賀曉嵐，王建偉，趙繼新，李文旭，武 軍，陳新宏

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/陜西省植物遺傳工程育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100； 2.凱里學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院，貴州凱里 556011； 3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所，河南鄭州 450002)

?

濱麥蔗糖:果聚糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶(6-SFT)基因全長cDNA的克隆與生物信息學(xué)分析

賀曉嵐1，王建偉2，趙繼新1，李文旭3，武 軍1，陳新宏1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/陜西省植物遺傳工程育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100； 2.凱里學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院，貴州凱里 556011； 3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所，河南鄭州 450002)

為了挖掘和利用濱麥(Leymusmollis,2n=4x=28,JJNN)的優(yōu)良基因，以拓寬小麥非生物脅迫抗性基因資源，以濱麥為材料，利用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)從濱麥葉片中克隆到 6-SFT基因cDNA的全長序列，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，其cDNA全長為2 086 bp，開放閱讀框?yàn)? 866 bp(命名為 Lm-6-SFT)，編碼621個(gè)氨基酸；其推導(dǎo)的蛋白分子量為69.1 kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為5.18，屬于酸性蛋白。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，該基因推導(dǎo)的氨基酸序列含有SDPDG、RDP和EC結(jié)構(gòu)域。多序列比對及進(jìn)化樹分析表明，濱麥6-SFT與冰草6-SFT在氨基酸水平具有高度的序列相似性。

濱麥； 6-SFT基因；克隆；序列分析

果聚糖是蔗糖與一個(gè)或多個(gè)果糖分子相連接形成的不同鏈長的多聚體[1]。果聚糖是生物體內(nèi)一種重要物質(zhì)，不僅為植物提供生長所需能量，還在干旱、冷及高鹽等非生物脅迫下參與滲透調(diào)節(jié)[1-2]、細(xì)胞膜穩(wěn)定性維護(hù)[3]及信號傳導(dǎo)等生理過程[4-5]。在麥類作物中有三種酶參與果聚糖的合成[6]，其中，蔗糖:果聚糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶(Sucrose:fructan 6-fructosyltransferase,6-SFT)是禾本科植物果聚糖合成過程的關(guān)鍵酶[7]。非生物脅迫因子是制約植物生長發(fā)育、影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵因子。據(jù)估計(jì)，約70%的作物產(chǎn)量損失可歸因于非生物脅迫，尤其是干旱脅迫[8]。濱麥(Leymusmollis,2n=4x=28,JJNN)屬于禾本科小麥族大麥亞族賴草屬的一個(gè)異源四倍體野生種，它具有耐旱、耐寒、耐鹽堿，大穗多花、莖稈粗壯，抗多種真菌、細(xì)菌病害等優(yōu)良性狀，是小麥品種改良的優(yōu)異種質(zhì)資源之一[9]。因此，分離并利用來自濱麥的 6-SFT基因?qū)υ鰪?qiáng)作物非生物脅迫抗性具有十分重要的意義。

國內(nèi)外對果聚糖的研究可追溯到1804年，迄今為止已有兩百多年的歷史[10]。果聚糖的生理及生化特性是早期的研究焦點(diǎn)，自1995年Sprenger等[7]首次從大麥中分離到 6-SFT基因以來，目前已在多種植物如冰草[11]、小麥[12]、貓尾草[13]、雀麥草[14]、華山新麥草[15]和大賴草[16]中分離到該基因，并進(jìn)行功能驗(yàn)證研究。 6-SFT基因家族是糖基水解酶32(GH32)家族的一個(gè)分支，廣泛分布在菊科、百合科、禾本科以及主要的谷類作物[17]。雖然 6-SFT基因存在于不同物種中且不同物種中序列長度存在差異，但它們編碼的蛋白在結(jié)構(gòu)上仍有高度相似性，都具有SDPNG、RDP和EC保守結(jié)構(gòu)域及TIPL液泡定位信號[18-19]。其中，SDPNG是蔗糖結(jié)合域的活性位點(diǎn)，而天冬氨酸D是該區(qū)域的活性中心[14]；RDP是果糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)中的過渡態(tài)穩(wěn)定劑，D是其催化中心；EC主要參與蔗糖的裂解，而谷氨酸E是其活性中心，起質(zhì)子供體的作用[20-21]。麥類作物果聚糖合成酶基因的另一個(gè)特征是含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，并且第二個(gè)外顯子僅有9 bp，是目前植物中發(fā)現(xiàn)的最小外顯子[22-23]。此外，大量研究還表明，在非果聚糖積累植物中表達(dá) 6-SFT基因可提高植物的抗旱[24-25]、抗寒[14,26]及抗鹽性[25]。

