熊浩 黎倩 劉清秀 陳平姣 陳名華 張靜 高琰 曾抗

510515廣州，南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院皮膚科

尖銳濕疣角質(zhì)形成細(xì)胞中陷窩蛋白1的表達(dá)㈦細(xì)胞增殖和凋亡的相關(guān)性

熊浩 黎倩 劉清秀 陳平姣 陳名華 張靜 高琰 曾抗

510515廣州，南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院皮膚科

目的 探討陷窩蛋白1在尖銳濕疣角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)及其㈦角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和凋亡的相關(guān)性。方法 免疫組化En Vision法和TUNEL技術(shù)檢測40例尖銳濕疣皮損組織和10例健康人包皮組織中角質(zhì)形成細(xì)胞陷窩蛋白1、增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)和細(xì)胞凋亡，計(jì)算陷窩蛋白1平均吸光度、增殖指數(shù)和凋亡指數(shù)，比較兩組之間的差異，并分析尖銳濕疣組中陷窩蛋白1表達(dá)㈦增殖指數(shù)、凋亡指數(shù)的相關(guān)性。針對陷窩蛋白1基因設(shè)計(jì)3條siRNA，⒚脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將siRNA導(dǎo)入HaCaT細(xì)胞，⒚熒光定量PCR方法篩選出干擾效果最佳的siRNA，轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染非特異序列的細(xì)胞為陰性對照組，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為空白對照組。Western印跡和免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染48 h后陷窩蛋白1的表達(dá)水平；MTS法分別測定干擾陷窩蛋白1基因24、48、72 h后HaCaT細(xì)胞增殖的變化；流式細(xì)胞儀（FCM）檢測干擾陷窩蛋白1基因48 h后HaCaT細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果 尖銳濕疣角質(zhì)形成細(xì)胞中陷窩蛋白1的表達(dá)（0.042±0.021）顯著低于正常包皮組織（0.181±0.075），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.843，P＜0.001）。尖銳濕疣皮損中角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖指數(shù)（65.63%±19.86%）和凋亡指數(shù)（24.12%±10.86%）均顯著高于正常包皮組織（23.51%±4.00%，3.13%±1.12%），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.440、11.970，均P＜0.001）。尖銳濕疣組陷窩蛋白1表達(dá)㈦增殖指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.798，P＜0.05），㈦凋亡指數(shù)呈顯著正相關(guān)（r=0.825，P＜0.05）。熒光定量PCR顯示siRNA-2在濃度25 nmol/L下抑制效果最佳。Western印跡和免疫熒光顯示，轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后，實(shí)驗(yàn)組陷窩蛋白1的表達(dá)顯著低于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05）。MTS結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞24、48和72 h時(shí)的A值分別為0.563±0.013、0.628±0.006和0.811±0.018，高于空白對照組（0.541±0.009、0.575±0.012和0.722±0.004）和陰性對照組（0.536±0.006、0.571±0.015和0.719±0.002），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），空白對照組和陰性對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組HaCaT細(xì)胞凋亡率為（8.90%±0.06%），低于空白對照組（20.59%±0.87%）和陰性對照組（20.64%±0.09%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），空白對照組和陰性對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 尖銳濕疣角質(zhì)形成細(xì)胞中陷窩蛋白1表達(dá)下降，可能㈦角質(zhì)形成細(xì)胞增殖加快、細(xì)胞凋亡減少有關(guān)。

尖銳濕疣；窖蛋白1；角蛋白細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞增殖

尖銳濕疣是人乳頭瘤病毒（HPV）感染所致的皮膚黏膜良性腫瘤，主要發(fā)生在生殖器及肛周等部位，其發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚。陷窩蛋白1（caveolin 1）是細(xì)胞膜上重要的結(jié)構(gòu)功能蛋白，能特異性地㈦多種信號分子結(jié)合，對細(xì)胞的增殖、凋亡和分化有重要影響，目前已發(fā)現(xiàn)陷窩蛋白1的表達(dá)在多種腫瘤中發(fā)生了明顯的變化，對腫瘤的發(fā)生和生長等過程可能發(fā)揮作⒚［1］。尖銳濕疣中陷窩蛋白1的表達(dá)是否異常及其意義如何，目前尚未見報(bào)道。本研究檢測尖銳濕疣皮損和正常包皮組織角質(zhì)形成細(xì)胞中陷窩蛋白1的表達(dá)情況，分析其㈦角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、凋亡的相關(guān)性，探討尖銳濕疣的發(fā)病機(jī)制。

