陳棉，王玨，耿志敏，潘璐璐，金增游，賈連紅，盧家程，黃念念，褚茂平

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺州醫(yī)院　兒科，浙江　臺州　317000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院　心胸外科，浙江　溫州　325015；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院　兒科，浙江　溫州　325015；4.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院　兒童心臟中心，溫州醫(yī)科大學(xué)　心臟發(fā)育與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，浙江　溫州　325027）

·論著·

骨髓間充質(zhì)干細胞條件膜微粒對心臟成纖維細胞的影響

陳棉1，王玨2，耿志敏3，潘璐璐4，金增游3，賈連紅3，盧家程3，黃念念3，褚茂平4

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺州醫(yī)院兒科，浙江臺州317000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心胸外科，浙江溫州325015；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，浙江溫州325015；4.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院兒童心臟中心，溫州醫(yī)科大學(xué)心臟發(fā)育與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，浙江溫州325027）

目的：探討體外缺氧條件下骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）凋亡膜微粒（MSC-MPs）對心臟成纖維細胞（CFs）增殖、遷移和膠原合成的影響。方法：提取SD大鼠MSCs，在缺氧低營養(yǎng)條件下培養(yǎng)，收集上清液并提取MSC-MPs，用MSC-MPs刺激大鼠CFs，用CCK-8和劃痕實驗分別檢測CFs增殖和遷移，qRT-PCR檢測CFs中I型膠原、III型膠原、血管平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、波型蛋白和纖連蛋白的合成情況。結(jié)果：CFs被MSC-MPs刺激后，與對照組比較，其增殖能力明顯增加（P＜0.05），遷移能力無明顯變化（P＞0.05），I型膠原、III型膠原、波型蛋白和纖連蛋白合成增加（均P＜0.05）。結(jié)論：體外缺氧條件下MSC-MPs可促進CFs的增殖和膠原合成能力，而對CFs的遷移能力無明顯影響。

骨髓間充質(zhì)干細胞；膜微粒；心臟成纖維細胞；增殖；遷移；膠原合成

缺血性心臟病已成為危害人類健康的第一大殺手。研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs）可明顯改善心肌梗死后心功能，減小梗死面積［1］，但其作用機制仍不明確。研究發(fā)現(xiàn)MSCs移植到梗死心肌部位可分化為心肌樣細胞［2］，MSCs可旁分泌一些細胞因子影響心肌或血管的存活和再生［3］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，MSCs在體外模擬機體缺血缺氧環(huán)境的條件下可產(chǎn)生骨髓間充質(zhì)干細胞膜微粒（MSC-MPs），進而促進梗死心肌的血管再生［4］。本研究體外模擬機體缺血缺氧環(huán)境，觀察移植的MSC-MPs對心臟成纖維細胞（cardiac fibroblast，CFs）生物學(xué)性狀的影響，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物和試劑

1.1.1 實驗動物：雄性SD大鼠，4～6周齡（60～80 g）2只，出生3 d以內(nèi)的乳鼠20只，由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供［SCXK（浙）2010-0044號］。

1.1.2 主要試劑：IMDM培養(yǎng)基（Gibco公司），高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），胎牛血清（Gibco公司），胰酶（Sigma公司），Braford蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime-ScriptTMreagent kit（TaKaRa公司），6孔板、96孔板（美國Costar公司），熒光染料SYBR Green real time PCR master mix（TOYOBO公司），所有引物由TaKaRa公司設(shè)計合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 MSC-MPs的提取：取4～6周齡SD大鼠，頸椎脫臼處死后，提取股骨和脛骨骨髓腔中的干細胞，詳細方法見文獻［5］。第4代MSCs培養(yǎng)至80%融合時，改變培養(yǎng)條件為無血清、低氧（94% N2、5% CO2和1% O2），72 h后收集細胞培養(yǎng)的上清液，提取MSC-MPs，詳細方法見文獻［4］。采用Braford蛋白定量試劑盒測定MSC-MPs的濃度。

