孫博強(qiáng) 康巧珍 潘周浩 周苗 楊敏 劉鑫

（鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子免疫實(shí)驗(yàn)室 河南鄭州 45000）

DNCB誘導(dǎo)昆明小鼠特應(yīng)性皮炎模型的建立

孫博強(qiáng) 康巧珍 潘周浩 周苗 楊敏 劉鑫

（鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子免疫實(shí)驗(yàn)室 河南鄭州 45000）

目的 探索外用1-氯-2，4-二硝基苯（DNCB）經(jīng)皮膚致敏并激發(fā)昆明小鼠特應(yīng)性皮炎（Atopic Dermititis）模型的方法。方法 10只昆明小鼠隨機(jī)分成兩組（n=5）。用1% DNCB致敏及4% SDS+0.5% DNCB激發(fā)模型組小鼠，以丙酮、橄欖油混合溶液致敏并激發(fā)對(duì)照組小鼠，藥物作用部位均為雙側(cè)耳朵及背部皮膚。觀察小鼠耳朵厚度、組織病理學(xué)、免疫學(xué)指標(biāo)，評(píng)價(jià)皮炎損傷程度。結(jié)果 外用DNCB可以引起昆明小鼠明顯的特應(yīng)性皮炎樣皮損。模型組小鼠出現(xiàn)皮膚干燥、紅斑、水腫、糜爛，利用HE染色進(jìn)行組織病理分析，顯示表皮和真皮增厚、過(guò)度角質(zhì)化和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)論 先后外用1% DNCB和4% SDS+0.5% DNCB 重復(fù)刺激昆明小鼠可引起皮膚生理和病理的改變，與AD患者臨床表現(xiàn)基本一致，成功建立特應(yīng)性皮炎模型?？梢宰鳛檠芯?AD 病因及治療AD 的有效動(dòng)物模型。

特應(yīng)性皮炎 昆明鼠 DNCB 模型

特應(yīng)性皮炎（Atopic dermatitis， AD）是一種慢性復(fù)發(fā)皮膚疾病，這種疾病的發(fā)病率，特別是在發(fā)達(dá)國(guó)家正在快速增加。特應(yīng)性皮炎可能是被一些復(fù)雜的致病因素引起的，包括遺傳易感性、生活環(huán)境、皮膚屏障功能性紊亂、細(xì)菌感染和免疫學(xué)因素［1］。特應(yīng)性皮炎的主要癥狀表現(xiàn)為嚴(yán)重的搔抓行為、瘙癢癥、干皮癥和炎癥反應(yīng)，這些現(xiàn)象通常是被Th1和Th2免疫響應(yīng)所介導(dǎo)發(fā)生［2］。特應(yīng)性皮炎的發(fā)病機(jī)制中存在復(fù)雜的Th1和Th2免疫響應(yīng)關(guān)系，使得很難成功治療特應(yīng)性皮炎患者［3］。所以建立理想的特應(yīng)性皮炎模型將有助于對(duì)該疾病的深入研究。

目前，主要以1-氯-2，4-二硝基苯（1-chloro-2，4- dinitrobe nzene，DNCB）誘導(dǎo)Nc/Nga小鼠建立特應(yīng)性皮炎模型。本研究擬利用我國(guó)生物醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用最廣泛的昆明小鼠，采用DNCB刺激皮膚的方法，建立特應(yīng)性皮炎模型。成功的動(dòng)物模型的建立，有助于特應(yīng)性皮炎發(fā)病機(jī)理的研究并減輕對(duì)稀有鼠種Nc/Nga小鼠的依賴(lài)。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物

6周齡SPF級(jí)昆明小鼠購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將其放置在空調(diào)房間中適應(yīng)環(huán)境，房間溫度保持在23℃±3℃，濕度保持在50%±10%，12小時(shí)光照（08：00-20：00），12小時(shí)黑暗（20：00-08：00）交替，SPF級(jí)小鼠飼料和滅菌蒸餾水飼養(yǎng)，自由攝食。