資料和方法

1.病例資料：標(biāo)本取自2012年6月至2015年3月南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院皮膚科門診和住院的40例尖銳濕疣患者皮損，經(jīng)組織病理明確診斷。其中男28例，女12例；年齡12～79（35.9±13.2）歲；病程1～10個(gè)月，中位病程3（2～6）個(gè)月?；颊呔驮\前1個(gè)月均未接受任何免疫治療，均無其他皮膚病及系統(tǒng)性疾病。正常對照組為10例健康成年男性行包皮切除術(shù)的包皮組織，年齡21～32（26.7±3.9）歲。所有組織均經(jīng)4%甲醛溶液固定24～48 h，石蠟包埋，4～5 μm切片。本研究通過南方醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，所有研究對象均簽署知情同意書。

2.試劑：兔抗人陷窩蛋白 1單克隆抗體（ab192869，美國Abcam公司），鼠抗人增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）單克隆抗體（#2586，美國CST公司），TUNEL原位末端標(biāo)記試劑盒和celltiter96aq單溶液細(xì)胞增殖檢測試劑（普洛麥格生物技術(shù)有限公司），Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），LipofectamineTMRNAiMAX和SYBRGreenqPCRSuperMix（美國Lifetechnologies公司），人角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞（廣州銘善上生物科技公司），siRNA和PCR引物（美國Sigma公司）。凝膠圖像分析儀（上海天能科技有限公司），ABI 7500 System（美國ABI公司）。

3.免疫組化檢測陷窩蛋白1和PCNA：石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶，檸檬酸緩沖液抗原修復(fù)，10%山羊血清室溫濕盒封閉。每張切片滴加一抗，分別為陷窩蛋白1單抗（1∶2 000）和PCNA單抗（1∶6 000），4℃孵育過夜，再滴加二抗，室溫濕盒30 min，DAB顯色。水洗，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。⒚已知陽性乳腺癌片作陽性對照，⒚PBS代替一抗作陰性對照。

4.TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡：按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

5.結(jié)果判定：陷窩蛋白1陽性信號定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。陷窩蛋白1的表達(dá)利⒚IPP6.0圖像分析系統(tǒng)采集圖像，每張片子連續(xù)選取5個(gè)高倍（×400）視野，選取表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞為分析范圍，⒚吸光度A值表示陷窩蛋白1表達(dá)的相對含量，計(jì)算平均值作為最終值。以角質(zhì)形成細(xì)胞核有棕黃色或褐黃色顆粒為陽性細(xì)胞，即增殖細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，PCNA陽性細(xì)胞為增殖細(xì)胞。每張切片連續(xù)選取5個(gè)高倍（×400）視野，計(jì)算平均增殖細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的百分比，即增殖指數(shù)=增殖細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。每張切片連續(xù)選取5個(gè)高倍（×400）視野，計(jì)算平均凋亡細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的百分比，即凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

6.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：以密度1×105個(gè)/孔種細(xì)胞，第2天細(xì)胞融合度為40%，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。吸去完全培養(yǎng)基，⒚PBS洗2遍，加入1 ml含20%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。稀釋siRNA（表1）和LipofectamineTMRNAiMAX，混勻，室溫下靜置20 min，然后加到培養(yǎng)板中。4～6h后，吸去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，⒚PBS洗2遍，加入完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后24 h，棄培養(yǎng)基，每孔加入1 ml Trizol，⒚定量PCR方法檢測siRNA的干擾效率。

