 0.046,0.148,0.228 mg·L-1,respectively,and the corresponding SC was 0.0046,0.0148,0.0228 mg·L-1,respective-ly.The relationship between acute toxicity of Cd to rare minnow and water hardness is:ln 96 h-LC50=0.687 lnH-1.243(r=0.998),while for Cu,the relationship is:ln 96 h-LC50=0.727 lnH-5.923(r=0.999).The hardness slope of toxicity of Cd2+and Cu2+was 0.687 and 0.727,respectively.The results showed that the water hardness effectively reduced the acute toxicity of Cd2+and Cu2+toG.rarus,and the hardness slope of heavy metals inG.raruswas quite different from that in other species.The present study also imply that the toxicity and ecological risk evaluation of Cd2+and Cu2+under different water hardness conditions should depend on the specific hardness slopes of different species.

water hardness;Cd2+;Cu2+;Gobiocypris rarus;acute toxicity

2015-09-02 錄用日期：2015-11-23

1673-5897（2016）3-316-07

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150902002

簡介：王劍偉(1967—)，男，理學(xué)博士，研究員，主要研究方向魚類實(shí)驗(yàn)動物學(xué)。

國家科技支撐計(jì)劃973項(xiàng)目(2011BAI15B01-41)；科技部863計(jì)劃資源環(huán)境領(lǐng)域重大項(xiàng)目(2012AA06A302)

熊小琴(1988—)，女，博士，研究方向?yàn)樯鷳B(tài)毒理學(xué)，E-mail:xiongxiaoqinxxq@163.com

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:wangjw@ihb.ac.cn