鄭　汐, 梁國棟, 王　潮, 劉克良

(軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所, 抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室, 北京 100850)

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異肽鍵穩(wěn)定的MERS-CoV融合蛋白S2亞基N端重復序列三股α螺旋的構(gòu)建

鄭汐, 梁國棟, 王潮, 劉克良

(軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所, 抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室, 北京 100850)

通過在天然N肽的氨基端引入可以誘導螺旋三聚體形成的人工多肽序列, 并通過?；D(zhuǎn)移反應(yīng)在上述嵌合肽所形成的三股α螺旋間引入異肽鍵, 構(gòu)建了中東呼吸綜合征病毒(MERS-CoV)的N-trimer模型, 為MERS-CoV融合抑制劑的設(shè)計奠定了基礎(chǔ).

中東呼吸綜合征病毒; 融合蛋白; 多肽; 異肽鍵

2012年, 一名60歲的男性沙特籍患者死于多器官衰竭[1], Zaki等[2～4]在該患者體內(nèi)分離出一種新型的人獸共患冠狀病毒, 并將其命名為中東呼吸綜合征病毒(MERS-CoV). MERS-CoV先后在中東及南韓地區(qū)爆發(fā)了大規(guī)模流行, 在全球范圍內(nèi)共造成1600余例人類感染, 導致590人死亡[5,6]. 與2003年亞洲地區(qū)流行的嚴重急性呼吸窘迫綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)相比[7], MERS-CoV的致死率高達36%. 目前, 臨床的治療手段是利巴韋林與干擾素聯(lián)合治療, 尚無特異性治療方法[2,8～10].

Scheme 1　Structure of 6-helix bundle(6-HB)(A) Side view of MERS-CoV S2 subunit 6-HB structure(PDB:4mod), peripheral helix present the C-terminal heptad repeat(CHR) in MERS-CoV, while the central helix trimer are N-terminal heptad repeat(NHR); (B) top view of 6-HB show the amino acid in a, d site(cyan) and e, g site.

MERS-CoV所屬的冠狀病毒科具有包膜結(jié)構(gòu)[11]. 融合是包膜病毒入侵宿主細胞時的重要環(huán)節(jié). 通過抑制融合, 可以將包膜病毒阻止在宿主細胞膜外, 最終被身體的免疫防線清除[12]. 晶體學研究結(jié)果表明, MERS-CoV包膜上具有融合功能的棘突糖蛋白(Spike protein)為Ⅰ類融合蛋白[12,13]. 病毒發(fā)生膜融合時, S蛋白的S1亞基會首先識別細胞表面的特異性受體CD26(或稱DPP4)并與之結(jié)合, 然后在體內(nèi)蛋白酶TMPRSS2的作用下暴露出S2亞基的膜融合肽FP片斷, 并插入宿主細胞膜中[12～16]. 失去支撐的S2亞基沿著勢能降低的方向發(fā)生折疊變構(gòu), 其中N端七重復序列(NHR)以α螺旋的形式形成同源三聚體并提供3個疏水溝槽; C端七重復序列(CHR)以α螺旋的形式結(jié)合至疏水溝槽內(nèi), 形成如Scheme 1所示的6-HB結(jié)構(gòu). 6-HB結(jié)構(gòu)拉近了宿主細胞膜和病毒包膜之間的距離, 從而引發(fā)融合過程[17～20]. 6-HB結(jié)構(gòu)是MERS-CoV入侵宿主細胞過程中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu), 其中NHR三股螺旋位于其結(jié)構(gòu)中心. 從MERS-CoV內(nèi)源性6-HB晶體結(jié)構(gòu)可知, NHR與CHR互為配基; 在藥物研發(fā)領(lǐng)域, NHR與CHR互為靶標. 因此, 體外重現(xiàn)N肽三螺旋結(jié)構(gòu), 一方面可以作為開發(fā)C肽類MERS-CoV融合抑制劑的分子靶標, 另一方面N肽三螺旋本身又可以作為N肽類融合抑制劑用于阻止MERS-CoV感染宿主細胞. HIV-1與MERS-CoV同屬I類包膜病毒, 具有相似的融合機制, 在融合過程中均經(jīng)歷由NHR-CHR相互作用形成的6-HB結(jié)構(gòu)[21～23]. 因此, MERS-CoV肽類融合抑制劑的研究可以參考HIV-1融合抑制劑. Jiang等[24～26]報道了衍生于HIV-1 CHR的第一個HIV-1融合抑制劑多肽(C肽) T20, T20的上市開辟了利用C肽類融合抑制劑阻止Ⅰ類包膜病毒與宿主細胞融合的新領(lǐng)域. Jiang等[13]發(fā)現(xiàn)衍生于MERS-CoV融合蛋白S2亞基CHR區(qū)的36肽HR2P對MERS-CoV的半數(shù)抑制濃度達到1 μmol/L. 與此相反, 衍生于MERS-CoV融合蛋白NHR的多肽片段(N肽)HR1P(S蛋白第998～1039位)雖與HR2P互為靶點, 但因其長度縮短后結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定, 從而其在離體狀態(tài)下難以重現(xiàn)螺旋三聚體核心結(jié)構(gòu), 進而難以發(fā)揮生物學活性[27～32]. 因此, 如何按照已闡明的晶體結(jié)構(gòu)和作用機制在體外重現(xiàn)MERS-CoV的NHR三螺旋結(jié)構(gòu), 成為開發(fā)N肽類MERS-CoV融合抑制劑的難點. 目前, 尚未見有關(guān)穩(wěn)定MERS-CoV N肽方法的報道.

