(姜鈺超　匡樂(lè)樂(lè)　王紅艷　段文元　蔡春泉

(1復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)系　上?！?00433; 2 天津市兒童醫(yī)院外科　天津　300074;3 濟(jì)南軍區(qū)總院心血管病研究所 濟(jì)南　250031)

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SHMT1基因啟動(dòng)子的rs638416位點(diǎn)與先天性心臟病的相關(guān)性

(姜鈺超1匡樂(lè)樂(lè)1王紅艷1段文元3蔡春泉2△

(1復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)系上海200433;2天津市兒童醫(yī)院外科天津300074;3濟(jì)南軍區(qū)總院心血管病研究所 濟(jì)南250031)

目的通過(guò)研究絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(serine hydroxy methyl transferase,SHMT1)基因啟動(dòng)子區(qū)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)來(lái)探討該基因與先天性心臟病 (congenital heart disease,CHD)的相關(guān)性。方法選取來(lái)自山東省的201例CHD患兒(病例組)和192例正常兒童(對(duì)照組),采用Sanger測(cè)序法對(duì)rs638416和rs117940726兩個(gè)位點(diǎn)的基因分型進(jìn)行病例-對(duì)照研究,進(jìn)一步用雙熒光素酶報(bào)告基因分析其是否為功能性SNP。結(jié)果兩個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型分布在病例組和對(duì)照組中均符合Hardy-Weinberg平衡;單位點(diǎn)分析顯示rs638416位點(diǎn)G等位基因在病例組中分布頻率顯著高于對(duì)照組 (P=0.009)。經(jīng)非條件Logistic回歸分析確定,Log-additive模型最適用于分析rs638416,且該模型下統(tǒng)計(jì)學(xué)差異最顯著 (OR=1.49,95%CI:1.11～ 2.01,P=0.007 4);雙熒光素酶報(bào)告基因分析顯示帶有G等位基因的啟動(dòng)子序列轉(zhuǎn)錄效率較帶有C等位基因的啟動(dòng)子序列低36% (P=0.013)。結(jié)論rs638416位點(diǎn)能影響SHMT1轉(zhuǎn)錄效率,并與心臟發(fā)育異常相關(guān),提示rs638416位點(diǎn)G等位基因是山東人群CHD發(fā)生的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子。

先天性心臟病;SHMT1;胸腺嘧啶合成;葉酸

先天性心臟病 (congenital heart disease,CHD)在所有出生缺陷中發(fā)生率最高,世界范圍內(nèi)新生兒的發(fā)生率接近1%[1]。目前在我國(guó)CHD總體發(fā)病率逐年升高,而且呈現(xiàn)南方高于北方、城市高于農(nóng)村的特點(diǎn),為提高國(guó)民出生人口素質(zhì),探索CHD致病機(jī)制已刻不容緩[2]。研究表明,環(huán)境因素和遺傳因素與CHD的發(fā)生有關(guān),該疾病的遺傳度為55%～65%[3]。

葉酸是人體必需的營(yíng)養(yǎng)元素,其作為一碳單位供體參與核苷酸合成以及甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。女性孕期補(bǔ)充葉酸可以預(yù)防包括CHD在內(nèi)的多種出生缺陷[4-6]。葉酸代謝途徑中關(guān)鍵基因多態(tài)性與CHD的關(guān)聯(lián)研究有助于揭示葉酸預(yù)防CHD發(fā)生的機(jī)制。

在葉酸通路中涉及葉酸中間代謝途徑的多個(gè)基因已經(jīng)被證明與CHD的發(fā)生有密切關(guān)系,但究竟是產(chǎn)生甲基化供體受阻,還是核苷酸從頭合成受限的效應(yīng)影響了心臟的早期發(fā)育,原因尚不明確[7-8]。本研究關(guān)注絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因(serine hydroxy methyl transferase,SHMT1)。研究證實(shí),細(xì)胞質(zhì)SHMT在脫氧胸苷酸的從頭合成過(guò)程中起關(guān)鍵作用,該酶能夠?qū)⒔z氨酸上的一碳單位傳遞至亞甲基四氫葉酸上,后者作為一碳單位供體在胸苷酸合酶 (thymidylate synthase,TYMS)催化下將dUMP轉(zhuǎn)化為dTMP[9-11]。亞甲基四氫葉酸除了向dUMP提供甲基外,同時(shí)也能提供甲硫氨酸合成所需的甲基,同位素示蹤研究顯示N5,N10-亞甲基四氫葉酸上的甲基主要用于合成dTMP[12]。SHMT1在參與葉酸代謝途徑的基因中相對(duì)重要,許多涉及葉酸代謝的疾病關(guān)聯(lián)研究將該基因納入到候選基因中。以往針對(duì)SHMT1的研究主要集中在各類腫瘤和神經(jīng)管畸形等,即使有針對(duì)CHD的研究因涉及葉酸代謝途徑而將SHMT1基因納入研究范圍,也只是將常見(jiàn)的rs1979277 (C1420T)、rs12952556等幾個(gè)位點(diǎn)作為標(biāo)簽SNP[13-15]。本研究選擇了SHMT1啟動(dòng)子區(qū)的rs638416和rs117940726位點(diǎn)作為標(biāo)簽SNP,其中rs638416位點(diǎn)基因型為G/C,而rs117940726位點(diǎn)基因型為G/A。近年已有研究發(fā)現(xiàn)rs638416位點(diǎn)與某些疾病相關(guān),而尚未見(jiàn)rs117940726位點(diǎn)與疾病相關(guān)的報(bào)道。

