魏云計

摘 要：建立高效液相色譜-串聯(lián)質譜測定雞肉中磺胺硝苯殘留的方法。樣品經過甲酸-乙酸乙酯（2∶98，V/V）提取，正己烷脫脂，液-液分配凈化后，C18柱分離，甲醇、5 mmol/L乙酸銨為流動相梯度洗脫，采用負離子掃描多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式下液質聯(lián)用儀進行定性和定量分析。在2.0～100.0 μg/L質量濃度范圍內，線性相關系數(shù)大于0.99，方法的檢出限和定量限分別為0.5 μg/kg和2.0 μg/kg，在2.0、5.0、10.0 μg/kg添加量的回收率為76.0%～83.4%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）小于8.7%。該方法簡便快捷，可用于雞肉中磺胺硝苯殘留量測定。

關鍵詞：液相色譜-串聯(lián)質譜；負離子模式；雞肉；磺胺硝苯

Abstract： A method for the determination of sulfanitran in chicken was developed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Samples were extracted with formic acid-ethyl acetate （2：98， V/V）， and the extract was defatted by hexane extraction and cleaned up by liquid-liquid partitioning. The analyte was separated on a C18 colum using a mobile phase consisting of methanol and 5 mmol/L ammonium acetate solution with gradient elution. The mass spectrometry was operated in negative ion mode using multiple reaction monitoring （MRM） for qualitative and quantitative analysis. The calibration curve of the method was linear in the range of 2.0–100.0 μg/L， with correlation coefficient more than 0.99. The limit of detection （LOD） and limit of quantitation （LOQ） were 0.5 μg/kg and 2.0 μg/kg， respectively. At spiked levels of 2.0， 5.0， 10.0 μg/kg， the recoveries ranged from 76.0% to 83.4% with relative standard deviations （RSD） less than 8.7%. This method proved to be convenient and suitable for the determination of sulfanitran residues in chicken.

Key words： liquid chromatography-tandem mass spectrometry； negative ion mode； chicken； sulfanitran

DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.08.007

中圖分類號：TS251.7 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2016）08-0035-04

磺胺硝苯屬于磺胺類的一種抗球蟲藥物，此藥抑制球蟲體內的二氫葉酸合成酶阻礙葉酸合成導致核酸合成受阻從而使蟲體繁殖受到抑制，該藥作用是在球蟲無性繁殖階段抑制第二代裂殖體的發(fā)育，對第一代裂殖體也有一定抑制作用，主要用于家禽球蟲病的治療與預防[1]。研究表明，磺胺類藥物在體內的作用時間和代謝時間較長，人體長期食用含有此類藥物的食品會在體中蓄積，進而對人體機能產生危害[2-4]，破壞人的造血系統(tǒng)，造成溶血性貧血[5]，并導致病原體產生抗藥性，發(fā)生過敏反應[6-7]。為保障食用者的安全我國及歐盟規(guī)定肉類食品中的磺胺類藥物的最高殘留限量（maximum residue limit，MRL）為：單一磺胺類藥物25.0 μg/kg，磺胺類藥物總量100.0 μg/kg[8-14]。

目前使用現(xiàn)代分析儀器對動物源性食品、化妝品及飼料中磺胺硝苯檢測的方法文獻報道很多，主要有液相色譜法[15-18]和液相色譜-串聯(lián)質譜法[19-25]。液相色譜-串聯(lián)質譜抗干擾能力強、選擇性好檢測靈敏度高，已被廣泛應用于磺胺類獸藥殘留檢測。文獻所報道的液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測磺胺硝苯的方法均是正離子監(jiān)測模式，尚未有使用負離子監(jiān)測模式的方法報道。本實驗分別優(yōu)化了正、負離子監(jiān)測模式下的儀器方法。通過實驗驗證，使用負離子監(jiān)測模式的靈敏度高于正離子監(jiān)測模式，降低了磺胺硝苯的檢測限，更好地保障消費者的安全。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞肉樣品購于淮安蘇果超市。

磺胺硝苯（純度為98%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙酸乙酯均為色譜純 美國默克公司；正己烷、甲酸均為色譜純 美國天地公司；無水硫酸鈉為分析純 南京化學試劑有限公司；水為超純水。

1.2 儀器與設備

TSQ Quantum Ultra EMR串聯(lián)質譜儀（配有電噴霧離子（electrospray ionization，ESI）源）、Surveyor液相色譜系統(tǒng)（包括自動進樣器Autosampler 1.3）、MS Pump 2.0質譜泵 美國Thermo Fisher公司；ZORBAX SB-C18色譜柱 美國Agilent公司；氮吹儀 美國Organomation

公司；超純水器 美國Millipore公司；離心機 美國Sigma公司；超聲波清洗儀 寧波新芝生物科技公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

準確稱取磺胺硝苯標準品10.00 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成1.0 g/L標準儲備液，于冰箱中冷凍避光保存，實驗中根據(jù)需要用甲醇稀釋至適當質量濃度的標準工作液。

1.3.2 樣品提取

準確稱?。?.00±0.05） g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL甲酸-乙酸乙酯（2∶98，V/V），于渦旋混合器上混勻1 min，超聲波提取10 min；以8 000 r/min的速率離心3 min，轉移上層有機溶液至20 mL氮吹管中；再用8 mL甲酸-乙酸乙酯（2∶98，V/V）重復提取殘渣1 次，合并2 次提取液于氮吹管中，于45 ℃水浴中氮吹至干，用1.0 mL甲醇-水（2∶8，V/V）溶解，加入1.0 mL正己烷溶液，渦旋混勻，10 000 r/min離心3 min，下層溶液經0.22 μm濾膜過濾至進樣瓶中，供液相色譜-串聯(lián)質譜儀分析。

