魏文芝，海平，駱桂法

（青海省食品藥品檢驗(yàn)所，青海西寧810016）

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定藏藥薩熱十三味
鵬鳥(niǎo)丸中烏頭堿類(lèi)含量

魏文芝，海平，駱桂法

（青海省食品藥品檢驗(yàn)所，青海西寧810016）

目的建立測(cè)定薩熱十三味鵬鳥(niǎo)丸中烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿含量的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。方法采用顯微特征鑒別法鑒別成藥中的鐵棒錘，色譜柱為AcQuity UPLC BEH C18柱，流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.1%甲酸溶液，梯度洗脫，采用電噴霧離子源（ESI）、正離子掃描（ES+）及多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）測(cè)定薩熱十三味鵬鳥(niǎo)丸中烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿的含量。結(jié)果薩熱十三味鵬鳥(niǎo)丸成藥粉末中可見(jiàn)鐵棒錘特征性傘狀或盔帽狀淀粉粒；烏頭堿進(jìn)樣量在13.15～2 630.00 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r=0.999 4），平均回收率為97.34%，RSD=1.79%（n=9）；次烏頭堿進(jìn)樣量在32.06～3 205.89 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r=0.999 9），平均回收率為96.09%，RSD=1.94%（n=9）；新烏頭堿進(jìn)樣量在10.23～2 046.00 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r=0.999 3），平均回收率為95.94%，RSD=1.75%（n=9）。結(jié)論該顯微鑒別法簡(jiǎn)單易操作，顯微特征明顯，結(jié)果易辨識(shí)；該烏頭堿類(lèi)含量測(cè)定方法結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于同時(shí)測(cè)定薩熱十三味鵬鳥(niǎo)丸中3種烏頭堿類(lèi)物質(zhì)的含量。

薩熱十三味鵬鳥(niǎo)丸；顯微鑒別；超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法；烏頭堿；次烏頭堿；新烏頭堿

薩熱十三味鵬鳥(niǎo)丸是藏醫(yī)習(xí)用藥物，由麝香、木香、藏菖蒲、鐵棒錘、訶子、甘草膏等13味中藥組方，具有消炎止痛、通經(jīng)活絡(luò)、醒腦開(kāi)竅的功效，主要用于治療由中風(fēng)及“白脈病”引起的口眼歪斜、麻木癱瘓、四肢關(guān)節(jié)不利，以及脈管炎、腱鞘炎、麻風(fēng)等［1］。其臨床應(yīng)用廣泛，已入選青海省2012年基本藥物目錄。鐵棒錘含有毒性生物堿類(lèi)成分烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿，三者毒性均較大，烏頭堿成人致死量為2～5 mg，從染毒到死亡只需8 min至4 h［2］，烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿小鼠靜脈注射的半數(shù)致死量（LD50）分別為0.12～0.27 mg/kg，0.477 mg/kg，0.1～0.137 mg/kg［3］。為保證制劑的安全性，筆者對(duì)薩熱十三味鵬鳥(niǎo)丸成藥中的鐵棒錘及烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿進(jìn)行了定性、定量考察。

1　儀器與試藥

1.1儀器

OLYMPUS BX-51型顯微成像儀（日本Olympus公司）；Waters AcQuity-TQD型超高效液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Waters公司）；Sartorius BS 224S型電子天平、Sartorius CP 225D型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；HY-2型調(diào)速多用振蕩器（國(guó)華電器有限公司），現(xiàn)報(bào)道如下。

1.2試藥

烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)為110720-200410），次烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)為110798-200805，含量為99.5%），新烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)為110799-200404），均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；甲醇（色譜純，Dikma公司）；甲酸（優(yōu)級(jí)純，J&K Sciencific Ltd）；異丙醇、乙醚、三氯甲烷（分析純，天津百世化工有限公司）。試驗(yàn)所用藥材由青海金訶藏藥藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)青海省食品藥品檢驗(yàn)所駱桂法主任藥師鑒定，均為正品。薩熱十三味鵬鳥(niǎo)丸樣品信息見(jiàn)表1。

表1　薩熱十三味鵬鳥(niǎo)丸樣品信息

2　方法與結(jié)果

2.1鐵棒錘顯微鑒別

分別取鐵棒錘藥材粉末和薩熱十三味鵬鳥(niǎo)丸樣品粉末少許，置載玻片上，加水合氯醛封片，置顯微鏡下觀察。結(jié)果，鐵棒錘藥材粉末與薩熱十三味鵬鳥(niǎo)丸樣品粉末中均可見(jiàn)鐵棒錘特征性淀粉粒［4-5］，呈盔帽狀、傘狀。見(jiàn)圖1。

