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17α-甲基睪酮對(duì)斑馬魚肝臟vtg基因mRNA表達(dá)的影響

2016-11-01 20:59:46劉少貞呂文琪呂小也
畜牧與飼料科學(xué) 2016年5期
關(guān)鍵詞:雄魚斑馬魚睪酮

劉少貞,呂文琪,呂小也

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山西 太谷 030801)

17α-甲基睪酮對(duì)斑馬魚肝臟vtg基因mRNA表達(dá)的影響

劉少貞,呂文琪,呂小也

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山西 太谷 030801)

為評(píng)價(jià)17α-甲基睪酮(17α-methyltestosterone,MT)對(duì)斑馬魚肝臟vtg基因mRNA表達(dá)的影響,利用MT處理斑馬魚雌、雄魚7 d,采用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)雌、雄魚肝臟中vtg基因mRNA的表達(dá)量。結(jié)果顯示,MT處理雌魚7 d,25 ng/L處理組肝臟vtg基因的表達(dá)量顯著降低(P<0.05),50 ng/L和100 ng/L的MT處理組肝臟vtg基因mRNA表達(dá)量極顯著降低 (P<0.01);MT處理雄魚7 d,25 ng/L處理組肝臟vtg基因mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比差異不顯著 (P>0.05),50 ng/L的MT處理組肝臟vtg基因mRNA表達(dá)量顯著升高 (P<0.05),100 ng/L的MT處理組肝臟vtg基因mRNA表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)。斑馬魚肝臟vtg基因?qū)T比較敏感,可以作為監(jiān)測(cè)環(huán)境中MT的生物標(biāo)志物。

17α-甲基睪酮;斑馬魚;肝臟;vtg

環(huán)境中的雄激素主要有3個(gè)來源:造紙廠生產(chǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生雄激素,隨著造紙廠污水的排放從而進(jìn)入環(huán)境中;污水處理廠會(huì)產(chǎn)生一定量的雄激素;農(nóng)業(yè)活動(dòng)中會(huì)有一定量的雄激素排放到環(huán)境中[1]。17α-甲基睪酮(17α-methyltestosterone,MT)是天然雄激素睪酮的17-α位甲基衍生物,也是一種重要的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。研究表明,MT能夠顯著降低底鱂雄魚體內(nèi)的睪酮(T)和11-酮基睪酮(11-KT)的含量,并能夠顯著提高底鱂雌魚卵巢中芳香化酶基因的表達(dá)[1]。雌魚對(duì)MT的敏感程度顯著高于雄魚[2]。MT在魚類體內(nèi)會(huì)被芳香化成 17α-甲雌二醇,從而發(fā)揮雌激素功能[3]。因此,暴露在含有MT環(huán)境中的雌魚,其卵巢中雌激素的分泌量會(huì)降低[4]。雄激素在體內(nèi)的作用機(jī)理尚未明確,但由雄激素受體AR介導(dǎo)的外源性激素作用途徑被多數(shù)學(xué)者認(rèn)可[5]。卵黃蛋白原(vitellogenin,VTG)是卵黃蛋白的前體,其生成是通過下丘腦—垂體—性腺(hypothalamicpituitary-gonadal,HPG)軸激活雌激素受體來實(shí)現(xiàn)的[6]。在雄魚和幼魚中,VTG的生產(chǎn)可以作為生物標(biāo)志物來檢測(cè)環(huán)境中的雌激素[7]。該研究利用MT暴露斑馬魚,采用qRT-PCR的方法檢測(cè)了肝臟vtg基因mRNA表達(dá)的變化情況,旨在為闡明MT在斑馬魚體內(nèi)的作用機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 斑馬魚成魚,購自山西省太谷縣東苑水族同一批繁殖的4月齡斑馬魚,在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)2周后進(jìn)行暴露試驗(yàn)。

