王麗麗，葛金濤，劉興滿，趙統(tǒng)利

(連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 連云港 222000)

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葡萄miR164家族生物信息學(xué)分析及靶基因預(yù)測(cè)

王麗麗，葛金濤，劉興滿，趙統(tǒng)利*

(連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 連云港 222000)

MicroRNAs(miRNAs)對(duì)植物抗逆及生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程起著重要的調(diào)控作用，而miR164是植物特有的miRNA，它對(duì)應(yīng)的靶基因主要是NAC轉(zhuǎn)錄因子家族。采用生物信息學(xué)方法對(duì)葡萄以及其他幾個(gè)物種的miR164家族成員前體進(jìn)行進(jìn)化分析、前體二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、成熟序列堿基保守性分析以及在葡萄NAC轉(zhuǎn)錄因子家族71個(gè)成員中進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)分析。結(jié)果表明：葡萄miR164家族成員的前體序列與雙子葉植物聚在一個(gè)分支，符合進(jìn)化規(guī)律；葡萄miR164家族4個(gè)成員前體序列均可形成穩(wěn)定的二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，成熟序列的堿基保守性較高；葡萄miR164家族成員對(duì)應(yīng)的NAC家族靶基因有2個(gè)(GSVIVT01007982001與GSVIVT01020478001)，經(jīng)在NCBI進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)均與植物的根發(fā)育相關(guān)。這暗示著葡萄miR164家族與其靶基因在植物的抗逆過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

葡萄；miR164；靶基因；抗逆；生物信息學(xué)

微小RNA(MicroRNAs)是一類非編碼小分子RNA，在植物中主要通過(guò)介導(dǎo)靶基因降解對(duì)調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆過(guò)程發(fā)揮作用[1]。近年來(lái)的研究表明，miRNAs在植物響應(yīng)逆境脅迫過(guò)程中起著重要的作用[2]，如在毛竹(Phyllostachys edulis)中，miR397和miR1432的表達(dá)量均受不同脅迫條件的影響，如高溫(42℃)、低溫(4℃)、高鹽和干旱[3]；在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中過(guò)表達(dá)水稻(Oryza sativa)miR393會(huì)提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性[4]；同時(shí)在不同物種中，同樣的miRNA可能發(fā)揮不同的作用，如在擬南芥中過(guò)表達(dá)miR169時(shí)可降低植株的抗旱性，而相反，在番茄(Solanum lycopersicum)中過(guò)表達(dá)miR169會(huì)提高植株的抗旱性[5]。

葡萄(Vitis vinifera)是全球性果樹之一，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益，但目前其產(chǎn)量卻受到逆境脅迫的影響，因此提高葡萄抗逆性的研究越來(lái)越受到關(guān)注。目前對(duì)葡萄抗逆相關(guān)方面的研究?jī)H僅集中在生理指標(biāo)檢測(cè)及抗逆相關(guān)基因研究的層面上，而從非編碼基因miRNA方面對(duì)葡萄進(jìn)行的抗逆方面研究還未見報(bào)道。

miR164家族是植物特有的miRNA家族，在葡萄中存在4個(gè)家族成員，分別為vvi-miR164a，vvi-miR164b，vvi-miR164c以及vvi-miR164d；miR164主要靶基因是植物NAC轉(zhuǎn)錄因子，而植物NAC轉(zhuǎn)錄因子家族也同樣是植物特有的，其在N端約有150個(gè)氨基酸組成高度保守的結(jié)構(gòu)域(分為5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域A，B，C，D，E)[6]。NAC轉(zhuǎn)錄因子參與生物學(xué)過(guò)程較廣泛，包括細(xì)胞分裂、器官邊界、細(xì)胞次生壁合成等植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，同時(shí)也參與調(diào)控植物對(duì)鹽、干旱等非生物逆境脅迫的響應(yīng)過(guò)程[7]。以葡萄為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)葡萄miR164家族成員前體序列、成熟序列及靶基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期從非編碼基因方面為今后葡萄抗逆性研究提供新的參考。

1　材料與方法

1.1材料

利用數(shù)據(jù)庫(kù)miRbase 21.0(http://www.mirbase.org/index.shtml)[8]下載葡萄、番茄(Salynum lycopersicum)、蘋果(Malus domestic)、碧桃(Prunus persica)、煙草(Nicotiana tabacum)、水稻、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)的miR164家族成員前體序列和成熟序列；通過(guò)北京大學(xué)植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)(PlantTFDB∶http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php)[9]下載葡萄NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員序列(71條)；利用美國(guó)生物信息技術(shù)中心(NCBI:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行BLAST初步分析。

1.2方法

利用在線工具RNAfold WebServer(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)預(yù)測(cè)miRNA的前體二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)；利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建基于葡萄、蘋果、碧桃、水稻、二穗短柄草等miR164家族成員前體序列系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用在線平臺(tái)WebLOGO(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)[10]分析各物種的miRNA成熟序列的堿基保守性；通過(guò)在線平臺(tái)http://plantgrn.noble.org/psRNATarget[11]預(yù)測(cè)葡萄miR164的靶基因及其作用位點(diǎn)。

