楊椏楠，李彩燕，錢國英

浙江萬里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波　315000

研究報告

鱉源膠原蛋白提取純化及在生物材料中的應(yīng)用

楊椏楠，李彩燕，錢國英

浙江萬里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波315000

楊椏楠，李彩燕，錢國英. 鱉源膠原蛋白提取純化及在生物材料中的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報，2016，32（6）: 819-830.

Yang YN，Li CY，Qian GY. Isolation，purification of collagen from soft-shelled turtle calipash for application in biomaterial. Chin J Biotech，2016，32（6）: 819-830.

近年來，膠原蛋白因其良好的生物學(xué)性能在生物材料應(yīng)用中得到越來越多的關(guān)注，為了建立一種快速高效的鱉源膠原蛋白純化方法和探究其在生物材料中的應(yīng)用價值，首先用Van Gieson 染色法和苦味酸-天狼星紅染色法觀察裙邊膠原纖維組織結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)裙邊膠原纖維含量非常高且類型主要是Ⅰ型。采用不同截留分子量的透析袋對裙邊膠原蛋白粗提液進行直接透析純化，發(fā)現(xiàn)截留分子量為100 kDa的透析袋在透析48 h后對裙邊膠原蛋白的純化效果最好，SDS-PAGE檢驗顯示幾乎沒有雜帶。對裙邊膠原蛋白生物學(xué)性能包括吸水性、體外降解性進行考察，其吸水力和持水力分別高達12.06 g/g和98.21%，且在72 h后被完全降解；對裙邊膠原蛋白海綿的溶血性、皮膚致敏性、肝部創(chuàng)傷止血性、促創(chuàng)傷皮膚愈合性進行了研究，并和交聯(lián)膠原進行比較，發(fā)現(xiàn)裙邊膠原蛋白和交聯(lián)膠原均不會造成SD大鼠溶血和皮膚過敏，二者均具有良好的止血效果，且裙邊膠原蛋白能顯著縮短創(chuàng)傷皮膚愈合時間，具有良好的促創(chuàng)傷皮膚愈合性，而交聯(lián)膠原效果欠佳。本研究表明裙邊膠原蛋白表現(xiàn)出了優(yōu)良的生物學(xué)性能，在生物材料領(lǐng)域具有很大應(yīng)用價值。

中華鱉裙邊，膠原蛋白，純化，生物學(xué)性能，生物材料

Chinese Journal of Biotechnology

http://journals.im.ac.cn/cjbcn

June 25，2016，32（6）: 819-830

?2016 Chin J Biotech，All rights reserved

近年來，膠原蛋白因其良好的生物相容性在生物材料的應(yīng)用中得到越來越多的關(guān)注［1］，傳統(tǒng)提取膠原蛋白所使用的原料主要來自豬和牛等動物的皮膚等結(jié)締組織［2］。但由于瘋牛病、禽流感、口蹄疫等問題［3］，我國政府目前禁止進口所有以牛的組織為原料提取的膠原蛋白產(chǎn)品。與陸生動物相比，水產(chǎn)膠原蛋白在原料來源、安全性和產(chǎn)品成本等方面均具有很大的優(yōu)勢，因此，探索利用水產(chǎn)膠原替代現(xiàn)有傳統(tǒng)膠原蛋白產(chǎn)品在生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域中具有重要的科學(xué)意義和實用價值［4］。

目前人們已經(jīng)從海參［5］、鱘魚［6］等多種水產(chǎn)品中提取到了膠原蛋白，相關(guān)報道越來越多。但對于我國傳統(tǒng)的營養(yǎng)滋補佳品，本身就富含膠原蛋白的水產(chǎn)動物——中華鱉作為新型生物膠原蛋白來源的研究卻比較缺乏。鱉甲周圍的結(jié)締軟組織通常被稱為“裙邊”，膠原蛋白含量十分豐富，經(jīng)前期實驗表明，其干重含量超過70%，可以提供豐富的膠原蛋白來源。另外，膠原蛋白熱穩(wěn)定性是影響其在生物材料應(yīng)用中的重要因素，而鱉源膠原蛋白的熱穩(wěn)定性優(yōu)于其他水產(chǎn)膠原蛋白［7］。因此，中華鱉裙邊膠原蛋白由于其豐富易得的來源和優(yōu)良的熱穩(wěn)定性、安全性將在生物材料領(lǐng)域的開發(fā)和轉(zhuǎn)化具有更廣闊的前景，還具有重要的經(jīng)濟價值和社會意義。本研究通過分析中華鱉裙邊膠原纖維的組織結(jié)構(gòu)特點，闡明裙邊中膠原纖維的含量和類型，為裙邊膠原蛋白的提取和純化建立一定的基礎(chǔ)，并直接用透析袋純化建立了一種較為有效的純化方法，在對裙邊膠原蛋白的生物學(xué)性能包括吸水性、持水性、體外降解性、皮膚致敏性、止血作用、促創(chuàng)傷皮膚愈合作用等生物學(xué)性能進行研究之后發(fā)現(xiàn)中華鱉裙邊膠原蛋白是一種較優(yōu)良的生物材料基。

