劉 勇，張 領(lǐng)，吳曉慶，衛(wèi)朝輝，王艷紅，王啟磾，高 迪，丁 彪，吳風(fēng)瑞，王 榮，李文雍

(阜陽師范學(xué)院 胚胎發(fā)育與生殖調(diào)節(jié)安徽省重點實驗室，安徽 阜陽 236037)

(Key Laboratory of Embryo Development and Reproductive Regulation of Anhui Province， Fuyang Teachers College， Fuyang 236037， China)

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熱應(yīng)激對豬卵母細胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性及染色質(zhì)構(gòu)型的影響

劉 勇，張 領(lǐng)，吳曉慶，衛(wèi)朝輝，王艷紅，王啟磾，高 迪，丁 彪，吳風(fēng)瑞，王 榮，李文雍

(阜陽師范學(xué)院 胚胎發(fā)育與生殖調(diào)節(jié)安徽省重點實驗室，安徽 阜陽 236037)

將屠宰場采集的豬卵巢分為熱應(yīng)激組和對照組，分別檢測兩組未成熟卵母細胞的各項指標。利用亮甲酚藍染色法研究葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性，對比分析熱應(yīng)激對細胞代謝活性的影響；利用Hoechst33342標記DNA區(qū)分染色質(zhì)構(gòu)型，對比分析熱應(yīng)激對細胞染色質(zhì)構(gòu)型的影響。結(jié)果表明：熱應(yīng)激組卵母細胞BCB+比例顯著低于對照組(P<0.05)。熱應(yīng)激組卵母細胞的各期染色質(zhì)構(gòu)型比例與對照組比例差異不顯著(P>0.05)。BCB+和BCB-組卵母細胞GV1-GV3染色質(zhì)構(gòu)型差異不顯著(P>0.05)，但對照組BCB+卵母細胞的GV4構(gòu)型比例明顯高于BCB-(P<0.05)，且GVBD差異不顯著(P>0.05)；而熱應(yīng)激組BCB+卵母細胞的GVBD比例明顯低于BCB-(P>0.05)，且GV4差異不顯著(P>0.05)。綜上，熱應(yīng)激對豬未成熟卵母細胞造成的損傷主要是影響了細胞的代謝活性，對細胞染色質(zhì)構(gòu)型的影響不大。

染色質(zhì)構(gòu)型；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；豬卵母細胞；熱應(yīng)激

(KeyLaboratoryofEmbryoDevelopmentandReproductiveRegulationofAnhuiProvince，F(xiàn)uyangTeachersCollege，F(xiàn)uyang236037，China)

養(yǎng)豬業(yè)是我國畜牧業(yè)的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一，養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展越來受到國家的重視。各種環(huán)境因素對豬的養(yǎng)殖造成的影響也越來越受到人們關(guān)注。熱應(yīng)激會給豬帶來應(yīng)激反應(yīng)，使豬機體代謝紊亂，內(nèi)分泌異常，繁殖機能降低，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1]，這是我國中部和南部養(yǎng)豬生產(chǎn)普遍面臨的一個問題。已有研究表明，熱應(yīng)激影響母豬的內(nèi)分泌活動、酶的活性改變、代謝過程發(fā)生紊亂，從而直接或間接地對卵子的發(fā)育產(chǎn)生不良影響，降低了母豬的生產(chǎn)和繁殖能力[2]，但熱應(yīng)激損傷未成熟卵母細胞的機理仍不清楚。

