胡文祥，楊幗一， 劉 童， 趙惠賢,2， 劉香利,2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊陵 712100； 2.旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西楊陵 712100)

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二穗短柄草成熟胚再生體系建立及農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化研究

胡文祥1，楊幗一1， 劉 童1， 趙惠賢1,2， 劉香利1,2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊陵 712100； 2.旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西楊陵 712100)

為建立二穗短柄草組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化體系，以二穗短柄草BD21-3成熟胚為外植體，對(duì)成熟胚愈傷誘導(dǎo)、分化以及農(nóng)桿菌侵染條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，在含有2.5 mg·L-12，4-D的培養(yǎng)基上，愈傷組織出愈率最高為93.83%；在含有0.2 mg·L-1KT的分化培養(yǎng)基上，分化率最高為38.18%；對(duì)二穗短柄草胚性愈傷組織農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和GUS染色結(jié)果表明，侵染的過(guò)程中農(nóng)桿菌菌液濃度OD600為0.6、侵染時(shí)間為5 min時(shí)轉(zhuǎn)化率最高。

二穗短柄草；成熟胚；愈傷組織；農(nóng)桿菌

擬南芥作為重要的模式植物在植物基因功能研究中起著非常重要的作用，但擬南芥屬于雙子葉植物,其與單子葉植物在進(jìn)化上關(guān)系較遠(yuǎn)，而許多禾谷類(lèi)植物的性狀,如抗病性、穗與穎殼發(fā)育相關(guān)基因分析、籽粒產(chǎn)量和品質(zhì)相關(guān)基因功能驗(yàn)證等研究，以擬南芥為模擬植物就有一定的限制和不足。水稻(Oryzasativa)作為第一個(gè)完成全基因組測(cè)序的禾本科植物，具有基因組小、功能基因組資源廣泛等多方面的優(yōu)勢(shì)[1-2]。但水稻由于生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求高，尤其是在高產(chǎn)基因試驗(yàn)方面要求更高，且它很早就從冷季型禾本科中分離出來(lái)，其作為禾本科其他亞科的模式植物就有一定的局限性[3]。因此，需要尋找一種新型的、更合適的禾草模式植物。

二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)屬于禾本科早熟禾亞科短柄草族短柄草屬，一年生溫帶植物，與模式植物擬南芥有很多共同的特點(diǎn)：基因組小、植株矮小、自花授粉、繁殖力強(qiáng)、生長(zhǎng)周期短、遺傳資源豐富等[4-9]。擁有模式植物所必備的生物學(xué)特性，且與很多重要的谷類(lèi)作物如小麥、大麥、燕麥、玉米、水稻、高粱等以及許多牧草與草坪草有較近的親緣關(guān)系，其基因與小麥有很高的相似性和共線性[10-11]。二穗短柄草的這些特性使其成為重要的禾谷類(lèi)模式植物。

作為功能基因組研究的模式植物，其組織培養(yǎng)再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立至關(guān)重要。目前，幼胚是二穗短柄草胚性愈傷組織在組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化中使用最多的外植體。Draper等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在加有2.5 mg·L-12，4-D的LS培養(yǎng)基上，二穗短柄草ABR1的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到了45%；并初步證明了基因槍法轉(zhuǎn)化二穗短柄草的可行性。Christiansen等[12]用基因槍法獲得了二倍體二穗短柄草和多倍體二穗短柄草的轉(zhuǎn)基因植株,但其得到的轉(zhuǎn)化效率均在5%左右或更低。之后，更多學(xué)者嘗試用基因槍法轉(zhuǎn)化二穗短柄草，但基因槍轉(zhuǎn)化法最顯著的缺點(diǎn)是多拷貝插入，從而造成不規(guī)則的分離，穩(wěn)定性差，試驗(yàn)成本較高。Vogel等[9]對(duì)來(lái)源于美國(guó)國(guó)家植物種質(zhì)系統(tǒng)(NPGS)的二穗短柄草二倍體品系進(jìn)行了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化研究,發(fā)現(xiàn)3個(gè)二倍體品系的再生率為4%～11%，多倍體品系的再生率為0.4%～15%。與基因槍轉(zhuǎn)化相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化中，T-DNA插入常常是一個(gè)或最多幾個(gè)位點(diǎn)的插入。用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥和水稻的轉(zhuǎn)基因植物中，平均僅有1.5和1.4個(gè)拷貝T-DNA的插入[13-14]。農(nóng)桿菌已被用來(lái)轉(zhuǎn)化多種禾本科植物，成為某些禾本科植物轉(zhuǎn)化的常規(guī)方法[15]。