1　材料與方法

1.1材料與主要試劑

中華鱉 （購于寧波本地人工養(yǎng)殖場，體重約為500 g），SD大鼠 （雌雄不限，周齡10周左右，購于浙江省動物實驗中心），透析袋 （截留分子量25 kDa、50 kDa、100 kDa，Solarbio），醫(yī)用紗布敷料 （江西華強醫(yī)療器械有限公司），胃蛋白酶 （Sangon Biotech，1∶3 000）；多聚甲醛、石蠟、二甲苯、蘇木素、Van-Gieson染色劑、苦味酸、天狼星紅染液、無水乙醇、無水乙醚、草酸鉀、酚酞、戊二醛、檸檬酸鈉等均為分析純。

1.2主要儀器

XSP-13C偏光顯微鏡，上海長方光學(xué)儀器有限公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；YD-6D石蠟包埋機，上海泰益醫(yī)療儀器設(shè)備公司；165-8001垂直電泳儀，美國BIO-RAD；Gel DocTM凝膠成像儀，美國BIO-RAD；UV-1600紫外分光光度計，上海美譜達有限公司。

1.3裙邊膠原纖維組織結(jié)構(gòu)觀察

1.3.1Van-Gieson石蠟切片染色流程

1）取中華鱉裙邊組織大小0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，用4%多聚甲醛固定24 h；2）脫水、透明、浸蠟、包埋；3）石蠟切片，厚度6 μm；4）二甲苯脫蠟至水洗；5）蘇木素染色；6）自來水流水沖洗；7）Van-Gieson染色；8）各級濃度乙醇內(nèi)脫水；9）二甲苯透明、中性樹膠封片；10）光學(xué)顯微鏡下觀察拍照［8］。

1.3.2天狼星紅苦味酸石蠟切片染色流程

1）取中華鱉裙邊組織大小0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，用4%多聚甲醛固定24 h；2）脫水、透明、浸蠟、包埋；3）石蠟切片厚度6 μm；4）二甲苯脫蠟至水洗；5）置0.1%苦味酸天狼星紅染液中染色；6）自來水流水沖洗；7）蘇木素染色；8）各級濃度乙醇內(nèi)脫水；9）二甲苯透明、中性樹膠封片；10）偏振光顯微鏡下觀察拍照［9］。

1.4裙邊膠原蛋白的提取純化

取中華鱉裙邊打碎勻漿，冷凍干燥之后加入2.5% NaCl和0.1 mol/L NaOH 于4 ℃下放置24 h，以去除雜蛋白；再加入10%異丙醇溶液于4 ℃浸泡24 h，以去除脂肪；將已去雜的中華鱉裙邊置于0.5 mol/L乙酸中，料液比1∶25，添加胃蛋白酶濃度為2 mg/mL，4 ℃下提取24 h，得到裙邊膠原蛋白粗提液［10］；分別取相同體積裙邊膠原蛋白粗提液直接置于截留分子量為25 kDa、50 kDa、100 kDa的透析袋中，在4 ℃下透析24 h、48 h，透析液為純水，分別將透析過的裙邊膠原蛋白溶液冷凍干燥得到裙邊膠原蛋白海綿；用SDS-PAGE垂直電泳比較不同透析袋在不同透析時間對裙邊膠原蛋白粗提液的純化效果，膠濃度的選擇是分離膠8%，濃縮膠5%。

