問榮榮 馬玲 董婉瑩 王步勇

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

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魚藤酮對舞毒蛾的毒殺作用1)

問榮榮 馬玲 董婉瑩 王步勇

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

以舞毒蛾(Lymantriadispar)3齡幼蟲為對象，采用點滴觸殺法測定了植物源農(nóng)藥魚藤酮對舞毒蛾3齡幼蟲的殺蟲活性、過氧化氫酶(CAT)活性及幼蟲生長的影響。結(jié)果顯示：魚藤酮對舞毒蛾3齡幼蟲具有低毒高效的毒殺作用，12、24、36、48 h致死中濃度LC50分別為14.10、10.44、9.75、9.51 mg·L-1。CAT酶活性呈現(xiàn)先上升后下降的波動，但均顯著高于對照(p<0.05)，表現(xiàn)出一定的抗逆性。對舞毒蛾3齡幼蟲進(jìn)行點滴觸殺處理后，試蟲的鮮質(zhì)量增長率顯著低于對照(p<0.05)，表明魚藤酮抑制舞毒蛾幼蟲的生長。

魚藤酮；舞毒蛾；過氧化氫酶

We used the tag method to determine the toxicity of rotenone to the 3 rd-instarLymantriadisparlarvae by bioactivity, the CAT activity and the fresh weight changes of larval. The rotenone had effective toxic effect on the 3 rd-instarL.disparlarvae, and 12, 24, 36 and 48 h LC50of rotenone for the 3 rd-instar larvae were 14.10, 10.44, 9.75 and 9.51 mg/L, respectively. The CAT activity of rotenone treatment group was increased first and then decreased, and obviously higher than that of normal control group (p<0.05) with resistance. Compared with ddH2O and DMSO treatments, the fresh weight of 3 rd-instar gypsy moth larvae treated by rotenone were lower. The rotenone had efficient toxicity for gypsy moth.

舞毒蛾(Lymantriadispar)是一種世界性的、周期性發(fā)生的危害嚴(yán)重的森林食葉害蟲，分布廣、食性雜，國外報道可取食300多種植物，國內(nèi)報道可危害楊、柳、蘋果、樟子松、落葉松等500多種植物[1]，給農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，化學(xué)防治仍是目前有效控制舞毒蛾危害的主要防治措施。常用的化學(xué)藥劑主要有高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、氧化樂果、吡蟲啉、滅幼脲III號等。其中，菊酯類藥劑常被加工成毒筆、毒紙、毒繩等，利用舞毒蛾幼蟲沿樹干遷移取食和化蛹的習(xí)性將其毒殺[2-3]。但化學(xué)農(nóng)藥的長期大量使用導(dǎo)致了嚴(yán)重的“3R”問題，即抗藥性、再增猖撅、殘留。為減少化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境的污染，植物源農(nóng)藥的開發(fā)研究和利用成為農(nóng)藥化工領(lǐng)域研究的熱點。魚藤酮作為一種植物源農(nóng)藥具有作用方式多樣，殺蟲活性廣譜，對人類及動物低毒，對農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品安全等特點，被廣泛應(yīng)用于果樹、蔬菜、糧食作物、茶葉、花卉害蟲的防治[4]。本研究以林業(yè)重要害蟲舞毒蛾為對象，研究了植物源農(nóng)藥魚藤酮對舞毒蛾的殺蟲活性、過氧化氫酶活性及幼蟲生長發(fā)育的影響，為魚藤酮應(yīng)用于鱗翅目害蟲的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

舞毒蛾卵塊采于東北林業(yè)大學(xué)涼水自然保護(hù)區(qū)，幼蟲培養(yǎng)溫度為(25±1)℃，光照條件為14 h光照、10 h黑暗，相對濕度為75%，取健康、大小一致的舞毒蛾3齡幼蟲為試蟲。