本文從MERS-CoV S蛋白S2亞基的NHR區(qū)域分段選取含有21個殘基的N肽片段作為模板, 借鑒HIV-1 N肽的研究思路[33～35], 通過在N肽的氨基端引入人工設(shè)計的具有形成三股α螺旋能力的輔助序列, 改善N肽的水溶性, 并使N肽能自發(fā)組裝成三聚體[36～38], 通過硫酯轉(zhuǎn)移反應(yīng)在特定氨基酸殘基側(cè)鏈間形成異肽鍵[39～41][Scheme 2(A)], 進一步穩(wěn)定三聚體, 構(gòu)建了MERS-CoV S2亞基N肽三聚體(N-trimer)模型. N-trimer模型的構(gòu)建方法可以為MERS-CoV融合蛋白NHR三聚體的構(gòu)建提供思路, 并為其它螺旋三聚體模型的構(gòu)建提供參考.

Scheme 2　N-helix trimer stabled by isopeptide(A) Isopeptide bond was formed between lysine in e site and glutamic acid in g′ site of adjacent peptide chain; (B) schematic representation of isopeptide bond formation via an interhelical acyl transfer reaction.

1　實驗部分

1.1試劑與儀器

Rink酰胺樹脂(載量0.46 mmol/g)購自天津南開和成科技有限公司;N-芴甲氧羰基-L-丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)、N-芴甲氧羰基-N′-三苯甲基-L-天冬酰胺[Fmoc-Asn(Trt)-OH]、N-芴甲氧羰基-N′-三苯甲基-L-谷氨酰胺[Fmoc-L-Gln(Trt)-OH]、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-谷氨酸[Fmoc-Glu(OtBu)-OH]、N-芴甲氧羰基-甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)、N-芴甲氧羰基-L-異亮氨酸(Fmoc-Ile-OH)、N-芴甲氧羰基-L-亮氨酸(Fmoc-Leu-OH)、N-α-芴甲氧羰基-N′-叔丁氧羰基-L-賴氨酸[Fmoc-Lys(Boc)-OH]、N-芴甲氧羰基-L-甲硫氨酸(Fmoc-Met-OH)、N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-絲氨酸[Fmoc-Ser(tBu)-OH]、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-蘇氨酸[Fmoc-Thr(tBu)-OH]、N-芴甲氧羰基-L-纈氨酸(Fmoc-Val-OH)、N-芴甲氧羰基-O-烯丙基-L-谷氨酸[Fmoc-Glu(OAll)-OH]、 苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)和1-羥基苯并三唑(HOBt)購自上海吉爾生化有限公司; 雙甲酮(Dimedone)、 四三苯基膦零價鈀鹽[Pd(PPh3)4]、 二乙基二硫代氨基甲酸鈉鹽(或稱銅試劑)、 芐硫醇(HSBn)和N,N-二異丙基乙基胺(DIEA)購自J & K百靈威試劑公司;N-甲基吡咯烷酮(NMP)購自Acros試劑公司; 乙二硫醇(EDT)和間甲酚(m-Cresol)購自Alfa Aesar試劑公司; 三氟乙酸(TFA)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF, 必要時CaH2浸泡過夜后減壓蒸餾)購自北京博邁杰科技有限公司; 二氯甲烷(DCM)用無水K2CO3干燥處理, 避光靜置24 h后使用; 哌啶與NaOH回流后重蒸或直接使用; 所用試劑均為分析純.

CEM LibertyTM微波多肽合成儀(美國CEM公司); Shimadzu 10A型高效液相色譜儀(HPLC, 日本島津株式會社); Venusil ASB C8液相色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm,天津博納艾杰爾公司); Free-Zone 18 L型冷凍干燥機(美國Labconco公司); 9.4 T混合型串聯(lián)傅里葉質(zhì)譜儀(MS, 德國Bruker公司); REFLEX Ⅲ型MALDI-TOF質(zhì)譜儀(MS, 德國Bruker公司); Waters Delta Prep-4000型高壓制備液相色譜儀(HPLC, 美國Waters公司); X-Bridge C8高壓制備液相色譜柱(19.5 mm×250 mm, 美國Waters公司); Milli-Q純水機(美國MilliPore公司).