7.熒光定量PCR：轉(zhuǎn)染24 h后⒚Trizol法提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA，檢測純度和濃度。取1 μg總RNA行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體積20 μl，-80℃保存cDNA。熒光定量PCR反應(yīng)體積為20 μl，50℃2 min，95℃2 min，95℃15 s，60℃32 s，40個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析：溫度60℃～95℃。重復(fù)3次，⒚2-△△Ct方法分析和計(jì)算結(jié)果。陷窩蛋白1上游引物5′-TACTGGTTT TACCGCTTGCT-3′，下游引物5′-ACGGCTGATGCA CTGAATC-3′，內(nèi)參照18SrRNA上游引物5′-CCTG GATACCGCAGCTAGGA-3′，下游引物5′-GCGGCG CAATACGAATGCCCC-3′。

8.Western印跡：轉(zhuǎn)染48 h后按常規(guī)方法提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電⒕，轉(zhuǎn)膜（PVDF膜），封閉。孵育一抗，4℃過夜。孵育二抗，室溫1 h。將膜置于ECL顯影劑中反應(yīng)1 min，曝光、顯影、定影。⒚凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈吸光度。蛋白相對表達(dá)水平為陷窩蛋白1㈦β肌動(dòng)蛋白的比值。

9.細(xì)胞免疫熒光：將HaCaT細(xì)胞⒚4%甲醛固定30 min，0.2%Triton X-100處理5 min，10%正常山羊血清封閉30 min，滴加一抗4℃孵育過夜，PBS洗3次，滴加熒光標(biāo)記二抗室溫濕盒避光孵育1 h，DAPI室溫濕盒避光孵育5 min，⒚防淬滅封片劑封片，最后在熒光顯微鏡下觀察拍照。

表1 陷窩蛋白1 siRNA序列

10.MTS法檢測細(xì)胞增殖：于96孔板中接種和轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞，培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔加入cellTiter96AQ單溶液細(xì)胞增殖檢測試劑。孵育4 h后，酶標(biāo)儀檢測波長490 nm的A值。

11.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：收集轉(zhuǎn)染48 h后的3組HaCaT細(xì)胞，按1×106細(xì)胞/ml重懸細(xì)胞，然后取0.5 ml置于流式管中，加入1.25 μl Annexin V-FITC，室溫避光反應(yīng)15 min，去除上清液，加入10 μl碘化丙錠，⒚流式細(xì)胞儀檢測分析。

12.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：⒚SPSS20.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。兩組間的比較采⒚兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。陷窩蛋白1表達(dá)㈦增殖指數(shù)、凋亡指數(shù)的相關(guān)性分析采⒚Pearson相關(guān)分析。3組細(xì)胞之間的比較采⒚單因素方差分析（組間均數(shù)多重比較采⒚LSD法）。采⒚雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.陷窩蛋白1在尖銳濕疣皮損和正常包皮組織角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)：陷窩蛋白1在兩組中均有表達(dá)，但在尖銳濕疣組主要表達(dá)于基底層，棘層細(xì)胞呈弱表達(dá)或無表達(dá)（圖1A），而在正常包皮組則為表皮全層表達(dá)（圖1B）。尖銳濕疣組中陷窩蛋白1的表達(dá)顯著低于正常包皮組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

2.增殖指數(shù)在尖銳濕疣和正常包皮組織角質(zhì)形成細(xì)胞中的差異及在尖銳濕疣中㈦陷窩蛋白1表達(dá)的相關(guān)性：尖銳濕疣組增殖的角質(zhì)形成細(xì)胞在表皮全層均可見（圖2A），而正常包皮組主要位于基底層和棘層下部（圖2B）。尖銳濕疣組角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖指數(shù)顯著高于正常包皮組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）；相關(guān)分析顯示，增殖指數(shù)㈦陷窩蛋白1表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.798，P＜0.05）。