本研究試圖通過(guò)探索dTMP從頭合成途徑的關(guān)鍵基因SHMT1與CHD的關(guān)聯(lián)性來(lái)闡述CHD的部分致病機(jī)制,利用山東人群樣本,以SHMT1基因啟動(dòng)子區(qū)rs638416和rs117940726為標(biāo)簽SNP位點(diǎn)進(jìn)行病例-對(duì)照關(guān)聯(lián)研究檢測(cè)這些多態(tài)位點(diǎn)是否具有CHD易感性,同時(shí)分析這些SNP位點(diǎn)是否影響SHMT1基因表達(dá)。

資 料 和 方 法

病例和對(duì)照樣本來(lái)源濟(jì)南軍區(qū)心血管專科醫(yī)院在2009年6月至2012年6月期間收集來(lái)自山東地區(qū)的CHD病例201例和對(duì)照192例,并進(jìn)行病理診斷。對(duì)照樣本和病例樣本年齡與性別盡量匹配,對(duì)照樣本無(wú)CHD家族史。201例CHD病例中包含129例間隔缺損類CHD。本研究符合倫理學(xué)各項(xiàng)規(guī)定,經(jīng)復(fù)旦大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),流行病調(diào)查資料收集及血樣采集均經(jīng)患兒監(jiān)護(hù)人的知情同意。

SHMT1基因啟動(dòng)子區(qū)2個(gè)SNP位點(diǎn)分型

DNA提取 取外周血3 mL置于EDTA抗凝管中,冰箱保存;采用德國(guó)Qiagen公司血液基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA的提取;抽提的DNA采用美國(guó)Thermo公司的Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度。

標(biāo)簽SNP選擇參考千人基因組中國(guó)北京人群數(shù)據(jù),挑選SHMT1起始密碼子上游啟動(dòng)子區(qū)2.5 kbp范圍內(nèi)MAF>10%的2個(gè)SNP位點(diǎn) (rs638416、rs117940726)納入本文研究范圍。

Sanger測(cè)序法分型針對(duì)兩個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物,引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。使用日本Takara公司的Taq酶、dNTP及反應(yīng)緩沖液,利用說(shuō)明書提供的標(biāo)準(zhǔn)體系和擴(kuò)增條件進(jìn)行PCR。使用美國(guó)ABI公司的Bigdye試劑盒及3730測(cè)序儀針對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)序反應(yīng)并檢測(cè)。測(cè)序結(jié)果用Seqman軟件讀取并進(jìn)行基因型統(tǒng)計(jì)。

雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

報(bào)告基因載體構(gòu)建使用美國(guó)Promega公司的PGL3 Basic質(zhì)粒構(gòu)建報(bào)告基因載體,利用標(biāo)準(zhǔn)的克隆步驟從基因組DNA中擴(kuò)增出包含rs638416位點(diǎn)的DNA序列 (1.5 kbp)并構(gòu)建到報(bào)告基因載體上。已構(gòu)建成功的報(bào)告基因rs638416位點(diǎn)為G基因型,通過(guò)G>C的定點(diǎn)突變構(gòu)建C基因型報(bào)告基因。

報(bào)告基因熒光信號(hào)檢測(cè)報(bào)告基因檢測(cè)基于293T細(xì)胞,按照標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)流程及美國(guó)Promega公司雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。以PGL3報(bào)告基因載體/pRL-TK內(nèi)參載體按10∶1的比例進(jìn)行細(xì)胞共轉(zhuǎn)染。利用美國(guó)Promega公司GloMax 96 微孔板發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)G/A基因型的PGL3載體報(bào)告基因表達(dá)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析通過(guò)χ2檢驗(yàn)計(jì)算正常對(duì)照的Hardy-Weinberg平衡 (HWE)的理論值。通過(guò)Haploview軟件對(duì)兩個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析。相對(duì)OR和95%CI在校正年齡和性別之后由非條件Logistic回歸模型計(jì)算獲得。利用在線工具SNPstats的Codominant、Dominant、Recessive、Overdominant以及Log-additive 5種模型對(duì)SNP進(jìn)行分析。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　　果

