尹學(xué)哲，樸龍，金愛花，高峰，全吉淑，*

（1.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林延吉133000；2.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林延吉133002）

草蓯蓉提取物對(duì)小鼠H22肝癌移植瘤血管生成的抑制作用

尹學(xué)哲1，樸龍1，金愛花1，高峰2，全吉淑2，*

（1.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林延吉133000；2.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林延吉133002）

探討富含環(huán)烯醚萜苷的草蓯蓉提取物（IGBR）對(duì)H22小鼠移植瘤血管生成的抑制作用。建立H22肝癌皮下移植瘤模型，并用IGBR干預(yù)10 d。利用HE染色法觀察腫瘤組織病理學(xué)改變，利用免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)微血管密度（MVD），利用蛋白印跡法檢測(cè)腫瘤組織缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體（VEGFR）-2蛋白的表達(dá)。與模型組比較，IGBR組腫瘤細(xì)胞生長受抑，細(xì)胞數(shù)目較少，壞死程度較嚴(yán)重。與模型組比較，IGBR組腫瘤組織MVD顯著降低；HIF-1α、VEGF和VEGFR-2蛋白的表達(dá)顯著降低。提示IGBR對(duì)H22小鼠移植瘤新生血管生成具有抑制作用，可能與下調(diào)腫瘤組織HIF-1α和VEGF的蛋白表達(dá)有關(guān)。

草蓯蓉；環(huán)烯醚萜；H22；抗血管生成

草蓯蓉（Boschniakia rossica）為列當(dāng)科草蓯蓉屬多年生寄生性草本植物，寄生于樺木科榿木屬（東北榿木，又稱東北赤楊）的須根上，主要分布于我國東北長白山區(qū)，是國家二類保護(hù)植物[1]。草蓯蓉性味甘、酸、濕，全草入藥，治腎虛陽痿，腰膝冷痛，小便遺瀝，崩漏帶下，津枯便秘，膀胱炎及膀胱出血等證，在民間被譽(yù)為“不老草”[2]。近年的研究結(jié)果表明，草蓯蓉具有清除自由基和抗氧化作用，能抑制大鼠肝臟化學(xué)致癌過程[3-5]。環(huán)烯醚萜化合物是一類單萜化合物，是一些植物的自身防御物質(zhì)，具有多種生理活性[3-4]。我們前期研究證實(shí)，草蓯蓉環(huán)烯醚萜苷（iridoid glucosides from Boschniakia rossica，IGBR）對(duì)小鼠H22移植瘤具有明顯的抑制作用，可改善H22移植瘤小鼠的免疫抑制狀態(tài)，提高小鼠機(jī)體抗氧化能力[6-7]。本文通過小鼠H22肝癌移植瘤模型，觀察IGBR對(duì)腫瘤組織內(nèi)微血管密度（MVD）以及血管生成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，旨在對(duì)草蓯蓉抗腫瘤血管生成作用進(jìn)行探討。

1 材料

1.1 IGBR的制備

草蓯蓉全草干燥后，切碎，用乙醇提取，并減壓濃縮。加水溶解后，用二氯甲烷萃取，取其水層上MCI-gel CHP20P凝膠柱，用甲醇梯度洗脫，收集50%甲醇洗脫成分，冷凍干燥得IGBR，主要含草蓯蓉納拉苷（49.1%）和7-脫氧表馬錢子酸（30.3%）[6-7]。

1.2 細(xì)胞和動(dòng)物

小鼠H22肝癌細(xì)胞由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院韓春姬教授惠贈(zèng)。昆明小鼠[體重（20±2）g]由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 試劑

5-氟尿嘧啶（5-Fu）為上海旭東海普藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；兔CD34單克隆抗體為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；兔VEGF多克隆抗體為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品；兔VEGFR-2單克隆抗體為美國Cell Signaling公司產(chǎn)品；小鼠HIF-1α單克隆抗體為美國Abcam公司產(chǎn)品；二抗（羊抗小鼠IgG-HRP）為南京凱基生物有限公司產(chǎn)品；二抗（羊抗兔IgG-HRP）為南京凱基生物有限公司產(chǎn)品。

1.4 儀器

OLYMPUS倒置顯微鏡為日本奧林巴斯株式會(huì)社產(chǎn)品；小型垂直版電泳槽及Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽為美國伯樂公司產(chǎn)品；UVP凝膠成像分析儀為美國UVP公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 建立H22小鼠肝癌移植瘤模型及分組處理[6-7]