1.5吸水性與持水性

1.5.1吸水性

取定量的裙邊膠原蛋白海綿放置在裝有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，分別在2，10，20，30 min……取出兩種材料，稱其重量，觀察其重量的變化，直至穩(wěn)定［11］。吸水率按下式計算：

式中，W0為裙邊膠原蛋白海綿初重量；W1為裙邊膠原蛋白海綿和吸收水分的總重量。

1.5.2持水性

分別取1.5.1充分吸水的裙邊膠原蛋白海綿裝入離心管，2 000 r/min離心5 min，然后稱其質(zhì)量。觀察兩種材料重量的變化。持水率按下式計算：

式中，W3為離心后裙邊膠原蛋白和吸收水分的總重量；W2為離心前裙邊膠原蛋白和吸收水分的總重量。

1.6體外降解性

稱一定量的裙邊膠原蛋白海綿，加入膠原蛋白酶，在37 ℃水浴鍋中進行酶解，分別于4 h、8 h、12 h、24 h……準確吸取裙邊膠原蛋白海綿的降解液，用甲醛滴定法［12］測定水解液中游離氨基酸含量，直至降解完全。

式中，V是各個時間點消耗的0.05 mol/L氫氧化鈉體積數(shù)；Vm是指裙邊膠原蛋白海綿完全降解后消耗的0.05 mol/L氫氧化鈉體積數(shù)。

1.7交聯(lián)膠原的制備

取一定量的裙邊膠原蛋白海綿溶于0.5 mol/L乙酸配置成一定質(zhì)量濃度的裙邊膠原蛋白溶液，加入一定量的戊二醛溶液進行磁力攪拌充分混合，然后放置4 ℃下交聯(lián)消泡24 h，將交聯(lián)液倒在模具中放在-80 ℃下凍存24 h，最后進行冷凍干燥，即得交聯(lián)膠原海綿成品［13］。

1.8溶血試驗

取SD大鼠的鮮血8 mL，加入0.5 mL 4%檸檬酸鈉抗凝，加入10 mL生理鹽水稀釋。分別取一定量的裙邊膠原蛋白海綿和交聯(lián)膠原海綿放入10 mL生理鹽水中制備梯度濃度溶液2 g/L、4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L，陽性對照是蒸餾水，陰性對照組是生理鹽水；將各個試管均放在37 ℃水浴箱中水浴30 min，然后向試管中加入0.2 mL已稀釋的大鼠血液，輕輕混勻，再在37 ℃水浴箱中水浴60 min，取出上述所有試管進行低速離心 （1 000 r/min，5 min），吸取上清液，用紫外分光光度計在波長545 nm處測定吸光度，用生理鹽水調(diào)零，計算溶血率。

若溶血率小于或等于5%，則表明材料無溶血作用［14］。

1.9皮膚致敏性

將SD大鼠隨機分組，每組10只，分3組，乙醚麻醉，用脫毛膏對大鼠背部脊柱兩側(cè)對稱脫毛，并用70%酒精擦洗干凈，對稱暴露皮膚約2 cm×2 cm作為實驗及對照區(qū)域。取一定濃度的裙邊膠原蛋白溶液、交聯(lián)膠原溶液、生理鹽水充分浸潤面積為2 cm×2 cm的醫(yī)用紗布，將裙邊膠原蛋白組和生理鹽水組的紗布對稱貼敷在大鼠背部去毛皮膚上，并用紗布包裹包扎固定，同理交聯(lián)膠原組，6 h后將紗布取下，于12 h、24 h、48 h、72 h觀察大鼠去毛皮膚上是否有致敏現(xiàn)象產(chǎn)生［15］。

1.10止血性

將裙邊膠原蛋白海綿、交聯(lián)膠原海綿、紗布3種材料均剪成面積約為2 cm×2 cm。將SD大鼠隨機分組，分3組，每組10只。乙醚麻醉大鼠，用70%酒精對大鼠腹部擦拭消毒，用已消毒滅菌的手術(shù)刀和手術(shù)剪開腹，使大鼠肝臟呈現(xiàn)，用手術(shù)刀在大鼠肝臟上制造長約0.5 cm、深約2-3 mm的創(chuàng)面，當(dāng)有血液涌現(xiàn)后，使其自有出血5 s，然后迅速將材料敷壓于創(chuàng)面之上，觀察材料止血情況，同時秒表計時材料止血時間，并在止血后觀察創(chuàng)面是否還有出血現(xiàn)象［14-15］。