影響未成熟卵母細胞質(zhì)量的因素很多。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(Glucose-6-phosphatedehydrogenase， G6PD)是一種主要作用于機體新陳代謝和生長發(fā)育必不可少的酶，是戊糖磷酸途徑中的首個限速酶，主要作用是將葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槲焯牵瑸楹髞淼纳锓磻?yīng)提供原材料[3]，對維持胞質(zhì)中NADPH和細胞氧化還原平衡具有重要意義[4]。用亮甲酚藍(BCB)染色法可以篩選出更具有發(fā)育潛能高質(zhì)量的卵母細胞。喬利敏等[5]研究表明，用BCB法可以有效地篩選出發(fā)育活力高的牛卵母細胞。染色質(zhì)構(gòu)型是代表染色質(zhì)凝集程度和空間分布的指標，卵母細胞染色質(zhì)構(gòu)型可以反映未成熟卵母細胞成熟的能力[6]和支持胚胎發(fā)育的能力[7]。目前，已經(jīng)開展了關(guān)于人[8]，馬[9]，牛[10]，豬[11]，小鼠[12]等動物的GV染色質(zhì)構(gòu)型研究，尤其是小鼠相關(guān)研究，已經(jīng)證實小鼠染色質(zhì)構(gòu)型與基因轉(zhuǎn)錄表達相關(guān)[13]。Liu等[14]研究表明，豬未成熟卵母細胞染色質(zhì)構(gòu)型與DNA甲基化程度高度相關(guān)。Guo等[15]具體闡述了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNA-methyltransferase3A， DNMT3A)的自抑制作用以及組蛋白H3誘導(dǎo)DNMT3A激活的機制。

綜上所述，G6PD和染色質(zhì)構(gòu)型是反映未成熟卵母細胞質(zhì)量的重要指標。本試驗通過研究熱應(yīng)激對豬卵母細胞G6PD活性和染色質(zhì)構(gòu)型的影響，探討熱應(yīng)激對豬卵母細胞造成損傷的機理，為家畜繁殖等領(lǐng)域的研究和應(yīng)用提供新的思路和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1 主要儀器Leica DMI3000B倒置熒光顯微鏡，Nikon SMZ745體式顯微鏡，Leica DFC420C冷光CCD圖像采集系統(tǒng)，Thermo3111 CO2培養(yǎng)箱。

1.1.2 主要試劑10×D-PBS(Sigma， P5493)，Hoechst 33342(Sigma， B2261)，亮甲酚藍(Solarbio， B8820)，青霉素(哈藥集團)，硫酸鏈霉素(華北制藥)，生理鹽水(湖北科倫)。

1.2 研究對象及處理

本試驗采用的豬卵巢取自雨潤集團安徽省福潤肉類加工有限公司屠宰場，將卵巢放入盛有25 ℃滅菌生理鹽水(添加100 IU·mL-1青霉素和0.05 mg·mL-1硫酸鏈霉素)的保溫瓶中，2 h內(nèi)送至實驗室。清洗后的卵巢分為2組：將卵巢處于25 ℃含青霉素和硫酸鏈霉素的生理鹽水中常溫處理，記為25 ℃組(對照組)；將卵巢處于42 ℃含青霉素和硫酸鏈霉素的生理鹽水中熱應(yīng)激處理，記為42 ℃組(熱應(yīng)激組)。2組各處理1 h[16-17]。

1.3 卵母細胞的收集和分組

各處理1 h后，以游標卡尺測量卵泡直徑，選取直徑為2～6 mm卵泡的卵細胞，用10 mL注射器、18號針頭抽取卵泡內(nèi)容物，并集中于保溫的15 mL離心管內(nèi)暫存。200g離心2 min后，棄去上清，用D-PBS重懸沉淀并轉(zhuǎn)入35 mm培養(yǎng)皿，用自制口吸管在Nikon SMZ745體式顯微鏡下揀卵，分別記為25 ℃組和42 ℃組。

1.4 亮甲酚藍(BCB)染色卵母細胞

將收集到的兩組卵母細胞分別置于含有26 μmol·L-1BCB染液的24孔培養(yǎng)板中， 覆蓋液狀石蠟后放入5%CO2，100%濕度，38.5 ℃培養(yǎng)箱染色1 h，在Nikon SMZ745體式顯微鏡下，將細胞質(zhì)呈藍色的卵母細胞記為BCB+組，細胞質(zhì)不呈藍色的記為BCB-組(圖1)。由此可以分別得到：25 ℃組BCB+組、25 ℃組BCB-組、42 ℃組BCB+組和42 ℃組BCB-組。并用冷光CCD圖像采集系統(tǒng)采集圖像用于統(tǒng)計分析。

熱應(yīng)激前后BCB染色結(jié)果； A： 25 ℃組處理后染色結(jié)果； B： 42 ℃組處理后染色結(jié)果。 箭頭所指為BCB-， 其余為BCB+。 圖像放大倍數(shù)200×。圖1 豬卵母細胞熱應(yīng)激前后BCB染色結(jié)果Fig.1 Pig oocyte dyed by BCB before and after heat stress