成熟胚因取材方便，生理狀態(tài)較為一致，是禾谷類(lèi)作物如小麥、水稻等轉(zhuǎn)基因研究的理想外植體。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)二穗短柄草成熟胚的再生與遺傳轉(zhuǎn)化研究報(bào)道很少[16]。因此，本試驗(yàn)以二穗短柄草品系BD21-3的成熟胚為外植體材料，通過(guò)對(duì)成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)、分化、生根以及農(nóng)桿菌侵染條件的研究，建立二穗短柄草成熟胚組織培養(yǎng)再生及轉(zhuǎn)化體系，以期為小麥等禾谷類(lèi)作物的品質(zhì)改良、遺傳轉(zhuǎn)化以及基因功能驗(yàn)證奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材 料

二穗短柄草品系BD21-3溫室種植后的成熟種子用于成熟胚培養(yǎng)；農(nóng)桿菌菌株GV3101由本研究室保存；載體選用pCAMBIA3301[內(nèi)含bar基因(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)、gus報(bào)告基因(β-葡糖苷酸酶基因)]，其T-DNA區(qū)如圖1。

35S promoter：花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子　35S promoter:Cauliflower mosaic virus圖1　pCAMBIA3301質(zhì)粒T-DNA區(qū)Fig.1　T-DNA region of pCAMBIA3301

愈傷組織誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)基：MS基本培養(yǎng)基 + 2.5 mg·L-12，4-D + 0.6 mg·L-1CuSO4+ 0.5 mg·L-1酸水解酪蛋白 + 30 g·L-1蔗糖 + 7 g·L-1瓊脂；共培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS基本培養(yǎng)基 + 2.5 mg·L-12，4-D + 0.2 mmol·L-1乙酰丁香酮 + 10 g·L-1葡萄糖(固體培養(yǎng)基另加7 g·L-1瓊脂)；愈傷組織分化培養(yǎng)基：MS基本培養(yǎng)基 + 500 mg·L-1酸水解酪蛋白 + 30 g·L-1蔗糖 + 7 g·L-1瓊脂，添加不同濃度的KT、6-BA；生根培養(yǎng)基：1/2 MS基本培養(yǎng)基 + 0.6 mg·L-1IAA + 15 g·L-1蔗糖 + 7 g·L-1瓊脂。以上培養(yǎng)基pH均為5.8，并在121 ℃下高壓滅菌20 min后備用。

1.2方 法

1.2.1種子預(yù)處理

二穗短柄草BD21-3種子于超凈工作臺(tái)中用75%乙醇消毒45 s，無(wú)菌水沖洗3～5次，然后用0.2%的次氯酸鈉消毒3～5 min，無(wú)菌水沖洗3～5次，于無(wú)菌水中浸泡過(guò)夜后在超凈工作臺(tái)中剝?nèi)〕墒炫摺?/p>

1.2.2愈傷組織誘導(dǎo)及繼代

將剝?nèi)〉亩攵瘫軧D21-3的成熟胚置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，24±2 ℃暗培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織，每2周繼代一次，2周后統(tǒng)計(jì)愈傷組織出愈率，7～8周后統(tǒng)計(jì)胚性愈傷率。