1.2.2 心臟成纖維細胞的提取及培養(yǎng)：取1～3 d新生SD大鼠（乳鼠），用75%乙醇淹沒消毒皮膚2次。無菌條件下用眼科剪開胸，剔出心臟，用眼科剪將心臟剪碎轉(zhuǎn)移至放有玻璃攪拌子的玻璃瓶中，加入配置的胰酶心肌細胞消化液10 mL，37 ℃水浴消化。收集后續(xù)的心臟組織消化懸液3～4管50 mL離心管后，1 000 r/min離心10 min，棄上清，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞。差速貼壁40～60 min。貼壁細胞為CFs，24 h后換液，培養(yǎng)并進行傳代，詳細方法見文獻［6］。取第2代細胞進行實驗。

1.2.3 分組方法：實驗分為對照組（無MSC-MPs）、低劑量組（2.5 μg/mL MSC-MPs）、中劑量組（5 μg/mL MSC-MPs）、高劑量組（10 μg/mL MSC-MPs）。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖能力：將對數(shù)生長期的CFs接種于96孔板，待細胞生長至70%融合時，加入膜微粒，12 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，避光保存于培養(yǎng)箱2 h后用酶標(biāo)儀檢測OD值，實驗重復(fù)3次。

1.2.5 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力：用記號筆在6孔板背后畫線，將對數(shù)生長期的CFs接種于6孔板，待細胞生長至70%融合時，垂直于背后的橫線劃痕，用PBS洗滌細胞去除劃下的細胞，加入MSCMPs，按0、6、12 h取樣，倒置顯微鏡下拍照，實驗重復(fù)3次。

1.2.6 qRT-PCR實驗檢測細胞膠原合成能力：將對數(shù)生長期的CFs接種于6孔板，待細胞生長至70%融合時，加入MSC-MPs，12 h后采用qRT-PCR的方法檢測CFs中I型膠原、III型膠原、α-SMA、波型蛋白和纖連蛋白的mRNA的表達情況。步驟如下，按Trizol說明書操作步驟提取CFs RNA，然后按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書轉(zhuǎn)錄成cDNA，再采用特異性引物擴增DNA，內(nèi)參照加入GAPDH引物進行擴增，引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸34 s，讀板，40個循環(huán)。具體操作均按說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料用±s表示，多個樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSC-MPs促進CFs增殖 CFs中加入MSC-MPs后，低、中和高劑量組的OD值均較對照組增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，P＜0.05），并且隨MSC-MPs濃度升高OD值有升高趨勢，見圖1。

2.2 MSC-MPs對CFs的遷移能力無影響 細胞劃痕實驗結(jié)果顯示各實驗組CFs遷移能力較對照組無明顯增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

2.3 MSC-MPs促進CFs的膠原合成 提取各組CFs的RNA，qRT-PCR結(jié)果顯示中劑量組和高劑量組的I型膠原、III型膠原、波形蛋白和纖連蛋白較對照組表達增加（P＜0.01或P＜0.05），而α-SMA無明顯增加，低劑量組的波型蛋白和纖連蛋白較對照組有所增加（P＜0.05），見圖3。

圖1 MSC-MPs促進CFs增殖

圖2 MSC-MPs對CFs遷移能力的影響（×200）

圖3 MSC-MPs促進CFs的膠原合成

3 討論

哺乳動物心臟中CFs和心肌細胞占主要部分［7］。成年哺乳動物心肌梗死后，心肌細胞幾乎無增殖能力，而此時CFs在維持正常的心臟功能方面發(fā)揮重要作用。CFs可與內(nèi)皮細胞之間進行信號傳遞［8］，促進血管新生，可遷移至心梗部位進行膠原的合成及沉積［9］，并表達可收縮蛋白，進而修復(fù)梗死組織。本課題組前期研究結(jié)果表明，MSCs凋亡后產(chǎn)生的MSC-MPs可促進血管新生，進而提高心肌梗死大鼠的心功能［4］，然而其作用機制研究仍不夠全面。本研究體外模擬機體缺血缺氧環(huán)境，發(fā)現(xiàn)MSCs凋亡產(chǎn)生的MSC-MPs對CFs的生物學(xué)性狀產(chǎn)生重要影響。

