張建鋒

(英科新創(chuàng)/廈門(mén)科技有限公司，福建廈門(mén) 361022)

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·臨床研究·

磁微粒-吖啶酯化學(xué)發(fā)光游離甲狀腺素檢測(cè)試劑的研制及應(yīng)用

張建鋒

(英科新創(chuàng)/廈門(mén)科技有限公司，福建廈門(mén) 361022)

目的研制定量檢測(cè)游離甲狀腺素的化學(xué)發(fā)光免疫試劑。方法制備吖啶酯-T4結(jié)合物作為信號(hào)標(biāo)記物質(zhì)，制備鏈霉親和素-磁性微球作為固相載體，結(jié)合生物素標(biāo)記的甲狀腺素(T4)抗體，建立小分子競(jìng)爭(zhēng)法免疫分析體系，分析其靈敏度、準(zhǔn)確度和線(xiàn)性范圍等性能指標(biāo)。結(jié)果靈敏度為1.5 pmol/L，線(xiàn)性范圍2～75 pmol/L，批內(nèi)不精密度CV為5.62%～8.24%，批間不精密度CV為7.08%～9.82%，與T3和rT3無(wú)交叉反應(yīng)，37 ℃ 6 d后發(fā)光值降幅為10.7%～14.6%，檢測(cè)100例臨床血清標(biāo)本，測(cè)定結(jié)果與進(jìn)口試劑的相關(guān)性r值等于0.924 5。結(jié)論該試劑具有靈敏度高、線(xiàn)性范圍廣、穩(wěn)定性好、受環(huán)境影響小、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，可配套全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，應(yīng)用于臨床檢測(cè)。

游離甲狀腺素；化學(xué)發(fā)光；吖啶酯；磁性微球

甲狀腺素(T4)是甲狀腺濾泡細(xì)胞合成及分泌的激素。體內(nèi)游離的甲狀腺素(FT4)通過(guò)維持體溫及刺激熱量生成來(lái)調(diào)節(jié)正常生長(zhǎng)與發(fā)育，其含量與甲狀腺功能狀態(tài)密切有關(guān)。檢測(cè)FT4 水平并結(jié)合其他甲狀腺檢驗(yàn)和臨床表現(xiàn)，可對(duì)甲狀腺功能亢進(jìn)和甲狀腺功能減退作出診斷[1]。血清FT4檢測(cè)方法有平衡透析法、放射免疫測(cè)定法、酶免疫測(cè)定法、時(shí)間分辨熒光免疫法和化學(xué)發(fā)光免疫分析法等[2-6]。其中化學(xué)發(fā)光免疫分析法是最具發(fā)展前景的新型非放射性免疫標(biāo)記技術(shù)。本研究成功制備小分子-吖啶酯結(jié)合物，基于小分子物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)原理，研制定量檢測(cè)FT4的磁性微球-吖啶酯標(biāo)記-化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑。報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑LB960型化學(xué)發(fā)光讀數(shù)儀(Berthold公司)，2695-2696液相色譜儀(Waters公司)，DXI800全自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)(Beckman公司)。T4單抗、鏈霉親合素(SA)購(gòu)自羅氏公司；生物素、脫鹽柱購(gòu)自Thermo fisher公司；NSP-DMAE-NHS購(gòu)自上海邁拓崴公司； T4標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；T4純品、 BSA購(gòu)自Sigma公司，臨床標(biāo)本來(lái)自福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院。其他試劑均購(gòu)自阿拉丁試劑公司。

1.2試劑組分制備

1.2.1SA磁性微球制備按照摩爾比2∶1稱(chēng)取適量氯化鐵和氯化亞鐵，在超純水中溶解混勻后加入氨水至終濃度為0.5%，60 ℃攪拌反應(yīng)4 h，所得磁性微球用超純水洗滌后，重新分散于50%乙醇中，再依次加入0.5%的PEG4000、0.1%的氨水和0.1%的正硅酸乙酯，60 ℃攪拌反應(yīng)16 h，獲得改性后的磁性微球用超純水和無(wú)水乙醇交替洗滌后，重懸于50%乙醇中，再分別加入0.05%的氨水、0.5%的四甲基氫氧化銨(TMA)和2.5%的3-氨丙基三甲氧基硅烷，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)16 h，即得表面修飾氨基的磁性微球。取適量該氨基磁性微球，用PBS緩沖液清洗并重懸，再加入0.1% TMA和2.5%的戊二醛，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)30 min，之后用碳酸緩沖液清洗并重懸，超聲分散后按20 μg/mg磁性微球加入SA，37 ℃攪拌反應(yīng)16 h，然后分別加入0.1%的谷氨酸和1%的BSA繼續(xù)反應(yīng)1 h， PBS緩沖液(含0.05%的tween-20)洗滌3次后，重懸于1% BSA中，超聲分散，即得SA磁性微球。

1.2.2生物素化抗體制備取適量Anti-T4單抗，pH 7.4的PBS緩沖液透析純化后，加入15倍(摩爾比)已活化的長(zhǎng)鏈磺化生物素Sulfo-NHS-LC-Biotin，2～8 ℃反應(yīng)2 h，再轉(zhuǎn)入室溫繼續(xù)反應(yīng)30 min，最后加入100倍(摩爾比)的賴(lài)氨酸反應(yīng)30 min，反應(yīng)液用脫鹽柱純化，加入等體積甘油和0.1% NaN3。