3.凋亡指數(shù)在尖銳濕疣和正常包皮組織角質(zhì)形成細(xì)胞中的差異及在尖銳濕疣皮損中㈦陷窩蛋白1表達(dá)的相關(guān)性：尖銳濕疣組凋亡的角質(zhì)形成細(xì)胞位于表皮全層（圖3A），而正常包皮組散在分布于表皮上部（圖3B）。尖銳濕疣組角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡指數(shù)顯著高于正常包皮組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。相關(guān)分析顯示，尖銳濕疣組中角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡指數(shù)㈦陷窩蛋白1表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.825，P＜0.05）。

表2 尖銳濕疣角質(zhì)形成細(xì)胞陷窩蛋白1表達(dá)、增殖和凋亡檢測（±s）

表2 尖銳濕疣角質(zhì)形成細(xì)胞陷窩蛋白1表達(dá)、增殖和凋亡檢測（±s）

組別 例數(shù) 陷窩蛋白1（A值） 增殖指數(shù)（%） 凋亡指數(shù)（%）尖銳濕疣組 40 0.042±0.021 65.63±19.80 24.12±10.86正常包皮組 10 0.181±0.075 23.51±4.00 3.13±1.12 t值 5.843 12.440 11.970 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

4.siRNA篩選和驗(yàn)證：熒光定量PCR檢測顯示，siRNA-1在濃度25、50和100 nmol/L下的抑制率 分 別 為 68.90%、51.92%和 66.52%，siRNA-2分 別 為 84.32%、80.61%和75.49%，siRNA-3分 別 為 60.65%、59.27%和51.31%。siRNA-2在濃度為25 nmol/L下抑制效果最好，選擇這個(gè)序列和濃度進(jìn)行后序?qū)嶒?yàn)。有效siRNA轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染非特異序列的細(xì)胞為陰性對照組，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為空白對照組。Western印跡結(jié)果，㈦陰性對照組和空白對照組相比，實(shí)驗(yàn)組HaCaT細(xì)胞陷窩蛋白1蛋白顯著表達(dá)下降（P＜0.05），見圖4。免疫熒光顯示，㈦陰性對照組和空白對照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯較淺，顯示陷窩蛋白1含量顯著減少，見圖5。

5.下調(diào)陷窩蛋白1表達(dá)對HaCaT細(xì)胞增殖的影響：㈦空白對照組和陰性對照組相比，實(shí)驗(yàn)組HaCaT細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24、48和72 h后，增殖均顯著上升（P＜0.05）?？瞻讓φ战M和陰性對照組細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)增殖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表3。

圖4 Western印跡檢測HaCaT細(xì)胞中陷窩蛋白1的表達(dá)水平

6.下調(diào)陷窩蛋白1表達(dá)對HaCaT細(xì)胞凋亡的影響：轉(zhuǎn)染48 h后，3組HaCaT細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=538.45，P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組（8.90%± 0.06%）低于空白對照組（20.59%±0.87%）和陰性對照組（20.64%±0.09%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而陰性對照組和空白對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

討論

細(xì)胞質(zhì)膜微囊（caveolae）是細(xì)胞膜表面特異性的60～80 nm大小內(nèi)陷微區(qū)，介導(dǎo)細(xì)胞的內(nèi)化和胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)，是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的信使中心［2］。陷窩蛋白1是細(xì)胞質(zhì)膜微囊的主要結(jié)構(gòu)蛋白和標(biāo)志蛋白，相對分子質(zhì)量21 000～24 000，存在于許多高度分化的細(xì)胞，如上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等［3］，而在許多腫瘤細(xì)胞中缺乏或極少量表達(dá)，近年來被認(rèn)為具有腫瘤抑制作⒚［1］。研究發(fā)現(xiàn)，陷窩蛋白1通過其腳手架區(qū)Ⅱ㈦多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子相互作⒚，包括酪氨酸激酶受體、G蛋白、蛋白激酶C、表皮生長因子受體、內(nèi)皮一氧化氮合酶、整合素等，實(shí)現(xiàn)對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控［4］。在乳腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌等腫瘤中陷窩蛋白1表達(dá)明顯下降，且上調(diào)陷窩蛋白1的表達(dá)能夠抑制腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)移，陷窩蛋白1發(fā)揮抑制細(xì)胞生長、促進(jìn)凋亡的作⒚［5-8］。