1.2 生物測定和致毒處理

采用點滴法測定植物源農(nóng)藥魚藤酮對舞毒蛾3齡幼蟲的毒力。以二甲基亞砜(DMSO)溶液配制魚藤酮(純度98%)母液，用DMSO溶液將魚藤酮母液稀釋成7～9個濃度，用微量點滴儀將稀釋液滴于試蟲的前胸背板，每頭試蟲點滴3 μL藥液，對照組點滴DMSO溶液。每處理30頭蟲，重復(fù)3次。處理后的試蟲置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，喂食小葉楊(Populussimonii)嫩葉片，觀察其中毒死亡情況。

采用點滴觸殺法進(jìn)行致毒處理。用DMSO溶液將魚藤酮母液分別配制成為5、10、20 mg·L-1的藥液，對照組分別點滴蒸餾水和DMSO溶液，分別于12、24、36、48、60、72 h隨機(jī)挑取活潑的試蟲，液氮冷凍后于-80 ℃保存，用于過氧化氫酶(CAT)酶活性的檢測，每個處理30頭試蟲，重復(fù)3次。

1.3 CAT酶活性測定

酶液制備：隨機(jī)挑取5頭處理過的舞毒蛾幼蟲加入3 mL預(yù)冷的0.05 mol·L-1PBS提取液[含0.04%苯基硫脲(PTU)、1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、10 mmol·L-1乙二胺四乙酸(EDTA)pH=7.0]于玻璃勻漿器內(nèi)冰浴充分勻漿，于4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，上清液即原酶液。

酶源蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定：參照Bradford[5]的考馬斯亮藍(lán)G-250法測定蛋白含量。取0.5 mL稀釋的適當(dāng)倍數(shù)的酶蛋白溶液加入到試管中，以提取液作為調(diào)零管，再加入2.5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250，充分混勻，室溫放置3 min后，于595 nm下測定吸光值OD595，重復(fù)3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出蛋白質(zhì)含量。

酶活性測定：用紫外分光光度法測定CAT活性[6]：取0.5～0.6 mL 30% H2O2，加水至50 mL，從中取出0.4 mL，加入2.6 mL 0.05 mol·L-1PBS(pH=7.0)，測定240 nm的OD值。如果OD值為0.50～0.55，即可作為過氧化氫酶的底物溶液，取3 mL配制的底物溶液，在25 ℃條件下加入粗酶液0.02 mL，立即用紫外分光光度計在240 nm下每隔30 s讀數(shù)1次，連續(xù)記錄3 min。

酶比活力計算：以A240減少0.1的酶量為1個酶活性單位(U)。

CAT活性=(ΔA240×VT)/(0.1×V1×T×W)。

式中：VT為粗酶提取液總體積(mL)；V1為測定用粗酶液體積；W為樣品酶液蛋白質(zhì)量濃度；T為加過氧化氫到最后1次讀數(shù)的時間。

1.4 魚藤酮對舞毒蛾幼蟲生長發(fā)育影響

取饑餓12 h并稱過鮮質(zhì)量的大小一致的3齡2天舞毒蛾幼蟲作為試蟲，用微量點滴儀將5、10 mg·L-1魚藤酮藥液點滴于試蟲的前胸背板處，對照組分別點滴蒸餾水和DMSO溶液，每頭幼蟲點滴3 μL。每處理30頭蟲，重復(fù)3次。處理后的試蟲置于恒溫培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，喂食小葉楊嫩葉片，連續(xù)3天稱量試蟲鮮質(zhì)量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用POLO軟件計算致死中濃度LC50和95%置信區(qū)間，通過SPSS16.0統(tǒng)計軟件，采用Duncan’s新復(fù)極差法比較各處理間的差異顯著性(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚藤酮對舞毒蛾幼蟲的毒力

由表1可見，魚藤酮對舞毒蛾3齡幼蟲12、24、36、48 h致死中濃度LC50分別為14.10、10.44、9.75、9.51 mg·L-1，且魚藤酮毒力隨著作用時間的增加而增大。