1.3.3 HPLC-MS/MS條件

HPLC條件：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 ?m）；進樣量：25 μL；柱溫：30 ℃；流動相：A為5 mmol/L乙酸銨，B為甲醇；梯度洗脫條件：0～4 min 70%A；4.1～6.5 min 20% A；6.6～8.5 min 70% A；流速：250 μL/min。

MS/MS條件：采用ESI源；負離子方式掃描；噴霧電壓：2 500 V；離子源溫度：400 ℃；鞘氣：40 bar，輔助氣：15 bar；毛細管溫度：350 ℃；多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）方式檢測；優(yōu)化質譜條件見表1。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優(yōu)化

磺胺類藥物為弱堿性，結構式中具有仲氨基或者叔氨基的化學電離性質，文獻[26-28]報道的都是選用ESI+作為離子化模式。本實驗在已有文獻[29-30]報道的基礎上，采用注射泵直接進樣的方式，將質量濃度為1 μg/mL的標準物質，以5 μL/min的流速注入離子源中。首先在正離子模式下進行一級質譜分析，得到m/z 336.0分子離子峰，通過對輔助氣、噴霧電壓、透鏡補償電壓等參數(shù)優(yōu)化獲得m/z 336.0，最高響應值為3.69×105，儀器響應強度較低；對磺胺硝苯在負離子模式下進行一級質譜掃描分析，得到m/z 334.0分子離子峰，通過優(yōu)化輔助氣、噴霧電壓、透鏡補償電壓等參數(shù)獲得m/z 334.0最高響應為1.3×106，是正離子模式響應強度的3.5 倍，選定負離子模式進行監(jiān)測，再對m/z 334.0準分子離子峰進行二級質譜分析，得到其相應的碎片離子信息。然后對每種物質的二級質譜進行碰撞能量、碰撞氣、透鏡補償電壓等參數(shù)優(yōu)化，使每種物質的分子離子與特征碎片離子產生的離子對強度達到最大時為最佳，得到m/z 136.5、270碎片離子。實驗結果發(fā)現(xiàn)，相同進樣量的磺胺硝苯用Q1掃描ESI（-）比ESI（+）具有更高的響應值（圖1），靈敏度大幅度提高，所以磺胺硝苯采用負離子模式監(jiān)測。

2.2 流動相的選擇

磺胺硝苯采用ESI（-）離子模式監(jiān)測，在流動相中未添加甲酸或者乙酸等酸性供質子體物質。本實驗考察了甲醇-水、乙腈-水混合溶劑作為流動相對磺胺硝苯的色譜行為和離子化程度的影響。結果表明，甲醇-水為流動相時儀器響應值、色譜峰面積高于乙腈-水為流動相時儀器響應值、色譜峰面積。實驗還比較了在水相加入5 mmol/L乙酸銨對色譜峰的影響，研究表明，流動相為甲醇-5 mmol/L乙酸銨時，峰形優(yōu)于甲醇-水為流動相，因此選擇甲醇-5 mmol/L乙酸銨為流動相。

2.3 提取溶劑的選擇

磺胺硝苯具有較強極性，pKa為14.5，易溶于酸性溶液和乙腈、乙酸乙酯、甲醇等極性有機溶劑。本實驗考察了乙腈、甲酸-乙酸乙酯（1∶199、1∶99、2∶98、3：97、4∶96、5∶95，V/V）和乙酸乙酯的提取效率。結果表明，上述幾種溶劑對磺胺硝苯均有較好的提取效果，乙腈對肌肉組織滲透能力較強，沉淀蛋白的效果較好，提取的脂肪含量較少，但是提取的基質干擾較大，磺胺硝苯受基質效應影響較強，添加回收率較低；乙酸乙酯提取的基質干擾較少，但提取出較多的脂肪，可以通過正己烷脫脂凈化處理去掉脂肪，添加回收率明顯優(yōu)于乙腈；磺胺硝苯易溶于酸性溶液，使用酸性乙酸乙酯提取回收率高于乙酸乙酯，實驗對甲酸的用量進行優(yōu)化，當隨著甲酸體積分數(shù)加大，磺胺硝苯的回收率逐漸提高，當其體積分數(shù)大于2%時回收率增加不明顯，加大甲酸用量可以加強沉淀蛋白的效果，但是隨著甲酸體積分數(shù)的提高，提取的基質干擾較多，因此，采用甲酸-乙酸乙酯（2∶98，V/V）混合溶液作為提取溶劑。

2.4 基質效應、準曲線線性范圍及定量限

2.5 方法的回收率和精密度

選取陰性雞肉樣品，添加磺胺硝苯標準品，添加水平為2.0、5.0、10.0 μg/kg，每個水平進行5 次平行實驗，按上述優(yōu)化的實驗方法測定各組分的回收率和相對標準偏差，結果見表2。

3 結 論

本實驗建立了負離子監(jiān)測模式測定雞肉中磺胺硝苯殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質法，較正離子監(jiān)測模式儀器靈敏度大幅度提高，采用基質標準曲線來減弱基質效應對磺胺硝苯定量分析的影響。該方法操作簡便快速，靈敏度較高，回收率較好，滿足實際檢測工作的需要。

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