2　結(jié)果與分析

2.1系統(tǒng)發(fā)生樹

建立基于葡萄、蘋果等物種miR164家族成員前體序列進(jìn)化樹，結(jié)果表明，總體分為兩大分支(圖1)，葡萄miR164家族4個(gè)成員(圓形標(biāo)記)均與雙子葉植物聚類在一起，如蘋果、碧桃、煙草和番茄，而單子葉植物單獨(dú)聚類在一起，如二穗短柄草和水稻，均符合植物的進(jìn)化規(guī)律。但是同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，葡萄vvi-MIR164a和vvi-MIR164d與蘋果mdm-MIR164c和碧桃ppe-MIR164b聚類在一個(gè)分支，而葡萄vvi-MIR164b與蘋果mdm-MIR164a和碧桃ppe-MIR164d聚類在一個(gè)分支，葡萄vvi-MIR164c則相對(duì)與葡萄其他3個(gè)miR164家族成員進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。這種情況同時(shí)也出現(xiàn)于其他物種中，即來(lái)自同一物種家族不同成員被聚類于不同的分支，表明植物miRNA的前體序列具有比較豐富的多樣性。這與毛竹中miR397和miR1432前體序列進(jìn)化分析結(jié)果相類似[3]。

2.2前體二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

圖1　基于前體序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1　Phylogenetic tree based on the sequence of precursors

經(jīng)前體二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，葡萄miR164家族4個(gè)成員前體序列均可形成穩(wěn)定的二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，且葡萄miR164家族4個(gè)成員成熟序列均產(chǎn)生于各自對(duì)應(yīng)前體序列的5′端臂上(圖2)。

2.3成熟序列堿基保守性分析

在miR164的92個(gè)家族成員中，59個(gè)成員有著完全相同的成熟序列(5’-UGGAGAAGCAGGGCACGUGCA-3’，被認(rèn)為是miR164家族標(biāo)準(zhǔn)成熟序列)，其他的成員和標(biāo)準(zhǔn)成熟序列相比，分別都有1～5個(gè)堿基的差異[12]。葡萄miR164家族有4個(gè)成員，經(jīng)在線堿基保守型分析表明，葡萄與其他幾個(gè)物種的miR164家族成員成熟序列基本與標(biāo)準(zhǔn)序列堿基種類是一致的(圖3)，其中vvi-miR164a，vvi-miR164c和vvi-miR164d與家族標(biāo)準(zhǔn)序列堿基種類完全一致，只有vvi-miR164b僅在3′端最后一位堿基存在差異，即由A成為U。說(shuō)明葡萄miR164家族成員成熟序列堿基保守性較高。

2.4靶基因預(yù)測(cè)分析

經(jīng)靶基因在線預(yù)測(cè)，結(jié)果表明：葡萄miR164家族，4個(gè)成員在葡萄NAC基因庫(kù)中均有對(duì)應(yīng)的靶基因存在，且對(duì)應(yīng)的靶基因主要有2個(gè)，分別為GSVIVT01007982001和GSVIVT01020478001，與葡萄miR164家族成員成熟序列堿基幾乎完全匹配(圖4)；通過(guò)在NCBI中進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GSVIVT01007982001預(yù)測(cè)蛋白與蒺藜狀苜蓿(Medicago truncatula)中NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白相似性較高，研究表明其主要參與植物根瘤菌共生過(guò)程[13]；GSVIVT01020478001預(yù)測(cè)蛋白則與毛果楊(Populus trichocarpa)中NAC1蛋白相似性較高，而植物NAC1基因主要參與植物的側(cè)根生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，進(jìn)而影響植物的抗逆性[14]。因此，可推斷出葡萄miR164家族成員與其靶基因家族成員可能主要在植物根發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

3　結(jié)論與討論

自從Carrington等[15]2002年首次在擬南芥中克隆到miRNA后，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA不僅參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，在植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫，如干旱[15]，凍害[16]，高鹽[17]等的響應(yīng)過(guò)程中，也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。miR164家族是植物特有的miRNA家族，其與對(duì)應(yīng)靶基因之間的互作在植物器官形態(tài)建成以及響應(yīng)逆境脅迫過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用。

圖2　前體二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2　Secondary structure prediction of precursors

圖3　葡萄miR164家族成員成熟序列堿基保守性分析Fig.3　Conserved nucleotide sequence analysis of miR164 in Vitis vinifera

圖4　葡萄miR164家族成員與靶基因匹配序列Fig.4　Sequences matched with miR164 members in Vitis vinifera