出愈率= 愈傷組織數(shù)/接種的胚數(shù)×100%

胚性愈傷率=胚性愈傷組織數(shù)/接種的胚數(shù)×100%

1.2.3愈傷組織分化及植株再生

將生長(zhǎng)7～8周的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中，24±2 ℃、光暗比16/8 條件下培養(yǎng)2～3周后觀察分化情況，統(tǒng)計(jì)分化植株。將分化后高于3 cm的幼苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根。再生率=再生綠苗數(shù)/胚性愈傷組織數(shù)×100%

1.2.4成熟胚愈傷組織的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)

胚性愈傷組織農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化：挑取含有質(zhì)粒pCAMBIA3301的農(nóng)桿菌GV3101單菌落，接種于含有50 mg·L-1卡那霉素和30 mg·L-1利福平的YEB液體培養(yǎng)基；28 ℃培養(yǎng)48 h后，按1%接種擴(kuò)大培養(yǎng)；28 ℃培養(yǎng)4～6 h后至OD600值約為0.6和0.8， 5 000 r·min-1離心5 min收集菌體；用液體的共培養(yǎng)培養(yǎng)基懸浮，分別侵染生長(zhǎng)狀態(tài)良好的胚性愈傷組織，分別侵染5 min 和15 min。侵染結(jié)束后用無(wú)菌濾紙吸干成熟胚胚性愈傷組織表面液體；將胚性愈傷組織接種到固體的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，24±2 ℃黑暗共培養(yǎng)3 d 后進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。

GUS組織化學(xué)染色：GUS組織化學(xué)檢測(cè)參照J(rèn)efferson等[17]的方法進(jìn)行。共培養(yǎng)3 d后的胚性愈傷組織用無(wú)菌水洗去表面的農(nóng)桿菌，浸入X-Gluc溶液，37 ℃保溫染色24～48 h，95%乙醇脫色，觀察藍(lán)色反應(yīng)，統(tǒng)計(jì)藍(lán)色愈傷組織數(shù)。

GUS陽(yáng)性率=出現(xiàn)藍(lán)斑愈傷數(shù)/轉(zhuǎn)化愈傷數(shù)×100%

2　結(jié)果與分析

2.1愈傷發(fā)生與胚性愈傷組織的形成

二穗短柄草BD21-3成熟胚接到繼代培養(yǎng)基上7 d左右就會(huì)形成乳白色的愈傷組織(圖2A)，愈傷組織生長(zhǎng)狀況良好。隨著不斷繼代，愈傷組織進(jìn)一步生長(zhǎng)膨大，5～7周后開(kāi)始形成淡黃色、顆粒狀的胚性愈傷組織(圖2B)。從表1可以看出，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，兩批材料的出愈率均較高，分別為92.5%和93.8%，胚性愈傷組織形成率分別為62.3%和55.2%。

A:二穗短柄草成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織;B:繼代后形成的胚性愈傷組織

A:Callus induced by the mature embryo ofBrachypodiumdistachyon；B:Embryonic callus after several rounds

圖2　成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)Fig.2　Callus induction of mature embryo表1　成熟胚的誘導(dǎo)率Table 1　Frequency of callus induction from mature embryo

2.2不同激素配比對(duì)二穗短柄草成熟胚胚性愈傷組織再生的影響

二穗短柄草成熟胚愈傷組織經(jīng)過(guò)繼代7～8周后開(kāi)始形成致密的胚性愈傷組織，將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)至加有不同濃度KT的分化培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)2周后愈傷組織逐漸分化出綠芽(圖3A)，進(jìn)一步分化形成植株(圖3B)，分化結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表2。由表2可以看出，隨著KT濃度的增加，愈傷組織分化率成先上升后降低的趨勢(shì)，在KT濃度為0.2 mg·L-1時(shí)，其再生率達(dá)到最高，為38.18%。曾嘗試在含有0.2 mg·L-1KT的分化培養(yǎng)基中加入不同濃度的6-BA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入6-BA后，胚性愈傷組織并沒(méi)有正常分化和再生，且隨著6-BA濃度的增加，褐化逐漸加深并且最終導(dǎo)致愈傷死亡。