1.11促創(chuàng)傷皮膚愈合性

將裙邊膠原蛋白海綿、交聯(lián)膠原海綿、紗布3種材料均剪成面積約為2 cm×2 cm。將SD大鼠隨機分組，每組10只，分3組。乙醚麻醉SD大鼠，用脫毛膏對SD大鼠背部脫毛，裸露皮膚約2 cm×2 cm，用70%酒精對SD大鼠裸露皮膚擦拭消毒，用已消毒滅菌的手術(shù)刀去掉全皮約1.5 cm×1.5 cm，制作全皮層缺損動物模型［16-17］，將各組材料貼敷于已去皮部位，用紗布包扎固定，分別于術(shù)后3 d、7 d、14 d，對各組材料SD大鼠創(chuàng)傷皮膚愈合情況拍照記錄，并用軟件Image-Pro Plus Version6.0計算SD大鼠創(chuàng)傷皮膚面積［18-22］。

1.12數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS22.0軟件，計數(shù)單位用χ2檢驗或秩和t檢驗，記量單位用t檢驗，檢驗水準為P<0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1裙邊膠原纖維組織結(jié)構(gòu)

2.1.1Van-Gieson染色

中華鱉裙邊中膠原纖維Van-Gieson染色結(jié)果如圖1所示，根據(jù)Van-Gieson染色原理，膠原纖維呈紅色，肌原纖維呈黃色［8］。可見圖1中紅色纖維分布整個視野，未發(fā)現(xiàn)黃色的肌原纖維和其相連交叉，由此圖可直接看出中華鱉裙邊中膠原纖維含量非常高，這說明中華鱉裙邊中蛋白質(zhì)主要由膠原蛋白組成，肌蛋白含量非常低，不僅方便中華鱉膠原蛋白的提取及純化，還為中華鱉裙邊膠原蛋白的高含量提供有利的依據(jù)。

圖1　中華鱉裙邊Van-Gieson染色 (光鏡20×)Fig. 1　Van-Gieson staining of soft-shelled turtle calipash （Light microscope 20×）.

2.1.2天狼星紅苦味酸染色

圖2　中華鱉裙邊天狼星紅苦味酸染色 （左：光鏡20×；右：偏光鏡20×）Fig. 2　Sirius red staining of soft-shelled turtle calipash. Left: light microscope 20×； Right: polarizing microscope 20×.

由圖2看出中華鱉裙邊中膠原纖維在偏光鏡下緊密排列，顯示很強的雙折光性，且均為紅色，根據(jù)天狼星紅苦味酸染色原理得知中華鱉裙邊膠原纖維類型主要為Ⅰ型［9］，研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型膠原的免疫原性比Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅵ型等類型膠原都要低得多［23］，在生物醫(yī)藥材料中應(yīng)用最廣泛，這為中華鱉裙邊膠原蛋白作為生物醫(yī)藥材料基提供了有利的依據(jù)。

2.2裙邊膠原蛋白純化

由圖3膠原蛋白SDS-PAGE 圖譜中泳道1、3、5看出截留分子量100 kDa的透析袋相對于25 kDa、50 kDa透析袋純化效果最好，由泳道1與2、3與4、5與6各自對比發(fā)現(xiàn)透析48 h后的純化效果比24 h好，說明時間對透析純化效果也有一定的影響，綜合評價以上各個透析條件的純化效果，發(fā)現(xiàn)透析袋截留分子量為100 kDa的透析袋在對裙邊膠原蛋白粗提液透析48 h后的純化效果最好，可見，用透析袋直接對裙邊膠原蛋白粗提液進行純化不僅純化效果好，還可以省去膠原蛋白鹽析、透析除鹽等步驟，減少了工作量和縮短了試驗時間，操作簡單方便、經(jīng)濟。

圖3　透析純化效果SDS-PAGE檢驗Fig. 3　SDS-PAGE test for purification effect of dialysis （0 channel: calipash collagen extracted crudely；1 and 2 channels: calipash collagen dialyzed by 25 kDa MWCO for 24 h and 48 h，recpectively； 3 and 4 channels: calipash collagen dialyzed by 50 kDa MWCO for 24 h and 48 h，recpectively； 5 and 6 channels: calipash collagen dialyzed by 100 kDa MWCO for 24 h and 48 h，recpectively）.