本文主要利用生物信息學(xué)方法對(duì)葡萄miR164家族成員前體序列進(jìn)行進(jìn)化分析，并對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，同時(shí)對(duì)各個(gè)成員成熟序列的堿基保守性進(jìn)行分析，并在相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)71個(gè)NAC家族成員進(jìn)行了靶基因預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，葡萄miR164家族4個(gè)成員前體序列均可形成穩(wěn)定的頸環(huán)結(jié)構(gòu)，且其成熟序列基本均與miR164家族標(biāo)準(zhǔn)序列相一致，這與Sunkar等[18]在水稻中的研究結(jié)果相一致，即植物miR164家族成熟序列保守性很高；通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)，結(jié)果表明葡萄miR164家族成員主要對(duì)應(yīng)的靶基因有2個(gè)，分別為GSVIVT01007982001與GSVIVT01020478001，經(jīng)蛋白序列預(yù)測(cè)功能后，發(fā)現(xiàn)二者均與植物根發(fā)育相關(guān)，同時(shí)也影響植物的抗旱性，這個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)果與Li等[19]和Fang等[12]分別在玉米(Zea mays L.)和水稻中的研究結(jié)果相一致。

但是miRNA及其靶基因之間的調(diào)控是一個(gè)極為復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，二者之間可能存在一對(duì)多或者多對(duì)一的調(diào)控作用關(guān)系，既體現(xiàn)出其參與生物學(xué)過(guò)程的廣泛性，同時(shí)又體現(xiàn)出二者相互作用的精確性。在擬南芥中過(guò)表達(dá)miR164a和miR164b時(shí)導(dǎo)致植株子葉和花器官出現(xiàn)融合等現(xiàn)象[20]。ORE1/NAC2基因有促進(jìn)植物葉片衰老功能，其表達(dá)受到miR164的調(diào)控，同時(shí)miR164本身的表達(dá)又受EIN2基因表達(dá)的抑制，因此它們之間的相互作用關(guān)系形成了參與調(diào)控植物葉片衰老過(guò)程的重要調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[21]。另外miR164可降低NAC1的表達(dá)量，導(dǎo)致植物側(cè)根數(shù)目減少，同時(shí)二者的表達(dá)又受到生長(zhǎng)素的誘導(dǎo)，說(shuō)明miR164和其靶基因也可能參與到植物激素信號(hào)途徑調(diào)控中[22]。目前，對(duì)葡萄miR164家族更深入的研究尚未見報(bào)道，如除NAC轉(zhuǎn)錄因子家族外，葡萄miR164家族成員是否還有其他家族的靶基因成員；葡萄miR164家族成員對(duì)其靶基因的切割作用位點(diǎn)是否具有保守性，即是否和其他物種miR164家族成員一樣，作用位點(diǎn)位于miR164成熟序列的10～11位堿基之間(5′→3′)；葡萄miR164家族成員組織特異性表達(dá)與其他物種相比是否存在差異等，這些問(wèn)題仍有待進(jìn)一步研究。本文首次初步對(duì)葡萄miR164家族成員進(jìn)行了序列生物信息學(xué)分析以及對(duì)其靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，除上述問(wèn)題需進(jìn)一步研究外，仍需利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)miR164及其靶基因的功能與關(guān)系進(jìn)行深入探討，以期為今后葡萄抗逆新品種選育提供新的途徑。

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(責(zé)任編輯張韻)

Bioinformatics analysis of the MiR164 family and prediction of target gene in Vitis vinifera

WANG Li-li，GE Jin-tao，LIU Xing-man，ZHAO Tong-li*

(Lianyungang Academy of Agricultural Sciences，Lianyungang 222000，China)

MicroRNAs (miRNAs) play a very important role in regulating the stress resistance and growth development.MiR164 is specific in plants，whose target gene is mainly NAC transcription factor family.By utilizing the bioinformatic methods，we analyzed the phylogenetic of miR164 in Vitis vinifera and some other plants，predicted and analyzed the secondary structure of miR164 family members，the base conservation of the mature sequence，as well as the target gene in NAC (71 members) family of Vitis vinifera.The results showed that four members of miR164 in Vitis vinifera were clustered with the dicotyledon plants，which was accorded with evolution law.The precursors of four members could form stable secondary stem-loop structure.Otherwise，the base of mature sequence of four members were highly conserved.According to predicting and analyzing of the target gene，we found two NAC members (GSVIVT01007982001 and GSVIVT01020478001).By BLAST in NCBI，it showed that they were related with plant root development，which indicated that miR164 family and their target gene in Vitis vinifera play important regulatory role in root development and stress resistance.

Vitis vinifera;miR164;target gene;stress resistance;bioinformatics

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28(3):441-446http://www.zjnyxb.cn

王麗麗，葛金濤，劉興滿，等.葡萄miR164家族生物信息學(xué)分析及靶基因預(yù)測(cè)[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28(3)： 441-446.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.03.13

2015-08-17

蘇北科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(BN2014101)

王麗麗(1988—)女，山西長(zhǎng)治人，碩士，從事果樹及觀賞樹木育種研究。E-mail：wangllawj@163.com

，趙統(tǒng)利，E-mail：yyyy28@126.com

Q943.2

A

1004-1524(2016)03-0441-06