2.3IAA對(duì)植株生根的影響

分化小苗轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基后逐漸分化形成根(圖4)，觀察10株分化小苗的生根狀況發(fā)現(xiàn)，10 d后，加入IAA的生根培養(yǎng)基中分化小苗可形成根，而不加IAA的培養(yǎng)基中的分化小苗則未出現(xiàn)根；20 d后兩種處理的分化小苗均能形成根，但加IAA的培養(yǎng)基中小苗生根數(shù)目較多(圖5)。

A:胚性愈傷組織分化出綠芽；B:胚性愈傷組織分化

A:Green buds on embryonic callus;B:Differentiation of embryonic callus

圖3胚性愈傷組織分化

Fig.3Differentiation of embryonic callus

圖4　二穗短柄草再生植株及其生根Fig.4　Regeneration and rooting of Brachypodium distachyon

圖5　不同時(shí)間下兩種培養(yǎng)基中分化小苗的生根數(shù)Fig.5　Number of roots differentialion seeding with different duration in two types medium

A:對(duì)照；B:侵染后愈傷組織

A:Control;B:Callus after infection

圖6　GUS染色Fig.6　GUS staining表2　不同KT濃度對(duì)二穗短柄草再生的影響Table 2　Effects of different concentration of KT on regeneration of Brachypodium distachyon

2.4成熟胚胚性愈傷組織的農(nóng)桿菌侵染和瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)

為了確定二穗短柄草成熟胚愈傷組織農(nóng)桿菌侵染的最適菌液濃度和侵染時(shí)間，選用生長(zhǎng)狀態(tài)良好的胚性愈傷組織，用含有GUS報(bào)告基因質(zhì)粒pCAMBIA3301的農(nóng)桿菌侵染，共培養(yǎng)3 d后進(jìn)行GUS瞬時(shí)染色。對(duì)照未染色，轉(zhuǎn)化后的愈傷組織被染成藍(lán)色(圖6)，對(duì)GUS染色后的陽(yáng)性愈傷組織進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表3。隨著侵染時(shí)間延長(zhǎng)，愈傷組織褐化增加，GUS陽(yáng)性率降低，菌液濃度OD600為0.6、侵染時(shí)間為5 min時(shí)，GUS陽(yáng)性率最高，為66.00%。

表3　不同菌液濃度與侵染時(shí)間的GUS染色結(jié)果Table 3　GUS activity under different bacterial concentration and different infection duration

3　討 論

在植物組織培養(yǎng)中，2，4-D是人們常用的、最有效的植物激素之一。低濃度的2，4-D有促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育的作用，當(dāng)2，4-D濃度為1.0～3.0 mg·L-1時(shí)，對(duì)胚性愈傷組織的形成具有非常重要的作用[18]。在早期的研究中，Bablak等[19]將3個(gè)二穗短柄草品系B200、B373和B377的成熟胚剝至N6和MS培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)加有2.5 mg·L-12，4-D的MS和N6培養(yǎng)基最適合二穗短柄草胚性愈傷組織的形成。之后，Draper等[10]以二穗短柄草ABR1幼胚為材料，研究其胚性愈傷組織誘導(dǎo)與再生，同樣發(fā)現(xiàn)在加了2.5 mg·L-12，4-D的LS培養(yǎng)基上，其胚性愈傷組織誘導(dǎo)率為45%。本研究選用了Bablak所述的含2.5 mg·L-12，4-D的MS培養(yǎng)基進(jìn)行成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)二穗短柄草BD21-3成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)率可達(dá)90%以上，且胚性愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到了50%以上，與吳雪莉等[20]以幼胚為外植體得到的愈傷組織和胚性愈傷組織研究結(jié)果相似。同時(shí)高于Draper等[10]的報(bào)道，說(shuō)明成熟胚可高效地誘導(dǎo)形成胚性愈傷組織。