圖5 免疫熒光檢測HaCaT細(xì)胞中陷窩蛋白1的表達(dá)（×100） 上層為陷窩蛋白1的免疫熒光圖，綠色熒光代表陷窩蛋白1；下層為合成了細(xì)胞核的免疫熒光圖，藍(lán)色熒光代表細(xì)胞核。實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度明顯比空白組和陰性對照組弱

表3 MTS檢測HaCaT細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖（A值，±s）

表3 MTS檢測HaCaT細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖（A值，±s）

注：n=3。a：㈦空白對照組和陰性對照組相比，均P＜0.05

尖銳濕疣的發(fā)生、發(fā)展㈦角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖和凋亡相關(guān)。HPV感染角質(zhì)形成細(xì)胞后，一方面可以通過其E6、E7基因等促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)宿主對病變細(xì)胞的凋亡作⒚；另一方面，病毒又可抑制細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞獲得⒗生化。本研究中尖銳濕疣皮損中角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和凋亡指數(shù)均較正常包皮組織升高，㈦既往研究結(jié)果一致［9-11］，而陷窩蛋白1的表達(dá)較正常包皮組顯著下降。尖銳濕疣皮損角質(zhì)形成細(xì)胞中陷窩蛋白1的表達(dá)㈦增殖指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，㈦凋亡指數(shù)則呈正相關(guān)，且下調(diào)HaCaT細(xì)胞中陷窩蛋白1的表達(dá)，能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和抑制細(xì)胞的凋亡，提示陷窩蛋白1的降低可能導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖過度，凋亡減少，繼而導(dǎo)致尖銳濕疣的發(fā)病。

Trimmer等［12］研究發(fā)現(xiàn)，陷窩蛋白1可通過抑制ERK1/2 MAPK信號通路抑制PAM212細(xì)胞的增殖，下調(diào)陷窩蛋白1表達(dá)，細(xì)胞增殖顯著增多，上調(diào)其表達(dá)則能夠降低細(xì)胞的增殖和侵襲能力。Ma等［13］發(fā)現(xiàn)，陷窩蛋白1可通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路抑制HL-60細(xì)胞的增殖，上調(diào)陷窩蛋白1可顯著抑制細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Torres等［14］證實(shí)，在NIH3T3細(xì)胞中，下調(diào)陷窩蛋白1表達(dá)引起細(xì)胞增殖升高是由于β連環(huán)素/生存素通路的激活。ERK1/ 2MAPK、PI3K/AKT/mTOR和β連環(huán)素/生存素等信號通路均已證實(shí)在尖銳濕疣中有改變，可能參㈦尖銳濕疣的發(fā)?。?5-17］。陷窩蛋白1表達(dá)降低導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞增殖加劇并抑制細(xì)胞凋亡，是否也是通過上述信號通路或者是其他通路有待進(jìn)一步研究。

尖銳濕疣角質(zhì)形成細(xì)胞中陷窩蛋白1表達(dá)下降的機(jī)制目前仍不清楚。Razani等［18］發(fā)現(xiàn)，HPV16的E6基因通過抑制P53蛋白的功能，可下調(diào)宮頸上皮細(xì)胞陷窩蛋白1的表達(dá)，從而引起宮頸上皮細(xì)胞的增殖和宮頸癌的發(fā)生。HPV是導(dǎo)致尖銳濕疣發(fā)病的主要病因，陷窩蛋白1的表達(dá)降低可能同樣由HPVE6基因所致。不過導(dǎo)致尖銳濕疣發(fā)病的HPV型別主要為6型和11型，這兩型HPV的E6基因是否同樣具有下調(diào)陷窩蛋白1表達(dá)的作⒚，尚待深入研究。

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Expression of caveolin-1 in keratinocytes and its correlation with cellular proliferation and apoptosis in condyloma acuminatum skin lesions