2.2烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿含量測(cè)定

2.2.1儀器工作條件

色譜條件：色譜柱為AcQuity UPLC BEH C18柱，采用流動(dòng)相A為甲醇，B為0.1%甲酸溶液，梯度洗脫，程序見(jiàn)表2；流速：0.2 mL/min；柱溫：30℃。

表2　梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子掃描（ES+），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM，見(jiàn)表3）；毛細(xì)管電壓4.0 kV；離子源溫度140℃；去溶劑氣溫度250℃；去溶劑氣流速480 L/h；錐孔氣流速50 L/h；0～1 min，不進(jìn)入質(zhì)譜，1～3 min，進(jìn)入質(zhì)譜分析，3～20 min，不進(jìn)入質(zhì)譜。

表3　MRM監(jiān)測(cè)模式

2.2.2溶液制備

標(biāo)準(zhǔn)貯備液：分別精密稱(chēng)取烏頭堿對(duì)照品13.15 mg、次烏頭堿對(duì)照品16.20 mg及新烏頭堿對(duì)照品20.72 mg，置100 mL容量瓶中，加異丙醇-三氯甲烷（1∶1）混合溶液適量，使溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別制成每1 mL中含烏頭堿0.131 5 mg，次烏頭堿0.161 1 mg，新烏頭堿0.207 2 mg的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

圖1　顯微鑒別特征圖

供試品溶液：取樣品粉末約2.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加乙醚-三氯甲烷（1∶1）混合溶液50 mL，加氨試液6 mL，搖勻，放置過(guò)夜，濾過(guò)，濾渣加乙醚-三氯甲烷（1∶1）混合溶液50 mL，振搖1 h，濾過(guò)，濾渣用乙醚-三氯甲烷（3∶1）混合溶液洗滌3次，每次10 mL，合并濾液與洗液，70℃水浴蒸干，殘?jiān)赢惐?三氯甲烷（1∶1）混合溶液溶解，并定容至10 mL，經(jīng)0.2 μm濾膜濾過(guò)，即得。

鐵棒錘陰性對(duì)照溶液：按薩熱十三味鵬鳥(niǎo)丸處方比例稱(chēng)取缺鐵棒錘的陰性藥材粉末2.5 g，精密稱(chēng)定，照供試品溶液制備方法制備，即得。

2.2.3方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各5.0 μL，注入高效液相色譜儀，照2.2.1項(xiàng)下儀器工作條件試驗(yàn)。結(jié)果表明，其他成分對(duì)烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿測(cè)定無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

圖2　高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密量取烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，制成混合對(duì)照品線性系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（見(jiàn)表4）。分別吸取上述溶液5.0 μL，注入高效液相色譜儀，照2.2.1項(xiàng)下儀器工作條件試驗(yàn)，測(cè)定峰面積。以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿的質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，烏頭堿為Y=3.548 9 X+174.13，r=0.999 4（n=8），其進(jìn)樣量在13.15～263 0.00 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好；次烏頭堿為Y=0.849 5X+ 19.629，r=0.999 9（n=8），其進(jìn)樣量在32.06～3 205.89 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好；新烏頭堿為Y=0.323 9X+17.871，r=0.999 3（n=8），其進(jìn)樣量在10.23～2046.00ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取混合對(duì)照品溶液5.0 μL，照2.2.1項(xiàng)下儀器工作條件試驗(yàn)，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿峰面積的RSD分別為0.33%，0.89%，0.45%（n=6），表明儀器精密度良好。

表4　混合對(duì)照品線性系列標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（ng/mL）

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取供試品溶液5.0 μL，分別于4，8，12，24 h時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿峰面積的RSD分別為0.67%，0.84%，0.93%（n=4），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（批號(hào)為100101），依法平行制備供試品溶液6份，照2.2.1項(xiàng)下儀器工作條件試驗(yàn)，測(cè)定烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿峰面積，計(jì)算烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿的含量。結(jié)果得烏頭堿平均含量為8.996 4 μg/g，RSD為0.59%（n=6）；次烏頭堿平均含量為0.187 1 μg/g，RSD為1.06%（n=6）；新烏頭堿平均含量為1.691 7 μg/g，RSD為1.43%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱(chēng)取同一批樣品（批號(hào)為100101，已知烏頭堿含量為8.996 4 μg/g）9份，各0.5 g，按相當(dāng)于烏頭堿含量的80%，100%，120%分別加入烏頭堿對(duì)照品溶液2.7，3.0，3.5 mL，照2.2.1項(xiàng)下儀器工作條件試驗(yàn)，測(cè)定每份供試品中烏頭堿的含量，計(jì)算回收率；精密稱(chēng)取同一批樣品（批號(hào)為100101，已知次烏頭堿含量為0.187 1 μg/g）9份，各1.5 g，按相當(dāng)于次烏頭堿含量的80%，100%，120%分別加入次烏頭堿對(duì)照品溶液0.9，1.2，1.4 mL，照2.2.1項(xiàng)下儀器工作條件試驗(yàn)，測(cè)定每份供試品中次烏頭堿的含量，計(jì)算回收率；精密稱(chēng)取同一批樣品（批號(hào)為100101，已知新烏頭堿含量為1.691 7 μg/g）9份，各0.5 g，按相當(dāng)于新烏頭堿含量的80%，100%，120%分別加入新烏頭堿對(duì)照品溶液0.3，0.4，0.5 mL，照2.2.1項(xiàng)下儀器工作條件試驗(yàn)，測(cè)定每份供試品中新烏頭堿的含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表5。