在愈傷組織分化方面，Vogel等[9]報(bào)道，在0.23 mg·L-1KT下，短柄草19個(gè)基因型的幼胚愈傷組織分化率在0～90%。董 芳等[21]報(bào)道，在加有0.2 mg·L-1KT 和0.5～1.0 mg·L-16-BA下，ABR6和ABR102的幼胚最高分化率分別為64.12%和71.25%；KT較6-BA效果更明顯，6-BA濃度越高褐化現(xiàn)象越嚴(yán)重，且分化率沒(méi)有明顯提高。本試驗(yàn)對(duì)KT濃度和6-BA濃度進(jìn)行了摸索，發(fā)現(xiàn)在加有0.2 mg·L-1KT的分化培養(yǎng)基中，分化率最高達(dá)到了38.18%，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在加了6-BA的培養(yǎng)基中，胚性愈傷褐化嚴(yán)重，且分化受到嚴(yán)重抑制，最終導(dǎo)致愈傷組織死亡。

二穗短柄草遺傳轉(zhuǎn)化研究主要側(cè)重于幼胚的轉(zhuǎn)化。Vogel等[9]構(gòu)建了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，成功轉(zhuǎn)化了19個(gè)株系中的10種，其轉(zhuǎn)化率為0.4%～15%。隨后，Vogel等[22]在原有的轉(zhuǎn)化體系基礎(chǔ)上改進(jìn)了轉(zhuǎn)化方法，用濾紙?zhí)娲囵B(yǎng)基進(jìn)行共培養(yǎng)，使得最終的轉(zhuǎn)化率提高了15倍，使得二穗短柄草的遺傳轉(zhuǎn)化達(dá)到了與水稻轉(zhuǎn)化體系相同的效率[23]。本試驗(yàn)對(duì)農(nóng)桿菌侵染條件進(jìn)行了摸索，初步確定二穗短柄草BD21-3的農(nóng)桿菌侵染菌液的濃度為OD600=0.6，侵染時(shí)間為5 min，其GUS活性最高，達(dá)到了66.00%。該研究為二穗短柄草遺傳轉(zhuǎn)化以及利用二穗短柄草BD21-3進(jìn)行小麥、大麥等谷類(lèi)作物的基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。

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Establishment ofBrachypodiumdistachyonRegeneration System from Mature Embryos and the Study ofAgrobacterium-mediated Transformation

HU Wenxiang1,YANG Guoyi1,LIU Tong1,ZHAO Huixian1,2,LIU Xiangli1,2

(1.College of Life Science,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China;2.State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas,Yangling,Shaanxi 712100,China)

To establish the regeneration and genetic transformation system ofBrachypodiumdistachyon,the mature embryos ofBrachypodiumdistachyonBD21-3 were used as explant,and the factors affecting the callus induction and theAgrobacteriuminfection were studied in this research. The results showed that the frequency of callus induction was 93.83% on the basic media with 2.5 mg·L-12,4-D. The maximum regeneration frequency (38.18%) was observed on the differential media containing 0.2 mg·L-1KT. The GUS staining showed that the highest GUS activity was obtained when the concentration ofAgrobacteriumwas OD600=0.6 and infection incubation duration was 5 min.

Brachypodiumdistachyon; Mature embryo; Callus;Agrobacterium

時(shí)間：2016-05-10

2015-12-09

2016-01-04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31101205)；國(guó)家生命科學(xué)與技術(shù)人才培養(yǎng)基地大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(1310712082)

E-mail：huwenxiangapple@foxmail.com

劉香利(E-mail: liuxianglii@163.com)

S519；S330

A

1009-1041(2016)05-0589-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160510.1623.016.html