1.2.3吖啶酯-T4結(jié)合物制備稱(chēng)取T4純品適量，溶于DMSO中，配制濃度為0.1 mmol/L的溶液A。再稱(chēng)取NSP-DMAE-NHS適量，溶于無(wú)水DMF中，配制濃度為10 mmol/L的溶液B。取溶液B 5.0 mL，加入三乙胺(TEA)2 mg，再加入溶液B 5.0 mL，最后用0.05 mol/L pH 9.6 的碳酸鹽緩沖液稀釋至總體積10 mL，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)16 h，產(chǎn)物經(jīng)制備色譜純化，獲得吖啶酯-T4結(jié)合物。

1.2.4FT4標(biāo)準(zhǔn)品配制稱(chēng)取適量T4標(biāo)準(zhǔn)品[7]，溶解于適量無(wú)激素血清中，配制成濃度為0.1 mmol/L的儲(chǔ)備液，再用無(wú)激素血清將儲(chǔ)備液稀釋為S0、S1、S2、S3、S4、S5共6個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)，濃度分別為0、2、5、10、25、75 pmol/L。

1.2.5底物激發(fā)液配制激發(fā)液A：0.1%的H2O2+0.1 mol/L的HNO3；激發(fā)液B：0.2 mol/L NaOH+2% Triton X-100。

1.3方法及原理微孔中依次加入50 μL 的標(biāo)本、吖啶酯-T4結(jié)合物、生物素化抗體和SA磁性微球，37 ℃溫育15 min，洗滌5次，加激發(fā)液A和B各100 μL，讀取相對(duì)發(fā)光值。反應(yīng)原理為一步競(jìng)爭(zhēng)法。標(biāo)本中待測(cè)的游離T4抗原與吖啶酯標(biāo)記的T4抗原相互競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合有限的生物素化抗體，最終吖啶酯所產(chǎn)生的發(fā)光值與標(biāo)本中的FT4含量呈反向相關(guān)。

2　結(jié)　　果

圖1　　FT4測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(劑量-反應(yīng)曲線(xiàn))

2.3特異度將易發(fā)生交叉反應(yīng)的物質(zhì)T3和rT3分別稀釋至500 ng/mL和50 ng/mL，作為標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，高濃度T3和rT3對(duì)檢測(cè)無(wú)明顯干擾，其濃度均小于1.5 pmol/L。

圖2　　熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.4熱穩(wěn)定度將全套試劑組分37 ℃放置6 d后， 分析其標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試性能，通過(guò)與放置前的信號(hào)強(qiáng)度比值，確定熱穩(wěn)定性的變化幅度，均小于15%。見(jiàn)圖2。

2.5準(zhǔn)確度采用FT4標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)試，使用Log-Logit數(shù)學(xué)模型擬合，分析實(shí)際測(cè)試值與理論值的偏差，準(zhǔn)確度測(cè)試偏差小于10%。見(jiàn)表1。

表1　　準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

2.6與其他廠家試劑的相關(guān)性用全套試劑對(duì)100例臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，高、中、低值標(biāo)本分別為21、29、50例，與貝克曼DXI800全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)值進(jìn)行比較，相關(guān)性較好(r2=0.854 7)。見(jiàn)圖3。

圖3　　與貝克曼全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)的相關(guān)性

3　討　　論

血液循環(huán)中絕大部分T4與載體蛋白相結(jié)合，只有0.03% 的T4 處于游離狀態(tài)(FT4)。檢測(cè)FT4不受甲狀腺球蛋白影響，可特異性地反映甲狀腺的功能狀態(tài)，因此在疾病診斷、病情評(píng)估、療效監(jiān)測(cè)等方面具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，成為判斷甲狀腺功能最靈敏的一項(xiàng)參考指標(biāo)[8]。

目前有研究報(bào)道， FT4化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法的免疫固相載體主要有微孔和磁性微球2種[9-10]。磁性微球通過(guò)化學(xué)鍵偶聯(lián)蛋白，具有結(jié)合牢固、重復(fù)性好、反應(yīng)高效、易于儲(chǔ)存和自動(dòng)化等特點(diǎn)，是較為先進(jìn)的固相載體。信號(hào)標(biāo)記物主要是間接發(fā)光的酶標(biāo)記，包括辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)，而采用吖啶酯(AE)直接標(biāo)記游離甲狀腺素研究較少。AE標(biāo)記物背景信號(hào)低、發(fā)光效率高，且不需要酶催化，受環(huán)境因素干擾較小，且其底物比酶促系統(tǒng)底物更加穩(wěn)定[11]。因此，吖啶類(lèi)物質(zhì)作為信號(hào)標(biāo)記物，對(duì)試劑的靈敏度、精密度等都有很大提高。

本研究成功將吖啶酯作為信號(hào)物質(zhì)與小分子甲狀腺素進(jìn)行標(biāo)記，采用小分子競(jìng)爭(zhēng)法原理，引入磁性微球作為固相載體，并結(jié)合鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)，開(kāi)發(fā)出性能優(yōu)良的FT4檢測(cè)試劑，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，對(duì)相關(guān)科研也有一定的參考意義。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.19.052

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1673-4130(2016)19-2773-03

2016-03-20

2016-05-25)