1.2 主要儀器和藥品 17α-甲基睪酮(Sigma),Trizol Reagent、RACE 試 劑 盒 (Invitrogen),Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas),6×Loading Buffer、Taq DNA 聚合酶(Sigma),dNTP mix、DNA Marker Ladder (DL 2 000)、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)。

微量移液器(Eppendorf),VORTEX-6 漩渦混合器 (上海川翔生物科技有限公司),超低溫冰箱Fouma 700 SERIES(Thermo),紫外分光光度計(jì)(NanoPhotometer),冷凍低溫離心機(jī)(Pimor),PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad),實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.3 MT處理斑馬魚 斑馬魚成魚在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)暫養(yǎng)2周后進(jìn)行暴露試驗(yàn),MT暴露分為3個(gè)濃度處理組,分別為 25、50、100 ng/L,按 0.001%(V/V)的濃度分別溶解在無水乙醇中,對(duì)照組用0.001%(V/V)無水乙醇水溶液處理,MT暴露時(shí)間為7 d。每個(gè)試驗(yàn)組和對(duì)照組各15尾魚,雌、雄魚分開暴露。每天定時(shí)、定量飼喂飼料。試驗(yàn)組和對(duì)照組的8個(gè)魚缸中水的體積均為30 L,采用半靜水暴露方法[8],每天定時(shí)更換一半體積的水及相應(yīng)的暴露物質(zhì)。光照周期為 14 h/10 h(明/暗),水溫控制在(25±2)℃。

1.4 總RNA的提取、檢測(cè)和反轉(zhuǎn)錄 測(cè)量MT暴露后斑馬魚的生物學(xué)指標(biāo),然后進(jìn)行解剖,取其性腺和肝臟。應(yīng)用Trizol一步法進(jìn)行總RNA的提取,利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。反轉(zhuǎn)錄按照Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas,Canada)試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

1.5 qRT-PCR 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRTPCR)技術(shù)檢測(cè)雌、雄斑馬魚暴露MT 7 d后肝臟中vtg 基因的 mRNA 表達(dá)量[9]。

1.6 數(shù)據(jù)分析 采用 2-ΔΔCt對(duì)獲得的 qRT-PCR試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。試驗(yàn)結(jié)果以Mean±SD表示。運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件中的單因素方差分析 (Oneway ANOVA)和最小顯著差異法(LSD)進(jìn)行顯著性分析,P<0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著,P<0.01時(shí)認(rèn)為差異極顯著。

圖1 MT暴露7 d后斑馬魚肝臟vtg基因mRNA表達(dá)量的變化情況

2 結(jié)果與分析

該研究利用qRT-PCR方法檢測(cè)了斑馬魚雌、雄魚MT暴露7 d后,其肝臟中vtg基因mRNA的表達(dá)變化情況。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,25、50、100 ng/L的MT暴露7 d后,雌魚肝臟中vtg基因的mRNA 表達(dá)均被顯著抑制(P<0.05 或 P<0.01),尤其是50 ng/L的MT,其對(duì)雌魚肝臟中vtg基因mRNA的表達(dá)抑制作用最為顯著(P<0.01,見圖1A);對(duì)于斑馬魚雄魚,50 ng/L的MT暴露7 d后,雄魚肝臟vtg基因的 mRNA表達(dá)量顯著升高 (P<0.05),100 ng/L的MT暴露7 d后,雄魚肝臟vtg基因mRNA的表達(dá)量極顯著升高(P<0.01),而25 ng/L的MT暴露7 d后,雄魚肝臟vtg基因的mRNA表達(dá)未受到顯著影響(P>0.05,見圖 1B)。