并且可觀察到清晰的α1鏈和α2鏈，α1鏈分子量約為130 kDa，α2鏈分子量約為110 kDa；且α1鏈比α2鏈要粗，所以α1鏈比α2鏈濃度大，二者含量比例大約為2∶1，組成形式是［α1（I）］2α2（I），分子量約為350 kDa，可見裙邊膠原蛋白是典型的I型膠原蛋白，與文獻報道相符；同時可以看到γ鏈和β鏈，可見裙邊膠原蛋白在提取及純化過程中保持了較為完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。

2.3吸水性與持水性

由圖4所示，裙邊膠原蛋白海綿的吸水量隨著時間呈線性增長趨勢，達到充分吸水需要60 min，充分吸水量是12.06 g/g，在蒸餾水中浸潤2 min之后就能達到5.23 g/g的吸水量，說明裙邊膠原蛋白海綿具有快速吸水的能力且吸水量非常大，在將充分吸水的裙邊膠原蛋白離心之后稱重發(fā)現(xiàn)，持水率分別是98.21%，可見裙邊膠原蛋白持水能力非常強，不僅為裙邊膠原蛋白海綿在止血應(yīng)用中奠定了有力的物理基礎(chǔ)，還能為傷口愈合提供一定的水潤環(huán)境。

圖4　裙邊膠原蛋白海綿吸水性Fig. 4　Water absorption ability of calipash collagen sponge.

2.4體外降解性

由圖5所示，裙邊膠原蛋白海綿在體外是可降解的，其降解率隨著時間的延長逐漸增大，在72 h時達到100%降解，可降解性是膠原蛋白在生物醫(yī)學(xué)材料中應(yīng)用的重要指標，裙邊的降解率和底物濃度、酶添加量具有重要關(guān)系，膠原蛋白的降解率在其作為體外細胞培養(yǎng)支架和體內(nèi)植入材料時具有重要影響。體內(nèi)降解性具有更復(fù)雜的生物環(huán)境，其降解率很難控制，Zulkifli等［24］將膠原蛋白和Hec/Pva交聯(lián)之后發(fā)現(xiàn)膠原蛋白的降解速率降低了，而且在降解時間延長至12周后，復(fù)合支架的結(jié)構(gòu)也沒有發(fā)生變化，說明膠原蛋白在和其他高分子交聯(lián)之后降解速率減慢。

2.5溶血性

由肉眼觀察到陽性對照組即蒸餾水組變成紅色均一液體，而陰性對照組和實驗組均是上清液澄清，試管底部有大量的沉淀，說明在離心的過程中蒸餾水使紅細胞破裂，而陰性對照組和實驗組均保持了紅細胞的完整性，由表1可見各個濃度的裙邊膠原蛋白和交聯(lián)膠原溶血率均小于5%，兩組之間沒有顯著性差異（P>0.05），說明裙邊膠原蛋白和交聯(lián)膠原均不會造成大量溶血，且材料濃度也不會對溶血率造成較為明顯的影響，綜上說明裙邊膠原蛋白海綿和交聯(lián)膠原均具有良好的血液相容性，符合國家標準對材料溶血性的要求。

2.6皮膚致敏性

肉眼觀察到SD大鼠裸露背部皮膚在被浸有生理鹽水、膠原蛋白溶液、交聯(lián)膠原溶液的無菌醫(yī)用紗布貼敷3 h后均無紅斑、水腫過敏現(xiàn)象，而且在24 h、48 h、72 h時也均無紅斑或水腫現(xiàn)象，根據(jù)3種待測樣品對SD大鼠皮膚致敏結(jié)果記錄致敏反應(yīng)的分數(shù)如表2所示，膠原蛋白和交聯(lián)膠原在3 h、24 h、48 h、72 h的分數(shù)均為0，說明提取的中華鱉裙邊膠原蛋白和交聯(lián)蛋白均不會造成皮膚致敏，符合國家生物材料的致敏要求標準。

圖5　裙邊膠原蛋白體外降解性Fig. 5　Degradation of calipash collagen sponge in vitro.

