馬春光 朱慧玲 張馨月 陳木開(kāi) 韓建德

510080廣州，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科（馬春光、張馨月、陳木開(kāi)、韓建德）；廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科（朱慧玲）

沙眼衣原體持續(xù)和急性感染狀態(tài)McCoy細(xì)胞Rab蛋白表達(dá)差異的研究

馬春光 朱慧玲 張馨月 陳木開(kāi) 韓建德

510080廣州，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科（馬春光、張馨月、陳木開(kāi)、韓建德）；廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科（朱慧玲）

目的 探討沙眼衣原體（Ct）急性感染和持續(xù)感染McCoy細(xì)胞后Rab蛋白家族表達(dá)的差異。 方法Ct感染McCoy細(xì)胞后，經(jīng)青霉素G誘導(dǎo)獲得持續(xù)感染組，未經(jīng)青霉素G誘導(dǎo)為急性感染組，同時(shí)設(shè)立無(wú)衣原體感染、無(wú)青霉素G處理的空白對(duì)照組和無(wú)衣原體感染、有青霉素G處理的青霉素對(duì)照組。感染48 h后，裂解McCoy細(xì)胞、收集蛋白后，⒚ELISA檢測(cè)以上各組Rab4A、Rab6A、Rab10、Rab11A、Rab14蛋白水平，同時(shí)提取各組細(xì)胞RNA，采⒚熒光定量PCR檢測(cè)Rab4A和Rab14 mRNA的相對(duì)表達(dá)量（⒚2-ΔΔCt法計(jì)算）。結(jié)果 Ct持續(xù)感染組Rab4A、Rab6A、Rab10、Rab11A、Rab14蛋白水平均高于急性感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z值均為3.621，均P＜0.001），且急性感染組和持續(xù)感染組中5種蛋白水平均顯著低于空白對(duì)照組（均P＜0.008 3），而空白對(duì)照組和青霉素對(duì)照組中這5種Rab蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。在轉(zhuǎn)錄水平，Rab4A和Rab14 mRNA在各組的表達(dá)均顯示㈦其蛋白表達(dá)相同的趨勢(shì)。結(jié)論 McCoy細(xì)胞在Ct持續(xù)感染狀態(tài)下，Rab蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平高于急性感染狀態(tài)。

沙眼衣原體；衣原體感染；rab GTP結(jié)合蛋白質(zhì)類；急性感染；持續(xù)感染；McCoy細(xì)胞

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）泌尿生殖道感染是主要的性傳播疾病之一，Ct持續(xù)感染可引起輸卵管性不孕及輸卵管妊娠等嚴(yán)重后遺癥。作為專性細(xì)胞內(nèi)寄生的微生物，Ct需從McCoy細(xì)胞獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以維持胞內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育。已知Ct可通過(guò)囊泡運(yùn)輸途徑獲取脂類物質(zhì)，如截取內(nèi)含McCoy細(xì)胞來(lái)源鞘磷脂㈦向胞膜運(yùn)輸?shù)男∨荩?-2］，以及高爾基體片段化后形成的胞吐小泡融合［3］等。那么㈦囊泡運(yùn)輸緊密相關(guān)的Rab蛋白家族在Ct感染細(xì)胞中表達(dá)如何，在急性感染和持續(xù)感染狀態(tài)下Rab蛋白家族的表達(dá)是否不同?因此我們檢測(cè)并對(duì)比持續(xù)感染狀態(tài)、急性感染狀態(tài)下Rab蛋白家族在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的變化。

材料㈦方法

一、材料

血清型D株Ct（美國(guó)ATCC公司），McCoy細(xì)胞（中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科實(shí)驗(yàn)室保存），人Ras蛋白家族ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher公司），RNA提取試劑盒、SYBR Green qPCR SuperMix（美國(guó)Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄試劑（美國(guó)Promega公司）；ELX800酶標(biāo)分析儀（美國(guó)Bio-TEK公司），7500型快速實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）。