SHMT1基因啟動(dòng)子區(qū)SNP連鎖不平衡分析軟件計(jì)算結(jié)果顯示,rs638416和rs117940726之間SHMT1基因啟動(dòng)子區(qū)的2個(gè)SNP位點(diǎn)不存在強(qiáng)連鎖現(xiàn)象(圖1)。

圖1SHMT1基因啟動(dòng)子區(qū)SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡分析

Fig 1Linkage disequilibrium analysis of SNPs in the promoter region ofSHMT1

SHMT1基因啟動(dòng)子區(qū)單個(gè)位點(diǎn)SNP與CHD的關(guān)聯(lián)分析SHMT1基因啟動(dòng)子區(qū)2個(gè)SNP位點(diǎn)rs638416和rs117940726的各基因型在對(duì)照組和病例組中的分布情況如表1所示。HWE檢驗(yàn)結(jié)果顯示,在對(duì)照組中rs638416和rs117940726的χ2檢驗(yàn)P值分別為0.46和0.16,基因型分布符合遺傳平衡。在經(jīng)過(guò)年齡和性別因素校正后,根據(jù)遺傳學(xué)模型進(jìn)行Logistic回歸分析,AIC和BIC值越小說(shuō)明模型越精確。結(jié)果顯示:除了Overdominant模型外,其余4種模型中rs638416位點(diǎn)都與CHD顯著關(guān)聯(lián),且認(rèn)為L(zhǎng)og-additive模型最適用于分析該SNP位點(diǎn) (表2);而在5組模型中均未觀察到rs117940726位點(diǎn)與CHD的關(guān)聯(lián)性 (表3)。

雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 如圖2所示,rs638416位點(diǎn)的G等位基因與C等位基因的報(bào)告基因相比熒光強(qiáng)度比值下降了36% (P=0.013)。

討　　　論

為探索孕前補(bǔ)充葉酸干預(yù)CHD發(fā)生的機(jī)制,本研究選取葉酸代謝網(wǎng)絡(luò)中與dTMP合成相關(guān)的關(guān)鍵酶SHMT1作為研究對(duì)象,在山東人群中通過(guò)選擇SHMT1基因上游啟動(dòng)子區(qū)2個(gè)SNP進(jìn)行病例-對(duì)照研究。結(jié)果顯示rs638416位點(diǎn)與CHD有關(guān),且通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因分析確定rs638416位點(diǎn)的G等位基因能夠顯著降低啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄效率。本研究首次在人群中發(fā)現(xiàn)SHMT1與CHD的關(guān)聯(lián)性,研究結(jié)果為“dTMP合成受阻是CHD病因之一”的觀點(diǎn)提供了有力證據(jù)。

表1　在病例組和對(duì)照組中rs638416和rs117940726基因型的頻率分布

表2　rs638416位點(diǎn)基因型分布的統(tǒng)計(jì)分析

AIC:Akaike′s information criterion;BIC:Bayes information criterion.

表3　rs117940726位點(diǎn)基因型分布的統(tǒng)計(jì)分析

AIC:Akaike′s information criterion;BIC:Bayes information criterion.

SHMT1是一個(gè)dTMP合成通路上游的限速酶,一旦SHMT1被破壞,dTMP合成效率大為降低。在SHMT1純合敲除小鼠模型構(gòu)建的研究中發(fā)現(xiàn),雖有部分小鼠仍可無(wú)表型存活,但小鼠胚胎有較高的概率出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)管畸形表型,同時(shí)觀察到由于dTMP的相對(duì)缺乏導(dǎo)致dUMP混入基因組序列中,此外SHMT1純合敲除小鼠胚胎的體質(zhì)量顯著小于雜合敲除及野生型的胚胎[16]。小鼠模型顯示了dTMP合成途徑對(duì)于細(xì)胞乃至生物個(gè)體生長(zhǎng)具有非常重要的作用,尤其是在胚胎和器官發(fā)育的早期階段,然而在SHMT1敲除的小鼠中并未觀察到心臟發(fā)育異常明顯的表型,這也提示了人體心臟發(fā)育過(guò)程中可能對(duì)dTMP劑量需求更加敏感。

圖2rs638416位點(diǎn)C等位基因與G等位基因的熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果

Fig 2The luciferase reporter gene assays results of C allele and G allele of rs638416