心肌梗死后，CFs向梗死部位的定向遷移對損傷心肌的修復(fù)有重要作用，研究發(fā)現(xiàn)白三烯［10］、趨化因子如IL-1［11］和心肌營養(yǎng)素-1（cardiotrophin-1）［12］可促進CFs的定向遷移。在本實驗結(jié)果中，MSC-MPs對CFs的遷移能力無明顯影響。心肌梗死發(fā)生后早期，CFs在心梗區(qū)大量增殖，可在一定程度上修復(fù)損傷心肌。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)成纖維細胞生長因子-2、血管緊張素 II和血小板源生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）可以促進梗死部位CFs的增殖［13-15］，而MAPK通路對CFs增殖可產(chǎn)生抑制作用［15］。本研究發(fā)現(xiàn)MSC-MPs可促進CFs的增殖能力，所以我們推測在MSC-MPs中或許存在上述可以促進CFs增殖的物質(zhì)。

心梗早期CFs產(chǎn)生大量細胞外基質(zhì)蛋白（如膠原和纖連蛋白等）修復(fù)損傷心?。?6］，并且可通過產(chǎn)生MMPs及其抑制劑調(diào)節(jié)基質(zhì)蛋白的沉積和降解。目前對細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生及其調(diào)節(jié)機制仍不明確，主要發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子-β、纖維生長因子-2［17］和PDGF［15］可通過調(diào)節(jié)血管緊張素 II通路促進梗死部位CFs的膠原合成能力［18］，鹽皮質(zhì)激素受體信號通路［19］也可促進CFs的膠原合成。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在CFs中加入MSC-MPs 12 h時，CFs的I型膠原、III型膠原、波型蛋白和纖連蛋白表達增加，而對α-SMA的產(chǎn)生無明顯影響，MSC-MPs中的何種物質(zhì)促進CFs基質(zhì)蛋白的合成及其作用機制仍有待進一步研究?？傊?，本研究在一定程度上解釋了MSC-MPs改善心肌梗死后心功能的一些機制，并為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Effect of microparticles derived from bone marrow mesenchymal stem cells on cardiac fibroblasts

CHEN Mian1， WANG Jue2， GENG Zhimin3， PAN Lulu4， JIN Zengyou3， JIA Lianhong3， LU Jiacheng3， HUANG Niannian3， CHU Maoping4. 1.Department of Paediatrics， Taizhou Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University， Taizhou， 317000； 2.Department of Cardio-Thoracic Surgery， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325015； 3.Department of Paediatrics， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325015； 4.Children’s Heart Center， the Second Affiliated Hospital & Yuying Children’s Hospital， Institute of Cardiovascular Development and Translational Medicine， Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325027

Objective: To study the effects of microparticles derived from bone marrow mesenchymal stem cells （MSC-MPs） on proliferation， migration and collagen synthesis of cardiac fibroblast. Methods: MSCs were obtained from SD mice and cultured under the condition of serum free in hypoxia. Then the conditioned media were collected and microparticles were then isolated from the media. MSC-MPs were used to treat cardiac fibroblast. CCK-8 assay and cell scratch method were used to detect the effect of MSC-MPs on proliferation and migration of cardiac fibroblast， seperately. The expression of collagens I and III， α-SMA， vimentin and fibronectin in cardiac fibroblast were measured by means of qRT-PCR. Results: The proliferation ability of cardiac fibroblast was enhanced after treated with MSC-MPs. The migration ability was not significantly affected. The expression of collagens I and III， vimentin and fibronectin in cardiac fibroblast were promoted. Conclusion: MSC-MPs can enhance the proliferation ability and collagen synthesis of cardiac fibroblast to improve the cardiac function.

bone marrow mesenchymal stem cells； microparticles； cardiac fibroblast； proliferation； migration；collagen synthesis

R331.31

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2016.09.001

2016-03-10

浙江省自然科學(xué)基金資助項目（LY14H020008）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2010KYA13）；浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（2010ZA089）；溫州市科技局科研基金資助項目（Y20130169）。作者簡介：陳棉（1982-），女，浙江黃巖人，主治醫(yī)師，在職碩士生。

褚茂平，主任醫(yī)師，Email：chmping@hotmail.com。