1.5 卵母細胞染色質(zhì)構(gòu)型分組

將收集到經(jīng)過亮甲酚藍染色的4組卵母細胞，分別脫卵丘后置于含10 μg·mL-1Hoechst 33342的D-PBS中避光孵育10 min，然后，移到載玻片上，用蓋玻片輕壓。先在相差顯微鏡下觀察核仁和核膜的狀態(tài)，再用熒光顯微鏡，在紫外激發(fā)波長為220～360 nm下，觀察生發(fā)泡內(nèi)染色質(zhì)的分布。根據(jù)Sun等[18]對豬卵母細胞GV染色質(zhì)構(gòu)型的研究，將染色質(zhì)構(gòu)型分為：(1)GV1期，核膜完整，核仁完整，核仁由染色質(zhì)包圍，呈環(huán)狀或馬蹄型，有時核仁的一側(cè)附著一塊凝集的染色質(zhì)；(2)GV2期，構(gòu)型與GV1期相似，但是在生發(fā)泡內(nèi)有1～8個凝集的染色質(zhì)，主要分布在核膜附近；(3)GV3期，核膜和核仁依然明顯，但染色質(zhì)呈團塊狀或絲網(wǎng)狀，分布在整個生發(fā)泡內(nèi)；(4)GV4期，核膜模糊，核仁消失，在核仁處有凝集的染色質(zhì)或不規(guī)則的網(wǎng)狀染色質(zhì)；(5)GVBD期，核膜破裂，核仁消失，染色質(zhì)高度凝集。分別記錄各組卵母細胞染色質(zhì)構(gòu)型的分類情況。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每組試驗至少重復(fù)3次，每組不少于15枚卵母細胞，數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行卡方檢驗和成對t檢驗(P<0.05認為差異顯著)。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱應(yīng)激與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性的相關(guān)性

用SPSS卡方檢驗統(tǒng)計25 ℃組和42 ℃組中BCB染色的數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，25 ℃組BCB+的比例為(85.51±2.54)%，42 ℃組BCB+的比例為(17.62±1.55)%，結(jié)果中Pearson卡方sig值小于0.05，說明差異顯著。說明熱應(yīng)激前后，豬卵母細胞G6PD活性發(fā)生了變化。具體結(jié)果見圖2。

*表示25 ℃組和42 ℃組BCB染色結(jié)果差異顯著(P<0.05)。圖2 不同處理組BCB染色結(jié)果Fig.2 BCB dyeing results of different treatment groups

2.2 熱應(yīng)激與豬卵母細胞染色體構(gòu)型的相關(guān)性

對25和42 ℃下豬卵母細胞染色質(zhì)構(gòu)型變化的數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行卡方檢驗。結(jié)果表明， GV1在25和42 ℃處理組中所占比例均較高[(48.8±5.44)% VS. (47.51±7.62)%，P>0.05)]，而GV2，GV3和GV4在25和42 ℃處理組中所占比例比較低，均不滿20%?？ǚ綑z驗結(jié)果顯示，各組的P值均大于0.05，說明各組數(shù)據(jù)沒有顯著性差異，表明熱應(yīng)激對豬卵母細胞染

色體構(gòu)型沒有影響。如圖3，在25和42 ℃下，呈現(xiàn)的是不同染色體構(gòu)型的卵數(shù)占總卵數(shù)的比例差異。

因為各組BCB處理差異顯著，但是各組染色質(zhì)構(gòu)型之間均沒有差異顯著性，因此我們分析了這兩個指標的相關(guān)性。

圖3 不同處理染色質(zhì)構(gòu)型的結(jié)果Fig.3 Chromatin configuration under different treatments

表1 25和42 ℃處理后不同BCB染色結(jié)果后住卵母細胞染色質(zhì)構(gòu)型比例

Table 1 Chromatin configuration proportion of oocyte processed at 25 or 42 ℃

處理檢測卵數(shù)/枚GV1/%GV2/%GV3/%GV4/%GVBD/%25℃BCB+15333.92±8.59A7.59±2.007.23±2.3119.03±6.13a4.8±2.77BCB-5315.22±6.70A1.44±0.971.47±0.707.14±0.71b8.58±2.9042℃BCB+5917.58±4.00B2.85±1.601.95±1.579.11±5.005.69±2.27aBCB-9329.94±8.19B3.36±1.792.83±1.398.69±5.1317.99±5.46b