1.2實驗過程

1.2.1多肽序列的固相合成使用CEM微波多肽合成儀, Rink酰胺樹脂, 0.25 mmol規(guī)模. 采用標準的氨基芴甲氧羰基保護(Fmoc)固相方法合成多肽樹脂載體, 以10 mL DMF和10 mL DCM作為溶脹溶劑, 以10 mL哌啶(體積分數(shù)20%)的DMF溶液作為脫保護試劑, 以HBTU/HOBt/DIEA作為縮合劑, 以0.5 mL乙酸酐與20 mL DCM溶液(含0.5 mL DIEA)作為封端試劑, 經(jīng)[樹脂溶脹-脫Fmoc保護-氨基酸縮合-]循環(huán), 期間用DMF洗滌樹脂殘留溶液, 從C端依次向N端合成氨基酸, 必要時縮合2次. 最末端氨基酸脫除Fmoc后乙?；舛吮Ｗo, 得到側(cè)鏈正交保護的多肽樹脂載體.

采用側(cè)鏈由烯丙氧羰基保護的L-型谷氨酸參與多肽序列的合成, 如Scheme 2(B)所示. 將Rink酰胺樹脂同上述封端后, 用5 mmol零價鈀Pd(PPh3)4和5 mmol雙甲酮在避光條件下正交脫除谷氨酸的保護基團作為反應(yīng)位點. 暴露的—COOH與5 mmol芐硫醇在EDC/HOBt催化下縮合形成硫脂鍵. 以B裂解液[V(三氟乙酸)∶V(間甲酚)∶V(苯甲醚)∶V(乙二硫醇)∶V(水)=16∶1∶1∶1∶1]與樹脂以10 mL/g的比例裂解凍干得粗肽. 利用高壓制備液相色譜純化后凍干得到純肽, 純度大于95%(HPLC). 用ESI-Q-FT-MS或MALDI-TOF-MS鑒定多肽. 將凍干粉精密稱量至每份約1 mg并于4 ℃保存[13].

1.2.2用異肽鍵交聯(lián)成三聚體將上述硫酯化多肽在純化、 濃縮、 凍干后溶解于pH=7.4的PBS緩沖液中(含15%體積分數(shù)乙腈), 濃度為1 mg/mL, 置于37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育. 在該條件下, IZ片段與N肽片段自發(fā)組裝為三聚體的驅(qū)動力使多肽單體相互靠近, 使硫酯化修飾的Glu活潑酯與對應(yīng)位點的Lys側(cè)鏈發(fā)生酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng), 用分析型RP-HPLC監(jiān)測形成異肽鍵的反應(yīng)動力學RC-HPLC條件:A相V(TFA)∶V(H2O)=1∶1000, B相V(TFA)∶V(H2O)∶V(MeCN)= 1∶300∶700, 梯度0 min B相(體積分數(shù)10%), 5 min B相(體積分數(shù)50%), 20 min B相(體積分數(shù)100%); 流速1 mL/min.

2　結(jié)果與討論

RP-HPLC動力學檢測結(jié)果如圖1(A)～(C)所示, 硫酯化修飾的單體由于非極性基團的引入, 原料峰保留時間最長, 均大于17.5 min. 在PBS緩沖液提供的弱堿離子環(huán)境下, 多肽發(fā)生自組裝, 目標反應(yīng)位點在空間距離和方向的限制下相互靠近, 發(fā)生緩慢的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)形成異肽鍵. 由于形成的三聚體脫去了硫酯非極性基團, 極性增大; 形成三聚體時, 共價交聯(lián)將多肽a,d位形成的疏水面包裹在分子內(nèi)側(cè), 降低了與反相柱填料的作用概率; 形成三聚體時, 分子量增大, 使柱填料保留能力減弱, 故產(chǎn)物色譜峰出現(xiàn)在保留時間為11～12 min的位置. 由圖1(D)～(I)可見, 經(jīng)ESI-Q-FT-MS驗證, 與多肽單體相比, 該產(chǎn)物為N-trimer共價交聯(lián)三聚體. 結(jié)果表明, 經(jīng)過修飾的N肽在生理條件下具有自組裝成三螺旋的傾向, 并以這一驅(qū)動力為空間結(jié)構(gòu)基礎(chǔ), 發(fā)生定點?；D(zhuǎn)移反應(yīng), 生成了異肽鍵穩(wěn)定的N-trimer.