1.1.2試劑與器材

DNCB購(gòu)自美國(guó)sigma公司。測(cè)厚規(guī)購(gòu)自上海陸川量具有限公司。DNCB溶解于丙酮/橄欖油（4：1）當(dāng)中，分別配置1%、0.5%的DNCB溶液。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1AD模型的建立

將10只小鼠隨機(jī)分成2組（n=5）。實(shí)驗(yàn)前一天剃光小鼠背部毛發(fā)，面積約為2cm2。對(duì)照組小鼠用丙酮/橄欖油（4：1）致敏并激發(fā)；實(shí)驗(yàn)組小鼠用DNCB溶液致敏并激發(fā)。實(shí)驗(yàn)前一天用電動(dòng)剃刀除去小鼠背部毛發(fā)。在0-2天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組用1% DNCB 100μL涂抹在小鼠的背部致敏，對(duì)照組用溶劑（丙酮/橄欖油=4：1）涂抹。在3-7天時(shí)，不對(duì)小鼠進(jìn)行任何處理。在8-16天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組先用 4% SDS處理小鼠背部和耳部，以去除皮膚和角質(zhì)層的屏障功能。干燥3小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組用0.5% DNCB激發(fā)，其中背部用100μL處理，耳部用25μL處理。對(duì)照組用溶劑涂抹。在實(shí)驗(yàn)17天時(shí)處死小鼠，見(jiàn)圖1。

1.2.2皮損嚴(yán)重程度

觀察各組小鼠皮損情況并拍照，并在8-16天時(shí)，每次刺激之前用測(cè)厚規(guī)測(cè)量小鼠耳廓部位厚度。

1.2.3皮膚病理觀察

處死小鼠后，耳部皮損組織用10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，切片，HE染色后顯微鏡下觀察組織病理改變，并測(cè)量皮膚表皮和真皮層厚度變化。

1.2.4數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的所有數(shù)據(jù)值均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表現(xiàn)，并使用配對(duì)雙尾t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（GraphPad Prism 5. 01）。P＜0.05時(shí)認(rèn)為有顯著性差異，P＜0.01時(shí)認(rèn)為有極顯著性差異。

2　結(jié)果

2.1皮損、變態(tài)反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)組外用DNCB第3天后，可見(jiàn)耳朵出現(xiàn)腫脹、紅斑，背部出現(xiàn)脫毛及抓痕，觸摸時(shí)有增厚、變硬的感覺(jué)。第17天時(shí)，在小鼠頸背部皮膚出現(xiàn)表皮剝脫、脫毛、結(jié)痂、紅斑、滲出、出血，雙側(cè)耳朵出現(xiàn)明顯腫脹、出血、結(jié)痂；對(duì)照組小鼠皮膚未發(fā)生無(wú)明顯改變，見(jiàn)圖2。

圖1　小鼠處理時(shí)間

圖2　小鼠對(duì)照組a和實(shí)驗(yàn)組b皮損、變態(tài)反應(yīng)

圖3　小鼠耳部厚度

圖4　小鼠病理組織切片（對(duì)照組耳部a1、實(shí)驗(yàn)組耳部a2、對(duì)照組背部b1、實(shí)驗(yàn)組背部b2）

圖5　小鼠病理組織切片（對(duì)照組耳部a1、背部b1，實(shí)驗(yàn)組耳部a2、背部b2）

2.2小鼠體重變化、耳朵厚度

在用DNCB激發(fā)時(shí)，實(shí)驗(yàn)組（1%DNCB）小鼠體重（23.30±2.54g）低于對(duì)照組（25.90±3.17g），但是沒(méi)有組間顯著性差異。在經(jīng)過(guò)DNCB激發(fā)后，平均小鼠耳朵厚度為 0.261±0.012mm，與對(duì)照組0.110±0.007 mm 相比差異極顯著，見(jiàn)圖3。

2.3組織病理分析

實(shí)驗(yàn)組耳部皮膚（見(jiàn)圖4a2）及背部（見(jiàn)圖4b2）皮膚同時(shí)出現(xiàn)皮膚角質(zhì)層遭到破壞，表皮層及真皮層明顯增厚，并伴隨血管擴(kuò)張、出血和大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。其中背部皮膚還可觀察到海綿水腫、棘層肥厚等現(xiàn)象。對(duì)照組小鼠的組織病理學(xué)觀察無(wú)明顯改變，見(jiàn)圖4 a1、圖4b1。