注：同列數(shù)據(jù)后沒有相同小寫字母表示相同溫度處理后BCB+與BCB-構(gòu)型比例差異顯著，無相同大寫字母表示不同溫度處理后的BCB+或BCB-之間差異顯著(P<0.05)。

25和42 ℃處理后BCB染色不同結(jié)果，利用成對t檢驗方法進行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果如表1所示。熱應(yīng)激處理前后GV1構(gòu)型卵中BCB+的比例由(33.92±8.59)%顯著降低至(17.58±4.00)%，BCB-的比例由(15.22±6.70)%顯著升高至(29.94±8.19)%。在25 ℃下，BCB+組卵母細胞的GV4比例顯著高于BCB-組(P<0.05)，其他各組染色質(zhì)構(gòu)型比例差異不顯著。在45 ℃下，BCB+和BCB-組卵母細胞的GV4比例差異不再顯著，而兩組GVBD比例差異顯著(P<0.05)。

綜上所述，熱應(yīng)激對葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性造成較大影響，而對GV染色質(zhì)構(gòu)型影響不大。處于GV1和GV4染色質(zhì)構(gòu)型的卵母細胞更容易受到熱應(yīng)激的影響而發(fā)生GVBD。

3 討論

本文通過對比熱應(yīng)激組和對照組卵母細胞的G6PD活性和染色質(zhì)構(gòu)型的變化，研究熱應(yīng)激對豬未成熟卵母細胞的主要影響是改變G6PD活性及染色質(zhì)構(gòu)型的比例，為應(yīng)激對生殖健康的影響提供了新的思路。把從屠宰場取回的卵巢，分別在42和25 ℃處理1 h，然后進行BCB染色1 h。結(jié)果表明，熱應(yīng)激組卵母細胞的BCB+比例達到(85.51±2.54)%，而25℃對照組未成熟卵細胞的BCB+比例僅有(17.62±1.55)%，差異顯著(P<0.05)。為什么熱應(yīng)激會對卵母細胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性造成差異呢？已有研究表明，G6PD可以調(diào)節(jié)NADPH，對細胞的生長具有重要作用[19]。而且缺乏G6PD的細胞對于氧化應(yīng)激非常敏感[20]，在代謝中產(chǎn)生和來源于外界的活性氧會對細胞產(chǎn)生傷害。Pandolfi 等[21]用G6PD基因敲除小鼠研究發(fā)現(xiàn)，其缺失會影響胚胎發(fā)育，產(chǎn)生的胚胎干細胞具有高度敏感的氧化應(yīng)激反應(yīng)。綜上，可以得出熱應(yīng)激可能通過降低G6PD活性的途徑，影響細胞內(nèi)新陳代謝平衡以及耐活性氧的能力。這些細胞質(zhì)內(nèi)酶類的損傷，可能是未成熟卵母細胞受到熱應(yīng)激傷害的主要原因。

試驗中觀察到豬的未成熟卵的染色質(zhì)構(gòu)型主要有4種表現(xiàn)形態(tài)，即GV1， GV2， GV3 ，GV4。實驗結(jié)果表明，熱應(yīng)激前后，豬卵母細胞的染色質(zhì)構(gòu)型比例并沒有發(fā)生顯著變化。大多數(shù)卵母細胞染色質(zhì)構(gòu)型仍處于GV1期。這可能是由于未成熟卵的狀態(tài)處于GV1的時候是處于生理的最佳狀態(tài)[21]。GV期未成熟卵母細胞染色質(zhì)的重構(gòu)主要受到DNA甲基化和組蛋白乙酰化的調(diào)控。經(jīng)劉勇等[22]和Endo等[23]的研究，在這個過程中染色質(zhì)發(fā)生凝集，經(jīng)過DNA甲基化和組蛋白乙酰化使某些基因轉(zhuǎn)錄活性降低，所以染色質(zhì)構(gòu)型的改變需要DNA去甲基化或者組蛋白去乙?；?。目前沒有研究表明，熱應(yīng)激會影響DNA甲基化或組蛋白乙酰化程度，也沒有研究表明短時間的處理對染色質(zhì)構(gòu)型有顯著影響。本研究短時間熱應(yīng)激處理結(jié)果表明，染色質(zhì)構(gòu)型沒有受到影響，這可能是由于短時間熱應(yīng)激不足以改變表觀遺傳模式和染色質(zhì)構(gòu)型。這說明短時間熱應(yīng)激對細胞核的功能沒有明顯影響。