Fig.1　RP-HPLC traces(A—C) and mass spectrometry(D—I) of isopeptide bond forming reactionRP-HPLC traces for the acyl transfer reaction of (IZN21L)3(A), (IZN21M)3(B) and (IZN21R)3(C) from t=2.5 to 150 h. Absorbance was monitored at 210 nm. (A—C):a. The reaction material; b. the reaction product; c. by-products. Mass spectrometry of monomer peptide, the reaction materal of (IZN21L)3(D), (IZN21M)3(E), (IZN21R)3(F) and reaction products, the trimeric peptide (IZN21L)3(G), (IZN21M)3(H) and (IZN21R)3(I).

螺旋間的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)是一個定點特異的交聯(lián)反應(yīng). Lai等[32,33,41]利用該反應(yīng)在螺旋間的e/g′位定點特異性地形成異肽鍵用于穩(wěn)定超螺旋結(jié)構(gòu). 本文序列中的Glu-11和Lys-16分別處于e/g′位(見表1), 因此可以確定Glu-11可以與相鄰螺旋的Lys-16發(fā)生特異性反應(yīng)形成異肽鍵交聯(lián)的N-trimer. Lai等報道了雜質(zhì)峰中的中間產(chǎn)物隨著反應(yīng)時間延長會逐漸減少, 本實驗中也觀察到相似的現(xiàn)象. 但由于MERS-CoV N肽高級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性比HIV-1更差, 因此交聯(lián)反應(yīng)更困難, 不僅所需時間更長, 而且副產(chǎn)物更多. 本文交聯(lián)反應(yīng)的副產(chǎn)物主要是多肽在生理條件下的降解碎片; 從化學反應(yīng)特性的角度推測, 其它副反應(yīng)如硫酯基團的水解和非特異氨基位點反應(yīng)也不可避免. 用人工序列修飾MERS-CoV融合蛋白跨膜亞基S2的NHR衍生肽, 使之不易聚集并具有自組裝傾向, 再通過硫酯活化的?；D(zhuǎn)移反應(yīng), 將螺旋間的一對谷氨酸-賴氨酸側(cè)鏈以異肽鍵的方式連接在一起, 構(gòu)建了由共價鍵穩(wěn)定的N-trimer結(jié)構(gòu). 在進一步結(jié)構(gòu)研究的指導下, 該模型可為中東呼吸綜合征冠狀病毒融合蛋白跨膜亞基體外N端三螺旋的構(gòu)建提供參考.

Table 1　Designed peptide sequences derived from HR1P

*Lower-case letters(a—g) above indicate the amino acids sites in heptad repeat. Italic letters represent auxiliary sequence. IZm:IKKE IEAIKKE QEAIKKK IEAI. Isopeptide bonds are formed between Glu-11 and Lys-16 (underlined).

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(Ed.:P, H, W, K)

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(Nos.81373266, 81573266).

Construction of Isopeptide Bridge-tethered NHR-trimeric Coiled-coil in MERS-CoV Membrane Fusion Protein?

ZHENG Xi, LIANG Guodong, WANG Chao*, LIU Keliang*

(Beijing Institute of Pharmacology and Toxicology, State Key Laboratory of Toxicology andMedicalCountermeasures,Beijing100850,China)

In Middle East respiratory syndrome coronavirus(MERS-CoV) infection, the formation of a coiled-coil six-helical bundle(6-HB) between three C-terminal heptad repeats(CHRs) and an N-terminal heptad repeat(NHR) trimer of the MERS-CoV spike protein S2 subunit provided the energy necessary for virus-cell membrane fusion. Mimicry of the NHR-helical trimers in the MERS-CoV membrane fusion protein for the discovery of antiviral therapeutics hampered because of the strong aggregation properties of synthetic NHR-based peptides taken out of their parent protein structure. Herein, the article presents an efficient strategy to recapi-tulate MERS-CoV NHRα-helical trimersviacombining the concepts of grafting the NHR-derived peptides onto an exogenous trimerization motif with stabilization of the trimeric oligomers through isopeptide bonds. The covalent bridge was introduced by an acyl transfer reaction between lysine and glutamic acid in specific amino acid sites with thio-easter modified. The designed isopeptide bridge-stabilized chimeric trimers has strong potential for the development potent MERS-CoV fusion inhibitors.

Middle East respiratory syndrome coronavirus; Fusion protein; Peptide; Isopeptide bond

10.7503/cjcu20160237

2016-04-13. 網(wǎng)絡(luò)出版日期:2016-08-26.

國家自然科學基金(批準號:81373266, 81573266)資助.

O629.72

A

聯(lián)系人簡介:劉克良, 男, 博士, 研究員, 博士生導師, 主要從事多肽藥物、 核酸化學及藥用高分子材料研究.E-mail:keliangliu55@126.com

王潮, 男, 博士, 助理研究員, 主要從事多肽藥物研究. E-mail:chaow301@gmail.com