2.2.4樣品含量測(cè)定

分別稱(chēng)取5批薩熱十三味鵬鳥(niǎo)丸樣品粉末2.5 g，照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照2.2.1項(xiàng)下儀器工作條件試驗(yàn)，測(cè)定峰面積，計(jì)算烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿的含量。結(jié)果見(jiàn)表6。

3　討論

表5　加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

表6　樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=2）

［6-12］，嘗試多種烏頭堿類(lèi)物質(zhì)的提取方法：1）供試品加0.1%氨溶液濕潤(rùn)后，加乙醚超聲處理放置過(guò)夜后濾過(guò)，揮干，殘?jiān)右译娑ㄈ荩?）供試品加氨試液濕潤(rùn)后，加乙醚振搖1 h，放置過(guò)夜后，濾過(guò)，揮干，殘?jiān)尤燃淄? mL定容；3）供試品加氨試液，加異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液超聲處理，濾液揮干，殘?jiān)赢惐?三氯甲烷（1∶1）混合溶液定容；4）供試品加乙醚-三氯甲烷（3∶1）混合溶液，加氨試液，放置過(guò)夜，濾過(guò)，濾渣70℃水浴蒸干，殘?jiān)赢惐?三氯甲烷（1∶1）混合溶液溶解并定容。試驗(yàn)結(jié)果證明，第4種方法提取效率最佳。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，薩熱十三味鵬鳥(niǎo)丸中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿含量均較低，在安全范圍內(nèi)。本試驗(yàn)為其他含有鐵棒錘藥材的中藏成藥中烏頭堿類(lèi)成分的含量考察提供了參考。

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Content Determination of Aconitine，Hypaoconitine and Mesaconitine in SareShisanweiPengniao Pills by UPLC-MS

Wei Wenzhi，Hai Ping，Luo Guifa
（Qinghai Institute For Food and Drug Control，Xining，Qinghai，China810016）

ObjectiveTo establish an UPLC-MS method for the content determination of aconitine，hypaoconitine and mesaconitine in SareShisanweiPengniao Pills.MethodsThe microscopic identification method was used to identifythe aconitum in agents；the chromatographic column was AcQuity UPLC BEH C18column，mobile phase A was methanol and mobile phase B was 0.1%formic acid，gradient elution；the electrospray ionization（ESI），positive ion scan（ES+）and multiple reaction monitoring（MRM）were used todeterminethe contents of aconitine，hypaoconitine and mesaconitine in SareShisanweiPengniao Pills.ResultsThe linear relationship was good in the range of 13.15-2 630.00 ng for aconitine（r=0.999 4），and the average recovery rate was 97.34%，RSD=1.79%（n=9）；the linear relationship was good in the range of 32.06-3 205.89 ng for hypaoconitine（r=0.999 9），and the average recovery rate was 96.09%，RSD=1.94%（n=9）；the linear relationship was good in the range of 10.23-2 046.00 ng for mesaconitine（r=0.999 3），and the average recovery rate was 95.94%，RSD=1.75%（n=9）.ConclusionThis microscopic identification method is simple and sensitive with significantly clear characteristics and easy to identify results；the UPLC-MS method is accurate and reliable with good repeatability，and can be used for the content determination aconitine，hypaoconitine and mesaconitine in SareShisanweiPengniao Pills.

SareShisanweiPengniao Pills；microscopic identification；UPLC-MS；aconitine；hypaoconitine；mesaconitine

R284.1；R286.0

A

1006-4931（2016）18-0025-05

青海省科技廳資助項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：2012-N-523。

魏文芝（1984-），女，主管藥師，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬锓治?，（電話?971-8247794（電子信箱）304436784@qq.com。

（2015-06-17）