表1 魚藤酮對舞毒蛾幼蟲毒力測定

注：斜率數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2.2 魚藤酮對舞毒蛾幼蟲CAT活性的影響

以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物配制的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定得到蛋白標(biāo)準(zhǔn)直線方程為y=190.1x-4.972 1(R2=0.993 8)，用于酶液蛋白質(zhì)含量的測定。由表2可見，與蒸餾水相比，DMSO溶液均未引CAT活性的顯著變化。用5 mg·L-1的魚藤酮處理3齡舞毒蛾幼蟲，其CAT活性，在處理48 h時最大，為蒸餾水組的2.92倍，在處理12 h達(dá)最低，為蒸餾水處理組的1.34倍。用10 mg·L-1的魚藤酮處理3齡舞毒蛾幼蟲，CAT活性在處理36 h時最大，為蒸餾水組的3.30倍，在處理24 h達(dá)最低，為蒸餾水處理組的1.23倍。用20 mg·L-1的魚藤酮處理3齡舞毒蛾幼蟲，CAT活性在處理36 h時最大，為蒸餾水組的3.82倍，在處理12 h達(dá)最低，為蒸餾水處理組的1.31倍。5、10、20 mg·L-1的魚藤酮藥液處理3齡舞毒蛾幼蟲后，CAT活性均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，處理12 h均未引起CAT活性的顯著變化，而在24、36、48、60、72 h均引起CAT活性的顯著增加(p<0.05)。

表2 魚藤酮對舞毒蛾幼蟲CAT活性的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。不同字母表示同一時間不同處理間差異顯著(p<0.05)。

2.4 魚藤酮對舞毒蛾幼蟲生長發(fā)育的影響

蒸餾水與DMSO溶液處理舞毒蛾3齡幼蟲后，幼蟲鮮質(zhì)量變化趨勢較一致：處理1 d，幼蟲鮮質(zhì)量增長率分別為29.75%和41.30%；處理2 d，幼蟲鮮質(zhì)量增長率分別為109.72%和110.14%；處理3 d，幼蟲鮮質(zhì)量增長率分別為125.46%和126.57%。與蒸餾水處理組相比，5、10 mg·L-1魚藤酮藥液處理1～2 d時，3齡幼蟲鮮質(zhì)量增長較為緩慢，在處理1 d時，鮮質(zhì)量增長率分別為4.55%和3.26%，處理2 d時，鮮質(zhì)量增長率分別為35.10%和19.25%；處理3 d時，幼蟲鮮質(zhì)量增長加快，分別為94.44%和62.87%，但仍低于蒸餾水和DMSO溶液處理組的增長率。5、10 mg·L-1魚藤酮藥液處理3齡幼蟲3 d后，幼蟲鮮質(zhì)量均顯著低于蒸餾水與DMSO溶液處理組，說明植物源殺蟲劑魚藤酮對舞毒蛾幼蟲生長具有抑制作用(表3)。

表3 魚藤酮對舞毒蛾幼蟲鮮質(zhì)量的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。不同字母表示同一時間不同處理間差異顯著(p<0.05)。

3 結(jié)論與討論

魚藤酮是早期人們從豆科藤本植物中提取的一種天然殺蟲劑，主要來源于豆科的魚藤屬(Derris)、灰毛豆屬(Tephrosia)、尖莢豆屬(Lonchocarpus)、雞血藤屬(Millettia)、黃檀屬(Dalbergia)、毒魚豆屬(Piscidia)和蝶豆屬(Clitoria)等植物[7-9]，其中對魚藤屬和灰毛豆屬植物研究較為深入，是三大傳統(tǒng)植物源殺蟲劑之一。魚藤酮的作用方式較多，它對一些鱗翅目昆蟲有強(qiáng)烈的觸殺作用和胃毒作用，對儲糧害蟲有拒食作用[10-11]，也可作為熏蒸劑使用，具有廣譜的殺蟲活性，可防治15個目137個科的800余種害蟲[12-14]，對螨類、蚜蟲、菜粉蝶等害蟲都有優(yōu)良的防治效果[15]。本試驗的研究結(jié)果顯示,魚藤酮對舞毒蛾3齡幼蟲具有低毒高效的觸殺作用，12、24、36、48 h致死中濃度LC50分別為14.10、10.44、9.75、9.51 mg·L-1，且魚藤酮毒力隨作用時間的增加而增強(qiáng)。