2.4皮膚表皮及真皮厚度變化

在最后一次經(jīng)過(guò) DNCB激發(fā)24h后，小鼠耳部表皮層平均厚度為40.32±5.27μm，與對(duì)照組11.85±2.02μm相比差異極顯著，見(jiàn)圖5 a1。小鼠耳部真皮層平均厚度118.90±36.10μm，與對(duì)照組45. 06±21.36μm相比差異極顯著，見(jiàn)圖5 a2。小鼠背部表皮層平均厚度為83.49±8.77μm，與對(duì)照組13.22±5.20μm相比差異極顯著，見(jiàn)圖5 b1。小鼠背部真皮層平均厚度為613.9±76.35μm，與對(duì)照組195.40±9.21μm相比差異極顯著，見(jiàn)圖5 b2。

3　討論

特應(yīng)性皮炎（Atopic dermatitis，AD）又稱(chēng)遺傳性過(guò)敏性皮炎。臨床上，病者皮膚先出現(xiàn)紅斑、水腫、濕疹，之后表面開(kāi)始變得干燥，最后皮膚苔蘚樣硬化。AD 的病因復(fù)雜，涉及遺傳、免疫、感染、環(huán)境、精神等多種因素，人們也從基因遺傳、免疫功能紊亂以及 Th1/Th2失衡等到角度探討其發(fā)病學(xué)機(jī)制，但至今尚未完全闡明［4］。

本研究應(yīng)用DNCB作為致敏劑反復(fù)刺激昆明小鼠誘發(fā)小鼠特應(yīng)性皮炎，以期獲得一種可以被廣泛使用，重現(xiàn)性強(qiáng)，周期短，成本低的特應(yīng)性皮炎動(dòng)物模型。通過(guò)觀察小鼠皮膚變化，測(cè)量耳厚，以及病理切片評(píng)價(jià)炎性程度，從而判斷模型是否制作成功。

在第4-12次重復(fù)外用0.5%DNCB過(guò)程中，可以很明顯看出昆明小鼠頸背部皮膚出現(xiàn)表皮剝脫、脫毛、結(jié)痂、紅斑、滲出、出血，雙側(cè)耳朵出現(xiàn)明顯腫脹、出血、結(jié)痂；組織HE染色顯示鏡下可見(jiàn)皮膚表皮層和真皮層明顯增厚，皮膚棘層肥厚、海綿水腫。以上結(jié)果顯示采用半抗原DNCB誘導(dǎo)與激發(fā)昆明小鼠，模型組小鼠皮損表現(xiàn)、組織病理學(xué)結(jié)果變化都與人類(lèi)特應(yīng)性皮炎類(lèi)似，提示我們AD小鼠模型建立成功，此模型為我們進(jìn)一步研究AD的發(fā)病機(jī)理及探索其治療手段提供了有效實(shí)驗(yàn)工具。

［1］ Kupper TS， Fuhlbrigge RC： Immune surveillance in the skin：mechanisms and clinical consequences. Nat Rev Immunol 2004， 4（3）：211-222.

［2］Bruynzeel-Koomen C， Wichen DF， Toonstra J， Berrens L，Bruynzeel PLB： The presence of IgE molecules on epidermal langerhans cells in patients with atopic dermatitis. Arch Dermatol Res 1986， 278（3）：199-205.

［3］Choi YY， Kim MH， Kim JH， Jung HS， Sohn Y， Choi YJ， et al. Schizonepeta tenuifolia inhibits the development of atopic dermatitis in mice. Phytotherapy research ： PTR. 2013；27（8）：1131-5.

［4］Lundberg R1， Clausen SK， Pang W，Gastrointestinal Microbiota and Local Inflammation during Oxazolone-induced Dermatitis in BALB/cA Mice. 2012；62（5）： 371-380.

Q5

A

1674-2060（2016）05-0012-02

國(guó)家自然科學(xué)基金（81373119，81571526）；河南省教育廳基金（16A180019）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（2015xjxm220）。

劉鑫。