從表1可以看出，GV1，GV2和GV3染色質(zhì)構(gòu)型在不同BCB染色分組卵母細胞中，所占比例也比較穩(wěn)定，這可能是由于他們?nèi)旧|(zhì)凝集，細胞核狀態(tài)相對穩(wěn)定[24]。但對GV1染色質(zhì)構(gòu)型的卵母細胞，熱應(yīng)激以后，BCB+比例顯著減少，BCB-比例顯著增加，因此認為熱應(yīng)激損傷了卵母細胞的G6PD酶活力。GV4處于GV向成熟或GV向凋亡轉(zhuǎn)換的過渡時期，各方面的生理狀態(tài)并不穩(wěn)定[25]，可能過渡時期細胞的生理狀態(tài)更容易受到熱應(yīng)激影響，導(dǎo)致了GV4構(gòu)型卵母細胞更容易受到熱應(yīng)激影響。

綜上所述，豬卵巢42 ℃熱應(yīng)激處理1 h，主要對豬未成熟卵母細胞的代謝活性產(chǎn)生影響，而對細胞的染色質(zhì)構(gòu)型沒有顯著影響。GV1和GV4染色質(zhì)構(gòu)型的豬未成熟卵母細胞，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性更容易受到熱應(yīng)激的影響。

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(責任編輯 盧福莊)

Effects of heat stress on glucose-6-phosphate dehydrogenase activity and the chromatin configuration in pig oocytes

LIU Yong， ZHANG Ling， WU Xiao-qing， WEI Zhao-hui， WANG Yan-hong， WANG Qi-di， GAO Di， DING Biao， WU Feng-rui， WANG Rong， LI Wen-yong*

Pig ovaries collected from the slaughterhouse were divided into heat stress group and control group. Immature oocytes were taken from ovaries in each group. Brilliant cresol blue staining method was used to study glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) activity of immature oocytes in each group. Hoechst 33342 was used to label DNA and distinguish the chromatin configuration. It was shown that the percentage of BCB+oocyte in heat stress group was significantly lower than that in control group(P<0.05). The proportions of chromatin configuration exhibited no significant differences between heat stress group and control group(P>0.05). The proportions of GV1 to GV3 had no significant difference between BCB+and BCB-oocytes(P>0.05). In the control group， the proportion of GV4 chromatin configuration was obviously higher in BCB+oocytes than that in BCB-ones(P<0.05)， but the proportion of GVBD had no significant difference(P>0.05). The proportion of GV4 chromatin configuration had no significant difference between BCB+and BCB-in the heat stress group(P>0.05)， but the proportion of GVBD was obviously lower in BCB+oocytes than that in BCB-(P<0.05). In conclusion， the heat stress affected the metabolic activity of porcine immature oocytes， but had little effects on chromatin configuration.

chromatin configuration; glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD); pig oocyte; heat stress

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.01.04

2015-05-18

國家自然科學(xué)基金(31201789，31372273)；安徽省自然科學(xué)基金項目(1508085QC59，1408085QC65)；安徽省省級學(xué)科建設(shè)重大項目(皖教秘科[2014]28號)；安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(AH201410371031)；省級科研機構(gòu)校級委托專項(2014PTFY04ZD)；阜陽師范學(xué)院學(xué)生科研立項資助的課題(fsyxsc201431)

劉勇(1980—)，男，黑龍江大慶人，博士，副教授，主要從事胚胎工程相關(guān)研究。E-mail：drliuyong@gmail.com

*通信作者，李文雍，E-mail：liwenyong@aliyun.com

S811.2

A

1004-1524(2016)01-0022-06

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(1):22-27

劉勇，張領(lǐng)，吳曉慶，等. 熱應(yīng)激對豬卵母細胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性及染色質(zhì)構(gòu)型的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，28(1):22-27.