表1　溶血率Table 1　Scoring of skin sensitization results

表2　皮膚致敏反應(yīng)結(jié)果記分Table 2　Scoring of skin sensitization results

圖6　不同材料止血時間比較Fig. 6　Comparison of different materials on hemostasis time.

2.7止血性

紗布組：肉眼觀察到紗布對于肝部創(chuàng)面沒有止血作用，在經(jīng)過多次紗布止血之后，在大約260 s （圖6）時才能使肝部創(chuàng)面流血情況有所減緩，但仍有少量血液流出，可見紗布對肝部創(chuàng)面沒有止血效果。

膠原蛋白組：肉眼觀察到膠原蛋白對于肝部創(chuàng)面止血效果非常好，在止血100 s （圖6）之后肝部創(chuàng)面不再有血液流出，相對于紗布組顯著性縮短止血時間 （P<0.05），而且能夠保持肝部的整潔和潤滑，呈現(xiàn)一個干凈的肝部創(chuàng)面，但是，膠原蛋白在止血之后發(fā)生了形變收縮，可能是由于新鮮血液的溫度 （37 ℃）高于膠原蛋白的熱變性溫度 （35.1 ℃）使其發(fā)生了變形收縮，可見膠原蛋白在未進行交聯(lián)改性的情況下，其熱穩(wěn)定性和機械性能較差，直接作為止血生物材料運用有一定的局限性。

交聯(lián)膠原組：肉眼觀察到交聯(lián)膠原蛋白對肝部創(chuàng)面止血效果也非常好，在止血62 s （圖6）之后肝部創(chuàng)面就不再有血液流出，不僅相對于紗布組具有顯著性提高 （P<0.01），相對于膠原蛋白組也顯著性縮短止血時間 （P<0.05），但是在使用交聯(lián)膠原止血之后，肝部呈現(xiàn)出干燥表面，可以通過調(diào)節(jié)膠原蛋白的交聯(lián)度來改善交聯(lián)膠原對肝部創(chuàng)面整潔度造成的影響；交聯(lián)膠原海綿和血液接觸的一面快速形成了血痂，這可能是因為膠原蛋白在經(jīng)過戊二醛交聯(lián)后形成更為緊密的結(jié)構(gòu)，在接觸到血液后能夠快速使血小板聚集，達到止血的效果，而且交聯(lián)膠原也沒有發(fā)生較大的形態(tài)變化，這是由于膠原蛋白在交聯(lián)之后其熱穩(wěn)定性得到了顯著的提高，可見膠原蛋白需要經(jīng)過交聯(lián)改性才能達到更好的止血效果。

2.8促進創(chuàng)傷愈合性

紗布組：肉眼觀察到SD大鼠術(shù)后3 d，創(chuàng)傷皮膚表面沒有發(fā)生過敏感染現(xiàn)象，且形成血痂，但沒有明顯愈合 （圖7），愈合率為15% （圖8）；SD大鼠術(shù)后7 d，創(chuàng)傷皮膚表面邊緣的基底細胞開始有細胞增生現(xiàn)象，且有明顯愈合現(xiàn)象，愈合率達到63%；SD大鼠術(shù)后14 d，創(chuàng)傷皮膚表面還有較少部分沒有愈合，愈合率達到90%，形成的新生皮膚上還有部分痂皮未脫落，而且毛發(fā)還未長出?？梢娦∈髣?chuàng)傷皮膚在自然狀態(tài)下也能愈合，但是愈合速度較慢。