將H22肝癌細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇，以腹腔傳代形式在小鼠腹腔內(nèi)傳代。取第2代腹水調(diào)腫瘤細(xì)胞密度至1×107個(gè)/mL，將腫瘤細(xì)胞懸液0.2 mL接種到小鼠的右腋下[6-7]。第2天將小鼠分成模型組、IGBR高、中、低劑量組和5-Fu組，每組10只。IGBR高、中、低劑量組分別按 400、200、100mg/kg體質(zhì)量，每日灌胃 1次，連續(xù) 10d；5-Fu組按25 mg/kg體質(zhì)量，隔日腹腔注射1次；模型組則每日等容積0.9%氯化鈉溶液灌胃1次。第10天末次給藥16 h后，處死動(dòng)物，取出腫瘤組織。

2.2 腫瘤組織病理學(xué)檢查

各組瘤體用中性福爾馬林固定24 h后，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色，在光鏡下觀察腫瘤組織病理學(xué)改變。

2.3 免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織MVD

CD34表達(dá)于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，以胞漿呈現(xiàn)棕黃色為陽性。按Weidner[8]方法計(jì)算腫瘤組織MVD，即，在低倍鏡下尋找“熱點(diǎn)”，觀察棕染的微血管密集區(qū)，然后在高倍鏡下選取3個(gè)視野計(jì)微血管數(shù)，取平均值[7-8]。

2.4 蛋白印跡法檢測(cè)腫瘤組織HIF-1α、VEGF和VEGFR-2蛋白的表達(dá)

提取總蛋白，加熱變性后，進(jìn)行常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)膜。將PVDC膜用脫脂奶粉封閉，在4℃加一抗孵育過夜，加二抗繼續(xù)孵育2 h，ECL顯色，并在成像分析儀中采集圖像并進(jìn)行相對(duì)灰度比值分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果與分析

3.1 腫瘤組織形態(tài)學(xué)觀察

模型組瘤體較大，表面淡紅，質(zhì)地較軟，與周圍組織分界較清楚，剖面滲血較多。IGBR組和5-Fu組腫瘤組織邊緣區(qū)毛細(xì)血管明顯減少腫瘤瘤體較小，表面灰白，質(zhì)地較韌，剖面灰白，中央?yún)^(qū)可見壞死，切面滲血較少。

3.2 腫瘤組織HE染色結(jié)果

腫瘤組織病理學(xué)觀察結(jié)果（HE×200）見圖1。

圖1 腫瘤組織病理學(xué)觀察結(jié)果（HE×200）Fig.1 Pathological observation of tumor tissues（HE×200）

模型組腫瘤細(xì)胞較為完整，排列緊密，細(xì)胞體積大，核漿比例增大，間質(zhì)稀少；細(xì)胞大小不均，異質(zhì)性較高；毛細(xì)血管豐富，以腫瘤邊緣明顯。IGBR組和5-Fu組腫瘤細(xì)胞數(shù)目較少，細(xì)胞間隙增大，界限清楚，毛細(xì)血管減少，中央?yún)^(qū)可見壞死。

3.3 免疫組化檢測(cè)腫瘤組織MVD結(jié)果

腫瘤組織CD34免疫組化結(jié)果（×100）見圖2。IGBR對(duì)腫瘤組織MVD的影響見表1。

CD34陽性顆粒主要定位于毛細(xì)血管、小靜脈和小動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞膜和胞質(zhì)。結(jié)果顯示，模型組小鼠腫瘤組織微血管大量增生，而IGBR組和5-Fu組腫瘤邊緣區(qū)MVD與模型組比較顯著減少（P<0.05）。

圖2 腫瘤組織CD34免疫組化結(jié)果（×100）Fig.2 Immunohistochemical staining of CD34 in tumor tissues（×100）

表1 IGBR對(duì)腫瘤組織MVD的影響Table 1 Effect of IGBR on MVD of tumor tissues

3.4 蛋白印跡法檢測(cè)腫瘤組織HIF-1α、VEGF、VEGFR-2蛋白的表達(dá)

腫瘤組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白的表達(dá)見圖3。

圖3 腫瘤組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of HIF-1α,VEGF and VEGFR2 proteins in tumor tissues

VEGF是目前已知的最主要最直接的血管生成因子，與主要受體VEGFR2結(jié)合后，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)新生血管形成；而HIF-1α則參與包括VEGF在內(nèi)的多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[9-11]。免疫印跡結(jié)果顯示，與模型組比較，IGBR組和5-Fu組血管生成調(diào)控因子HIF-1α、VEGF和VEGFR-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。