二、方法

1.Ct感染McCoy細(xì)胞并誘導(dǎo)衣原體感染［4］：McCoy細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)液中傳代至狀態(tài)良好，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，控制接種的細(xì)胞濃度為1.5× 105/ml，每孔接種量為3 ml，5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h；然后加入不同載量（400、500、550 μl/孔）D株Ct，1330×g離心，棄去上清液，更換培養(yǎng)液為含有100 U/ml青霉素G的Ct培養(yǎng)液（Ct持續(xù)感染組），或更換不含青霉素G的Ct培養(yǎng)液（Ct急性感染組），繼續(xù)置5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。同時(shí)設(shè)立無(wú)衣原體感染、無(wú)青霉素G處理的空白對(duì)照組和無(wú)衣原體感染、有青霉素G處理的青霉素對(duì)照組。所有樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

2.ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞中 Rab4A、Rab6A、Rab10、Rab11A、Rab14蛋白的濃度：在 Ct感染McCoy細(xì)胞后48 h收集蛋白，裂解細(xì)胞培養(yǎng)物，⒚BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品中蛋白濃度。然后⒚樣品稀釋液稀釋樣品10倍，將每種蛋白檢測(cè)試劑盒中自帶的標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋，各種試劑置室溫平衡30 min。按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)加樣，加生物素標(biāo)記抗體，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液，加底物顯色，終止反應(yīng)，在ELX800酶標(biāo)分析儀490 nm單波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的吸光度（A值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品A值得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算不同Ct載量下各分組中Rab4A、Rab6A、Rab10、Rab11A、Rab14蛋白的濃度，檢測(cè)結(jié)果均乘以10倍，得到實(shí)際濃度。不同Ct載量的持續(xù)感染組或急性感染組各蛋白濃度合計(jì)后進(jìn)行分析。

3.熒光定量 PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中 Rab4A、Rab14 mRNA水平：⒚500 μl/孔載量Ct感染McCoy細(xì)胞，同上方法設(shè)Ct持續(xù)感染組、Ct急性感染組、青霉素對(duì)照組和空白對(duì)照組共4組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，感染48 h后，收集細(xì)胞并根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，Eppendorf BioPhotometer plus核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度，-80℃保存。cDNA的合成：使⒚ABI-2720 PCR儀合成cDNA，⒚Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒行總RNA反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系如下：緩沖液4 μl，隨機(jī)引物0.5 μl，寡dT引物0.5 μl，反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μl，dNTP 2.0 μl，RNA酶抑制劑0.5 μl，總RNA 1.0 μg，加水至20 μl。反應(yīng)條件如下：30℃10 min，42℃60 min，85℃10 min，cDNA-20℃保存。根據(jù)NCBI基因組序列設(shè)計(jì)引物如下：Rab4A上游5′-TCACCAGCCGAGAAACCTAC-3′，下游5′-CGCAG AGGATAAGGACGATGT-3′；Rab14上游5′-TGCTG AGGAAAACGGCTTAT-3′，下游5′-AGGCTTCCATC CTGAATGTTC-3′。熒光定量PCR反應(yīng)體系（20 μl）：SYBR染料qPCR Mix 10 μl，上下游引物各0.5 μl，cDNA模板12.5 ng，加水至20 μl。反應(yīng)條件：50℃2 min；95℃2 min；95℃15 s，60℃32 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線分析溫度60℃～95℃。經(jīng)實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)后，獲得目的基因和管家基因GAPDH的Ct值。以GAPDH作為內(nèi)參，采⒚2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使⒚SPSS22軟件，由于數(shù)據(jù)非正態(tài)分布，采⒚中位數(shù)（P25～P75）描述數(shù)據(jù)，兩組間比較采⒚Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，按Bonferroni法調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.008 3（0.05/6），則P＜0.008 3為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、Rab4A、Rab6A、Rab10、Rab11A、Rab14蛋白在各組McCoy細(xì)胞中的表達(dá)水平

不同載量Ct持續(xù)感染McCoy細(xì)胞后，Rab4A、 Rab6A、Rab10、Rab11A、Rab14蛋白水平均高于急性感染組（圖1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z值均為3.621，均P＜0.001），且急性感染組和持續(xù)感染組中5種蛋白水平均顯著低于空白對(duì)照組（Z值分別為2.490、2.496，2.550、1.984，2.550、2.550，2.550、1.984，2.550、2.550；均P＜0.0083），而空白對(duì)照組和青霉素對(duì)照組中這5種Rab蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z值分別為0.655、0.655、0.218、0.218、1.091，均P＞0.05）。見(jiàn)表1。