早期研究表明，魚藤酮主要作用于電子傳遞、氧化磷酸化及三羧酸循環(huán)(TCA)等內(nèi)呼吸過程[16]，影響昆蟲的呼吸作用。它能直接通過氣孔、表皮等部位進(jìn)入蟲體，迅速抑制線粒體呼吸，中毒癥狀表現(xiàn)快速。生物體在逆境中體內(nèi)具有強(qiáng)氧化能力的自由基活性增加，這些自由基對很多生物功能分子起破壞作用。正常情況下，昆蟲體內(nèi)有超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶能使自由基保持在低水平，以防止其毒害，是一種動態(tài)平衡的狀態(tài)，一旦受到外界刺激，昆蟲體內(nèi)抗氧化酶活性發(fā)生變化。本試驗發(fā)現(xiàn)，給舞毒蛾3齡幼蟲施藥后，試蟲體內(nèi)CAT活性整體呈增強(qiáng)趨勢，呈現(xiàn)先上升后又下降的波動，最低值為蒸餾水處理組的1.23倍。最高值為蒸餾水組的3.82倍。5、10、20 mg·L-1魚藤酮藥液處理試蟲12 h均未引起CAT活性的顯著變化，隨作用時間的增長，CAT活性逐漸增強(qiáng)，說明CAT活性的激發(fā)具有時間效應(yīng)。低質(zhì)量濃度的魚藤酮是否能夠誘導(dǎo)試蟲體內(nèi)過氧化氫酶基因的過表達(dá)，從而引起CAT活性的增加，有待于進(jìn)一步研究。

魚藤酮能夠使害蟲細(xì)胞內(nèi)的電子傳遞鏈?zhǔn)艿揭种?，迫使電子傳遞途徑中斷，氧化-還原反應(yīng)也不能順利進(jìn)行，促使生物體內(nèi)ATP含量降低，使害蟲因不能得到能量供應(yīng)而出現(xiàn)麻痹、行動遲緩癥狀，并逐漸死亡。魚藤酮還可以使細(xì)胞中紡錘體微管的組裝受到抑制，并已有相關(guān)研究證實。從細(xì)胞遺傳學(xué)角度看，微管形成受到抑制必然會影響紡錘體的形成，從而影響細(xì)胞的正常分裂，魚藤酮可能通過這一途徑影響蟲體的生長[17]。張雙喜進(jìn)行了魚藤酮對菜粉蝶(Pierisrapae)作用效果的研究，由于魚藤酮能夠抑制菜粉蝶幼蟲的呼吸作用，而菜粉蝶幼蟲生長發(fā)育過程所需要的能量供給被迫減少，導(dǎo)致幼蟲蛻皮、化蛹因不能突破舊表皮而完成蛻皮化蛹形成畸形蟲態(tài)[10]。本試驗發(fā)現(xiàn)，對舞毒蛾3齡幼蟲進(jìn)行魚藤酮藥液點滴處理后，試蟲連續(xù)3 d的鮮質(zhì)量增長率都低于蒸餾水與DMSO溶液處理組，表明魚藤酮能夠抑制舞毒蛾幼蟲的生長，低質(zhì)量濃度的魚藤酮是否能夠引起試蟲體內(nèi)ATP合成酶基因表達(dá)的變化，有待于從分子水平上進(jìn)一步研究。

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Toxic Effect of Rotenone on Gypsy Moth//

Wen Rongrong, Ma Ling, Dong Wanying, Wang Buyong

(Northeast Forestry University， Harbin 150040， P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(9)：103-105 ,111.

Rotenone;Lymantriadispar; Catalase

1)國家“863”計劃項目(2013AA102701)；黑龍江省自然科學(xué)基金項目(ZD201404)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)專項(2572016AA09)。

問榮榮，女，1987年8月生，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，博士研究生，E-mail:wenrongrong87@163.com。

馬玲，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail:maling63@163.com。

2016年3月25日。

S763.3

責(zé)任編輯：程 紅。