4 結(jié)論

草蓯蓉為傳統(tǒng)中藥，其抗腫瘤研究已有一定積累[5-7]。汪霞等[4]報(bào)道IGBR可降低肝癌前病變大鼠血清標(biāo)志酶活性，升高血清抗氧化酶活力。我們的前期工作已證實(shí)，IGBR抑制小鼠H22移植瘤生長，改善荷瘤小鼠的免疫抑制狀態(tài)[6-7]。本研究HE染色結(jié)果也顯示，IGBR治療使腫瘤細(xì)胞生長受抑，排列較疏松，瘤細(xì)胞異質(zhì)性降低，浸潤程度減輕，壞死嚴(yán)重。

本實(shí)驗(yàn)利用小鼠H22移植瘤模型觀察IGBR對(duì)荷瘤小鼠腫瘤新生血管的抑制作用。腫瘤新生血管形成是腫瘤細(xì)胞的持續(xù)生長及轉(zhuǎn)移的必備條件[9-11]。新生血管的生成不僅為腫瘤生長提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，而且在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮著重要作用。因此，抗腫瘤血管生成治療是很有前景的腫瘤治療策略[9-11]。MVD是目前用以衡量腫瘤新生血管程度的有效指標(biāo)，腫瘤組織中MVD的增高預(yù)示瘤體增長速度加快、轉(zhuǎn)移可能性增大[6，11]。本研究結(jié)果顯示，IGBR降低實(shí)體瘤組織的MVD，抑制腫瘤新生血管生成。VEGF是目前已知的最主要最直接的血管生成因子[10-11]。它有4種異構(gòu)體，即 VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206，其中VEGF165是主要效應(yīng)分子[6]。而VEGF主要受體VEGFR-1、2和3中，VEGFR-2主要表達(dá)在生長期的血管內(nèi)皮細(xì)胞上，是VEGF發(fā)揮血管生成功能的主要受體，兩者結(jié)合后通過一系列的調(diào)節(jié)機(jī)制，啟動(dòng)血管生成促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)新生血管形成，增加血管的通透性，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長、滲出及轉(zhuǎn)移[6]。而HIF-1α則參與包括VEGF在內(nèi)的多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，它可通過多種途徑上調(diào)VEGF的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤新生血管的形成[10-11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IGBR下調(diào)腫瘤組織中HIF-1α、VEGF和VEGFR-2蛋白的表達(dá)，提示，IGBR可能是通過抑制HIF-lα的表達(dá)使其下游的VEGF表達(dá)下降，從而抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖以及血管形成，進(jìn)而使VEGFR-2蛋白表達(dá)得到負(fù)反饋減弱。綜上所述，IGBR可通過抑制腫瘤新生血管生成而抑制小鼠H22移植瘤生長。

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Anti-angiogenic Effect of Iridoid Glucosides from Boschniakia rossica in H22-bearing Mice

YIN Xue-zhe1，PIAO Long1，JIN Ai-hua1，GAO Feng2，QUAN Ji-shu2，*
（1.Yanbian University Hospital，Yanji 133000，Jilin，China；2.Medical College，Yanbian University,Yanji 133002，Jilin，China）

To investigate the anti-angiogenic effect of Boschniakia rossica extract mainly consisted of iridoid glucoside（IGBR）in H22-bearing mice,mice bearing H22hepatoma cells were established and treated with IGBR for 10 days.The pathological changes were detected with HE staining，the microvessel densities（MVD）were detected using immunohistochemical assay，and the protein expression of hypoxia-inducible factor（HIF）-1α，vascular endothelial growth factor（VEGF）and vascular endothelial growth factor receptor（VEGFR）-2 was detected by western blot method.As compared with the model group，IGBR treatment reduced the cell proliferation，aggravated the necrosis of transplanted tumor tissues of H22hepatoma cells.In addition，the administration with IGBR decreased MVD of tumor tissue，and down-regulated the protein expression of HIF-1α，VEGF and VEGFR-2 in the transplanted tumor tissue.Taken together，IGBR could exhibit anti-angiogenic effect against H22hepatoma cells in mice，and its mechanism was probably related to down-regulation of HIF-1α and VEGF proteins.

Boschniakia rossica；iridoids；H22；anti-angiogenic

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.14.001

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160539；81360651)

尹學(xué)哲（1962—），男（朝鮮），教授，博士，主要研究方向：天然產(chǎn)物活性研究。

*通信作者

2015-07-06