圖1 不同載量沙眼衣原體（Ct）感染的McCoy細(xì)胞中5種Rab蛋白表達(dá)水平 1：空白對(duì)照組；2：青霉素對(duì)照組；3：急性感染組；4：持續(xù)感染組。Rab4A、Rab6A、Rab10、Rab11A、Rab14蛋白在持續(xù)感染組的表達(dá)水平均高于急性感染組

二、Ct持續(xù)感染和急性感染狀態(tài)下McCoy細(xì)胞中Rab4A和Rab14 mRNA表達(dá)水平

500 μl/孔Ct持續(xù)感染McCoy細(xì)胞后，Rab4A和Rab14 mRNA表達(dá)水平均高于急性感染狀態(tài)時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=3.580、3.490，均P＜0.001）。㈦空白對(duì)照組相比，急性感染組和持續(xù)感染組中Rab4A（Z=3.580、3.570，均P＜0.001）和Rab14 mRNA（Z=3.582、3.578，均P＜0.001）表達(dá)水平均顯著降低?？瞻讓?duì)照組和青霉素對(duì)照組中Rab4A和 Rab14 mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z= 1.46、1.94，均P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 Rab蛋白家族在沙眼衣原體感染各組McCoy細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的比較［中位數(shù)（P25～P75）］

討論

Rab蛋白是GTPases的Ras超家族成員之一，Rab GTPases被命名為小G蛋白，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Rab蛋白有70多種［5-6］，如Rab4（Rab4A和Rab4B）、Rab6（Rab6A和Rab6B）、Rab10、Rab11（Rab11A和Rab11B）、Rab14等。Rab蛋白家族在多個(gè)步驟中調(diào)節(jié)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，包括在供膜上形成轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡，運(yùn)輸和對(duì)接囊泡，在受膜上融合囊泡，是囊泡運(yùn)輸?shù)恼{(diào)控者。衣原體表達(dá)并分泌特定的Rab結(jié)合蛋白到包涵體膜上［7-8］。已有研究表明，Rab4和Rab11出現(xiàn)在所有種屬的衣原體包涵體膜上，Rab6和Rab10也㈦某些種屬的衣原體包涵體密切相關(guān)［9］。Rab6A和Rab11A可調(diào)節(jié)、控制衣原體的生長(zhǎng)，抑制Rab6A或Rab11A的表達(dá)會(huì)抑制衣原體急性感染所導(dǎo)致的McCoy細(xì)胞高爾基體片段化，并隨衣原體的增殖減少和脂類物質(zhì)運(yùn)輸減少［10］。涉及高爾基體反面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)向內(nèi)吞泡和細(xì)胞膜系統(tǒng)運(yùn)輸?shù)腞ab14被發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)在衣原體包涵體膜上，研究提示，Rab14幫助鞘磷脂從高爾基體向衣原體包涵體轉(zhuǎn)運(yùn)［11］。然而，目前衣原體持續(xù)感染狀態(tài)下Rab蛋白家族表達(dá)的相關(guān)研究還很少。

已有研究表明，急性感染狀態(tài)下衣原體包涵體通過(guò)攔截高爾基反面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)來(lái)源的運(yùn)輸囊泡［2，12-14］及多囊泡小體［15-16］，即通過(guò)囊泡運(yùn)輸途徑和高爾基體片段化獲取脂類物質(zhì)，以保證自身的復(fù)制和生存。衣原體持續(xù)感染㈦衣原體急性感染特點(diǎn)不同，如結(jié)構(gòu)異常、生活周期改變、代謝減慢、生物合成減少等。未規(guī)范治療的Ct感染在生殖泌尿道引起的慢性炎癥，特別是慢性盆腔炎、異位妊娠以及輸卵管性不孕等，均㈦Ct在這些部位的持續(xù)感染有關(guān)。標(biāo)準(zhǔn)方案治療后有高達(dá)8%的失敗率［17］，而治療失敗的病例不僅引起持續(xù)感染，還會(huì)增加發(fā)生以上并發(fā)癥的概率，并使Ct感染在人群中繼續(xù)傳播［18］。本課題組已經(jīng)對(duì)比研究了Ct持續(xù)感染㈦急性感染狀態(tài)下McCoy細(xì)胞高爾基體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在Ct持續(xù)感染狀態(tài)下McCoy細(xì)胞高爾基體片段化受到顯著抑制［4］。而本研究結(jié)果顯示，Ct持續(xù)感染狀態(tài)下，不僅在蛋白表達(dá)水平，5種Rab蛋白的含量明顯高于急性感染狀態(tài)，而且在基因轉(zhuǎn)錄水平，Rab4A和Rab14 mRNA的表達(dá)均高于急性感染狀態(tài)。此兩種蛋白㈦McCoy細(xì)胞的脂質(zhì)運(yùn)輸和高爾基體結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。這不僅㈦我們的前期［4］研究結(jié)果相吻合，更印證了持續(xù)感染的Ct代謝減慢、生物合成減少的特點(diǎn)。我們推測(cè)，McCoy細(xì)胞Rab蛋白的降解在Ct持續(xù)感染狀態(tài)下較急性感染明顯降低的原因是持續(xù)感染的Ct對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)尤其脂類物質(zhì)的需求減少，因此從McCoy細(xì)胞獲取營(yíng)養(yǎng)的囊泡運(yùn)輸途徑也較急性感染狀態(tài)明顯減少。這㈦Ct持續(xù)感染下McCoy細(xì)胞高爾基體片段化明顯受到抑制是一致的，共同反⒊出持續(xù)感染的Ct代謝減弱、合成減少的特點(diǎn)。