膠原蛋白組：肉眼觀察到SD大鼠術(shù)后3 d，創(chuàng)傷皮膚表面沒有發(fā)生過敏感染現(xiàn)象 （圖7），且愈合率達到28% （圖8），相對于紗布組和交聯(lián)膠原組均顯著提高創(chuàng)傷愈合率 （P<0.05），而且能明顯看到創(chuàng)傷皮膚表面邊緣形成隆起狀，基底細胞開始有細胞增生現(xiàn)象；SD大鼠術(shù)后7 d，創(chuàng)傷皮膚幾乎達到完全愈合，表皮基本形成，且創(chuàng)傷皮膚周圍毛發(fā)也隨之生長出來，愈合率達到90%，相對于紗布組和交聯(lián)膠原組均顯著提高創(chuàng)傷愈合率 （P<0.01），而SD大鼠創(chuàng)面皮膚在自然生長狀態(tài)下愈合時，其愈合率在14 d才達到90%，可見膠原蛋白大大地促進了創(chuàng)傷皮膚的愈合，縮短了創(chuàng)傷愈合的時間，這可能是由于膠原蛋白不僅可以刺激細胞生長因子IGF-1和FGF-2的生成，還能為細胞的增生提供細胞支架的生長環(huán)境［25］；SD大鼠術(shù)后14 d，可以看到創(chuàng)傷皮膚表面完全愈合，愈合率達到100%，相對于紗布組和交聯(lián)膠原組均顯著提高創(chuàng)傷愈合率 （P<0.01）。

圖7　不同材料對SD大鼠創(chuàng)傷皮膚愈合作用的病理觀察比較Fig. 7　Pathological observation and comparison of different materials on skin wound healing in SD rats.

圖8　不同材料對SD大鼠創(chuàng)傷皮膚愈合率的比較Fig. 8　Comparison of different materials on skin wound healing rate in SD rats.

交聯(lián)膠原組：肉眼觀察到SD大鼠術(shù)后3 d、7 d、14 d后均沒有表現(xiàn)出愈合現(xiàn)象 （圖7），交聯(lián)膠原在創(chuàng)傷表面形成堅硬的血痂阻礙了新生皮膚的生長，而且其對創(chuàng)傷皮膚的粘附性很強，很難將其和創(chuàng)傷皮膚分離，這可能是因為膠原蛋白在經(jīng)過戊二醛交聯(lián)后形成更為緊密的結(jié)構(gòu)，在接觸到血液后能夠快速使血小板聚集，形成了血痂，所以抑制了皮膚細胞的增生。

3　討論

膠原蛋白的分離純化工藝是獲得高純度安全有效膠原材料的重要環(huán)節(jié)，本文通過利用透析袋對膠原蛋白粗提液直接進行透析純化，得到了一種高效、快捷、簡單易操作的純化方式，主要是利用膠原蛋白的大分子量特點，在用胃蛋白酶提取分離膠原蛋白時，不會造成膠原蛋白的分解，但會將其他類型的蛋白質(zhì)降解成小分子肽，透析袋可直接將小分子肽透析出去就可達到純化效果。本課題也嘗試運用超濾方法對膠原蛋白進行純化，但是純化效果不理想，因為膠原蛋白粘度非常大，在超濾過程中容易造成膠原蛋白快速粘附超濾膜，造成超濾膜的堵塞，影響純化效果，而透析是通過靜置使膠原蛋白分子自由運動透析，不會造成透析袋的截留孔堵塞。

本文對裙邊膠原蛋白及交聯(lián)膠原在生物材料中的應(yīng)用進行了初步探索，對它們的部分生物相容性進行了檢測，但對于以后的批量生產(chǎn)應(yīng)用還有許多工作要做，需嚴格按照ISO 10993對醫(yī)療器械生物學(xué)評價的規(guī)定對它們進行更全面的生物安全性檢測，如遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗［26］、細胞外毒性［27］、植入后局部反應(yīng)試驗［28］、全身毒性試驗［29］等。