3 討論

該試驗(yàn)研究了MT處理斑馬魚成魚7 d后雌、雄魚肝臟vtg基因mRNA表達(dá)量的變化情況,結(jié)果表明,利用50 ng/L或100 ng/L的MT處理7 d后,可引起斑馬魚雄魚肝臟中vtg基因mRNA的表達(dá)量顯著升高(P<0.05或 P<0.01),提示雄激素可能參與雄魚肝臟VTG的合成。研究表明,利用4.5 ng/L的MT暴露斑馬魚雄魚7 d后,其肝臟VTG的含量顯著升高[10]。 高濃度的 MT 暴露(0.2~200 μg/L)同樣可以使黑頭軟口鰷雄魚體內(nèi)的VTG含量顯著升高[3,11]。 有學(xué)者推測(cè),MT 之所以可以使魚類體內(nèi)的VTG含量升高,可能是由于MT被芳香化成了甲雌二醇(ME2),隨后,ME2作為雌激素通過肝臟中的雌激素受體使得vtg基因的表達(dá)升高[3]。在該研究中,利用25~100 ng/L的MT暴露7 d后,雌魚肝臟中vtg基因mRNA的表達(dá)量顯著下調(diào) (P<0.05或P<0.01),該結(jié)果與大多數(shù)已經(jīng)報(bào)道的相關(guān)研究結(jié)果一致。Seki等[12]將日本青鱂幼魚從孵化開始一直暴露于 MT(0.35~9.98 ng/L)中直至孵化后 60 d,結(jié)果表明,雌魚體內(nèi)的VTG水平受到顯著抑制。利用MT處理羅非魚雌魚后,其肝臟中vtg基因的mRNA表達(dá)水平和VTG的水平均下降[13]。斑馬魚幼魚暴露于100、260、500 ng/L的MT后,雌魚體內(nèi)的VTG含量顯著降低[14]。 Korsgaard[15]研究表明,100 ng/L的MT能夠顯著降低綿鳚雌魚體內(nèi)的VTG水平。但是,也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),利用MT(0.2 mg/L和2 mg/L)暴露黑頭軟口鰷雌魚21 d,其體內(nèi)VTG含量呈升高趨勢(shì)[11],推測(cè)這可能是由于種間差異造成的VTG/vtg對(duì)MT有不同的響應(yīng)。綜上所述,50 ng/L的MT對(duì)斑馬魚雌魚肝臟vtg基因mRNA的表達(dá)產(chǎn)生最為顯著的影響,可以作為檢測(cè)環(huán)境中MT的生物標(biāo)志物。

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Effect of 17α-methyltestosterone(MT)on mRNA Expression of vtg Gene in Liver of Brachydanio rerio

LIU Shao-zhen,Lü Wen-qi,Lü Xiao-ye
(College of Animal Science and Veterinary Medicine,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China)

This study aimed to evaluate the effect of 17α-methyltestosterone(MT) on mRNA expression of vtg gene in liver of Brachydanio rerio.The male and female Brachydanio rerio were treated with different concentrations of MT for 7 days,and qRTPCR assay were used to determine the mRNA expression of vtg gene in their livers.For female Brachydanio rerio,the mRNA expression of vtg gene in 25 ng/L MT treatment group was significantly reduced after 7 days (P<0.05),and that in 50 and 100 ng/L MT treatment group was extremely significantly reduced(P<0.01).For male Brachydanio rerio,there were no significant differences in the mRNA expression of vtg gene between 25 ng/L MT treatment group and control group after 7 days (P>0.05).However,the mRNA expression of vtg gene in 50 and 100 ng/L MT treatment groups was significantly and extremely significantly increased (P<0.05 and P<0.01),respectively.The results suggest that the vtg gene in liver of Brachydanio rerio is sensitive to MT,and it is potential to serve as a biomarker for MT monitoring in environment.

17α-methyltestosterone;Brachydanio rerio;liver;vtg

X171.5

A文章順序編號(hào):1672-5190(2016)05-0009-03

2016-05-03

項(xiàng)目來源:山西農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才博士科研啟動(dòng)費(fèi)項(xiàng)目(2014YJ08)。

劉少貞(1983—),女,講師,博士,主要研究方向?yàn)榄h(huán)境毒理學(xué)。

(責(zé)任編輯:趙俊利)

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