Xiong Hao,Li Qian,Liu Qingxiu,Chen Pingjiao,Chen Minghua,Zhang Jing, Gao Yan,Zeng Kang

Department of Dermatology,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China

ObjectiveTo investigate the expression of caveolin-1 in keratinocytes of condylomata acuminatum（CA） skin lesions,and to explore its correlation with keratinocyte proliferation and apoptosis.MethodsTissue specimens were obtained from lesions of 40 patients with CA（CA group）and normal skin of 10 healthy human controls（control group）,then fixed with formalin and embedded with paraffin.An immunohistochemical analysis was done using the EnVision system to measure the expressions of caveolin-1（expressed as absorbance value）and proliferating cell nuclear antigen（PCNA）in keratinocytes,and terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling（TUNEL）assay to evaluate apoptosis of keratinocytes in these tissue specimens.The proliferative index and apoptotic index of cells were calculated.Independent samplesttest was conducted to compare these parameters between the two groups,and Pearson correlation analysis to assess the relationship of caveolin-1 expression with proliferative index and apoptotic index.Three small interfering RNAs（siRNAs）were designed targeting the caveolin-1 gene,and transfected into HaCaT cells separately by using liposomes.Then,fluorescence-based quantitative PCR （qPCR）was performed to detect the expression of caveolin-1,so as to find the most efficient siRNA.Cultured HaCaT cells were divided into 3 groups: experimental group transfected with caveolin-1 siRNA,negative control group transfected with nonspecific siRNA,and blank control group receiving no treatment.Western blot analysis and immunofluorescence assay were carried out to quantify the protein expression of caveolin-1 in HaCaT cells at 48 hours after transfection,MTS assay was performed to evaluate proliferative activity of HaCaT cells at 24,48 and 72 hours,and flow cytometry（FCM）to detect cell apoptosis at 48 hours.ResultsCompared with the control group,the CA group showed significantly decreased caveolin-1 expression（0.042±0.021 vs.0.181±0.075,t=5.843,P＜0.001）,but increased proliferative index（65.63%±19.86%vs.23.51% ±4.00%,t=12.440,P＜0.001）and apoptotic index（24.12%±10.86%vs.3.13%±1.12%,t=11.970,P＜0.001）.The expression of caveolin-1 was negatively correlated with proliferative index（r=-0.798,P＜0.05）,but positively correlated with apoptotic index（r=0.825,P＜0.05）in CA lesions.qPCR showed that siRNA-2 at the concentration of 25 nmol/L had the strongest inhibitory effect on caveolin-1 expression.Western blot analysis and immunofluorescence assay both revealed a significant decrease in the protein expression of caveolin-1 in the experimental group compared with the blank control group and negative control group at 48 hours after transfection（bothP＜0.05）.The proliferative activity of HaCaT cells was significantly higher in the experimental group than in the blank control group and negative control group after transfection（0.563±0.013 vs.0.541±0.009 and 0.536±0.006 at 24 hours,0.628±0.006 vs.0.575±0.012 and 0.571 ±0.015 at 48 hours,0.811±0.018 vs.0.722±0.004 and 0.719±0.002 at 72 hours,allP＜0.05）,while the apoptosis rate at 48 hours was significantly lower in the experimental group than in the blank control group and negative control group（8.90%±0.06%vs.20.59%±0.87%and 20.64%±0.09%,bothP＜0.05）.In addition,no significant differences were observed in the proliferative activity or apoptosis rate between the blank control group and negative control group at any of the above time points（allP＞0.05）.ConclusionThe expression of caveolin-1 is decreased in keratinocytes of CA skin lesions,which may be associated with accelerated proliferation and decreased apoptosis of keratinocytes.

Condylomata acuminata;Caveolin 1;Keratinocytes;Apoptosis;Cell proliferation

Zeng Kang,Email:npfkzk@163.com

曾抗，Email：npfkzk@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.05.005

國家自然科學(xué)基金（81171627）

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81171627）

2015-10-09）

（本文編輯：周良佳 顏艷）