近年來，膠原蛋白因其良好的止血效果在生物醫(yī)藥材料領(lǐng)域得到越來越多的關(guān)注，本文冷凍干燥獲得的裙邊膠原海綿具有強吸水力，這為其用于止血海綿材料提供了有力的物理基礎(chǔ)，而且不僅止血效果好，還能夠保持創(chuàng)面的整潔度及濕度，這為其運用于臨床提供了良好的基礎(chǔ)。但是在實驗過程中發(fā)現(xiàn)裙邊膠原蛋白遇到新鮮的大鼠血液發(fā)生了熱收縮的形態(tài)變化，這說明膠原蛋白直接用于止血還存在熱變性溫度不夠高的缺點，所以，裙邊膠原蛋白還不能夠直接作為止血海綿，需要進行交聯(lián)改性以增強其熱穩(wěn)定性和機械性能。本文獲得的交聯(lián)膠原不僅能夠快速吸收血液達到止血的效果，還能夠保持形態(tài)不發(fā)生變化，應(yīng)用于止血具有很好的效果。目前，我國市場已有的止血膠原海綿銷售，但這些膠原蛋白大多數(shù)都是從牛皮、牛肌腱、豬皮等陸生動物組織中提取的，我國對膠原蛋白的動物來源具有嚴格的規(guī)定，陸生來源的膠原蛋白具有更高的風(fēng)險，而鱉源膠原蛋白作為水產(chǎn)品生物安全性相對較高；而且對于陸生膠原海綿，在未進行交聯(lián)的情況下止血時也會發(fā)生收縮形變的現(xiàn)象，這也是各種來源膠原蛋白直接運用于止血海綿面臨的限制，所以膠原蛋白需要在交聯(lián)提高熱穩(wěn)定后運用于止血海綿效果更佳。此外，基于原料和營養(yǎng)價值的考慮，中華鱉裙邊來源豐富，從中取得膠原蛋白及其相關(guān)產(chǎn)品，還可以提高經(jīng)濟附加值。因此，功能優(yōu)良、安全性好且低廉易得是水產(chǎn)生物膠原蛋白的一大優(yōu)勢，其在生物材料領(lǐng)域的開發(fā)和轉(zhuǎn)化前景廣闊。

膠原蛋白不僅具有良好的止血效果，還具有促進創(chuàng)傷愈合的作用，這主要可能是由于膠原蛋白不僅為創(chuàng)傷皮膚細胞的生長提供了支架作用，還為其提供了生物活性分子，本文獲得的膠原海綿能顯著促進創(chuàng)傷皮膚快速愈合，而交聯(lián)膠原不僅沒有促進創(chuàng)傷愈合，相對于空白醫(yī)用紗布組，反而阻礙了創(chuàng)傷皮膚的愈合，這說明膠原蛋白在交聯(lián)之后可能失去了生物活性，不具備促進創(chuàng)傷愈合的作用。

本文通過對中華鱉裙邊膠原纖維組織結(jié)構(gòu)形態(tài)、膠原蛋白的分離純化及生物學(xué)性能的研究，得到了純度較高的膠原蛋白止血材料及創(chuàng)傷愈合敷料，為其在生物醫(yī)藥材料中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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（本文責(zé)編陳宏宇）

December 25，2015； Accepted: April 25，2016

Caiyan Li. Tel/Fax: +86-574-88222991； E-mail: licy82@163.com

Isolation, purification of collagen from soft-shelled turtle calipash for application in biomaterial

Ya’nan Yang, Caiyan Li, and Guoying Qian

College of Biological and Environmental Sciences，Zhejiang Wanli University，Ningbo 315000，Zhejiang，China

Recently，research on collagen attracts more interests due to its good biological compatibility. The present study attempted to establish a fast and efficient method to purify collagen from soft-shelled turtle and to explore its application in biological materials. The structure and type of collagen fiber in calipash were determined by van Gieson staining and Picrosirius red staining，which could contribute to the isolation of collagen from soft-shelled turtle Calipash（STCC）. Collagen fibers were in high content and the main collagen fiber was type I in STCC. The crude STCC solution was purified by dialysis with different cut-off molecular weight. SDS-PAGE demonstrated that the best purification was in applying 100 kDa dialysis bags after 48 h. The water absorbing capacity and holding capacity of STCC were up to 12.06 g/g and 98.21%，respectively. STCC can be degraded by collagenase in vitro entirely after 72 h. The hemolysis，skin sensitization，hemostatic and wound healing of STCC were determined by using SD rat model，and the collagen cross-linked by glutaric dialdehyde was set as a comparison. STCC and STCC cross-linked did not result in destructed red blood cell，inflamed and sensitized skin. Both materials exhibited good hemostatic effect. Thus，STCC improved the wound healing efficiently. This study implies a potential of STCC in the field of biomaterial.

soft-shelled turtle calipash，collagen，purification，biological properties，biomaterial

10.13345/j.cjb.150553

Supported by: State Oceanic Administration of China （No. 201405015），Research Project of Public Welfare Technology Application in Zhejiang Province （No. 2014C32072）.

國家海洋公益性行業(yè)科研專項 （No. 201405015），浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計劃項目 （No. 2014C32072）資助。