本研究利用293T細(xì)胞驗(yàn)證rs638416位點(diǎn)對(duì)啟動(dòng)子效率的影響,而此前有研究在HepG2細(xì)胞中對(duì)rs638416位點(diǎn)開(kāi)展雙熒光素酶報(bào)告基因分析,兩項(xiàng)研究得出的結(jié)論一致,G位點(diǎn)均可以降低啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄效率[17]。我們推測(cè)rs638416位點(diǎn)所在區(qū)域可能是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn),rs638416位點(diǎn)的G等位基因可能會(huì)破壞這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力,從而降低啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄效率。此前查證的文獻(xiàn)中rs638416位點(diǎn)只與顳下頜關(guān)節(jié)紊亂、卵巢癌及肺癌的發(fā)生明確相關(guān)[18-20]。本研究解釋了rs638416位點(diǎn)的部分機(jī)制,作為功能性SNP位點(diǎn),其在今后有關(guān)葉酸代謝通路的研究中應(yīng)更受關(guān)注。

葉酸在人體內(nèi)的主要作用除了合成嘌呤及胸腺嘧啶外,同時(shí)也生成甲基化的S-腺苷甲硫氨酸。因此補(bǔ)充葉酸的作用主要是促進(jìn)嘌呤、胸腺嘧啶及S-腺苷甲硫氨酸的合成。本課題組此前進(jìn)行的一項(xiàng)針對(duì)合成胸腺嘧啶的關(guān)鍵基因TYMS多態(tài)性與CHD的關(guān)聯(lián)研究未發(fā)現(xiàn)TYMS與CHD有關(guān)聯(lián)性[10]。我們認(rèn)為前期研究結(jié)果與本研究結(jié)論并不矛盾:TYMS是從dUMP合成dTMP的唯一酶,因而在進(jìn)化角度上必須非常保守,影響酶活性的變異均可能被淘汰,該證據(jù)顯示了胸腺嘧啶合成通路的重要性。生物體演化出SHMT1及SHMT2這兩個(gè)同源酶來(lái)共同催化產(chǎn)生N5,N10-亞甲基四氫葉酸,此外四氫葉酸也可以被催化為N5,N10-亞甲基四氫葉酸,此種多重補(bǔ)償機(jī)制同樣體現(xiàn)了dTMP合成通路的重要性。我們推測(cè)在心臟發(fā)育早期,細(xì)胞增殖對(duì)N5,N10-亞甲基四氫葉酸劑量非常敏感,一旦N5,N10-亞甲基四氫葉酸劑量不足引發(fā)胸腺嘧啶合成受阻,很可能誘發(fā)CHD。

本研究結(jié)果在遺傳學(xué)的層面上揭示了葉酸對(duì)預(yù)防CHD的部分機(jī)制,而針對(duì)dTMP合成通路與CHD病的關(guān)系需要進(jìn)一步在不同人群中進(jìn)行驗(yàn)證并開(kāi)展相關(guān)功能研究,以完善對(duì)dTMP合成通路參與CHD發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

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E-mail:tjpns@126.com

Association of rs638416 in SHMT1 promoter and congenital heart diseases

JIANG Yu-chao1, KUANG Le-le1, WANG Hong-yan1, DUAN Wen-yuan3, CAI Chun-quan2△

(1DepartmentofGenetics,SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200433,China;2DepartmentofSurgery,Children′sHospital,Tianjing300074,China;3InstituteofCardiovascularDissease,GeneralHospitalofJinanMilitaryRegion,Jinan250031,China)

ObjectiveTo explore the association between single nucleotide polymorphism (SNPs) in the promoter region of cytoplasmic serine hydroxy methyl transferase (SHMT1) and congenital heart disease (CHD).MethodsWe performed a case-control study including 201 CHD patients and 192 control participants from Shandong province,China through Sanger sequencing of rs638416 and rs117940726.Then we conducted luciferase reporter gene assays to confirm if they were functional SNP.ResultsThese two SNPs were genotyped and they were in Hardy-Weinberg equilibrium both in control and case groups.The single locus analysis revealed the genotype distribution of rs638416 was significant different between case patients and control subjects (P=0.009).In the unconditional Logistic regression analysis,Log-additive model was the most suitable model to analysis rs638416,and in this model association data showed the most significant statistical different (OR=1.49,95%CI:1.11-2.01,P=0.007 4).The result of luciferase reporter gene assays also showed 36% transcription activity reduction (P=0.0013) of the promoter region containing G allele when compared to the promoter region containing G allele.ConclusionsWe confirmed rs638416 reduced the transcription activity ofSHMT1 and may involve with abnormal heart development.The G allele of rs638416 is a genetic risk factor of CHD in Shandong population.

congenital heart diseases;SHMT1;purine de novo synthesis;folic acid

Q39, R725.4

Adoi: 10.3969/j.issn.1672-8467.2016.04.008

2015-07-28;編輯:段佳)

天津市衛(wèi)生行業(yè)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目 (12KG116);天津市自然科學(xué)基金 (14JCYBJC25000)

*This work was supported by the Key Project of Tianjin Health Care Professionals (12KG116) and the Natural Science Foundation of Tianjin City,China (14JCYBJC25000).