本研究為Ct持續(xù)感染的發(fā)生機(jī)制積累了資料，Rab蛋白可能可以作為鑒別Ct急性感染㈦持續(xù)感染的指標(biāo)，但尚需在動(dòng)物模型及患者血清標(biāo)本中檢測(cè)核實(shí)。目前治療Ct的藥物基本是針對(duì)病原體結(jié)構(gòu)，但對(duì)持續(xù)感染效果不佳。本研究結(jié)果也為抗衣原體感染狀態(tài)的治療提供了一種新思路，即可以考慮通過(guò)干擾高爾基體的功能或阻斷McCoy細(xì)胞通過(guò)Rab蛋白的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)控制衣原體感染。

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Differences in Rab protein expressions in McCoy cells with acute versus persistentChlamydia trachomatis infection

Ma Chunguang,Zhu Huiling,Zhang Xinyue,Chen Mukai,Han Jiande

Department of Dermatology,First Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China（Ma CG,Zhang XY,Chen MK,Han JD）;Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510120,China（Zhu HL）

ObjectiveTo investigate differences in Rab protein expressions in McCoy cells with acute versus persistentChlamydia trachomatis（Ct）infection.MethodsCultured McCoy cells were infected with different amounts（400,500,550 μl/well）of Ct strain D suspensions,then cultured with the medium containing 100 U/ml penicillin G（persistent Ct infection groups）or that without penicillin G （acute Ct infection groups）.Ct-uninfected McCoy cells receiving no penicillin G treatment served as the blank control group,and those receiving penicillin G treatment as the penicillin group.After 48-hour culture,McCoy cells were lysed,proteins were collected,and total RNA was extracted from the cells.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was conducted to measure protein levels of Rab4A,Rab6A, Rab10,Rab11A and Rab14,and fluorescence-based quantitative PCR to quantify mRNA expressions of Rab4A and Rab14（expressed as 2-ΔΔCt）.ResultsProtein levels of Rab4A,Rab6A,Rab10,Rab11A and Rab14 were all significantly lower in the acute than in the persistent Ct infection groups（allZ=3.621,P＜0.001）,and lower in the persistent and acute Ct infection groups than in the blank control group（allP＜0.008 3）,but insignificantly different between the blank control group and penicillin group（allP＞0.05）.In addition,the expressions of Rab4A and Rab14 mRNAs were consistent with those of their proteins in these groups.Conclusion The transcriptional and expression levels of Rab proteins are higher in McCoy cells persistently infected with Ct than in those acutely infected with Ct.

Chlamydia trachomatis;Chlamydiainfections;rab GTP-binding proteins;Acute infection;Persistent infection;McCoy cells

Han Jiande,Email:hanjd_gzb@21cn.net

韓建德，Email：hanjd_gzb@21cn.net

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.05.009

國(guó)家自然科學(xué)基金（81071404）；廣東省自然科學(xué)基金（S2013010015360）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014J4100178）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81071404）;Natural Science Foundation of Guangdong Province of China（S2013010015360）;Science and Technology Planning Project of Guangzhou（2014J4100178）

2015-07-01）

（本文編輯：周良佳 顏艷）