目前，對禾本科植物 6-SFT基因的研究多集中在小麥、大麥和黑麥等植物上，尚缺乏在小麥近緣野生植物濱麥中有關(guān) 6-SFT基因的研究報(bào)道。由于 6-SFT基因在禾本科植物中廣泛分布，且結(jié)構(gòu)和功能上具有高度的保守性，由此可以推測，濱麥中的 6-SFT基因也可能參與對非生物逆境脅迫的抗性反應(yīng)。本研究以濱麥為材料，通過RT-PCR結(jié)合RACE法分離 6-SFT基因的cDNA序列，并對所分離的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為作物抗逆育種提供理論依據(jù)及新的候選基因。

1　材料與方法

1.1植物材料

供試材料濱麥(Leymusmollis,2n=4x=28,JJNN)由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院趙繼新老師提供，于2013年種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)原西北植物所試驗(yàn)地供基因克隆所用。

1.2濱麥蔗糖:果聚糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因( 6-SFT)的克隆

1.2.1濱麥葉片總RNA提取

利用總RNA提取試劑盒RNeasy Plant Minikit(Qiagen,Germany)提取濱麥葉片總RNA。使用SuperScript III Reverse Transcriptase(Invitrogen) cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA第一鏈。

1.2.2cDNA中間保守區(qū)的克隆

根據(jù)GenBank已報(bào)道的小麥、西爾斯山羊草、大麥、冰草、雀麥、梯牧草、偏生早熟禾、草地早熟禾、毒麥和黑麥草6-SFT蛋白氨基酸序列比對結(jié)果設(shè)計(jì)簡并引物DPsen/DPantisen(DPsen:5′-AAYGARATGYTNCARTGG-3′；DPantisen: 5′-N CCRTCNARNACNGGNAC-3′。其中，N=AcgT，Y=CT，R=Ag)。選用TaKaRa公司的LATaqwith GC Buffer進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收、純化目的片段，然后將目的片段與pMD19-T載體(TaKaRa公司)連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，最后將菌落PCR和質(zhì)粒單雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.3濱麥 6-SFT基因全長cDNA序列的克隆

參考3′-Full RACE Core Set Ver.2.0與5′-Full RACE Kit產(chǎn)品說明書設(shè)計(jì)3′-RACE和5′-RACE的特異性PCR引物GSOP3-Lm3、GSIP3-Lm3、GSOP5-Lm3和GSIP5-Lm3(GSOP3-Lm3：5′-TGAGGCTGATGTGGGCTAT-3′；GSIP3-Lm3：5′-CCTCGTCCTCGCTGCTGGTA-3 ′；GSOP5-Lm3：5′-GGTGACCAGATGACGGGATT-3′；GSIP5-Lm3： 5′-TGCACTGGACCTCAACAGC-3′)，并進(jìn)行濱麥 6-SFT基因cDNA 3′與5′端序列的克隆。其中，PCR擴(kuò)增、克隆及測序方法同1.2.2。

將中間保守區(qū)序列與5′-RACE和3′-RACE獲得的序列進(jìn)行拼接后，根據(jù)拼接序列設(shè)計(jì)用于克隆濱麥 6-SFT基因cDNA編碼區(qū)的引物L(fēng)m-6-SFT-F/Lm-6-SFT-R(Lm-6-SFT-F：5′-TCACAA TCTACCAAACTCTCTTA-3′；Lm-6-SFT-R：5′-CACTCTCCCAAACAACAATA-3′)。以1.2.1中合成的cDNA第一鏈為模板，以Lm-6-SFT-F/Lm-6-SFT-R為引物，通過PCR法擴(kuò)增濱麥 6-SFT基因編碼區(qū)序列，并通過測序進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3生物信息學(xué)分析

用NCBI ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找基因的開放讀碼框；用ProtParam (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)分析編碼蛋白的基本理化性質(zhì)；用WoLF PSORT (http://psort.hgc.jp/form.html)、MitoProt (http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html)對蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；用BlastP預(yù)測保守區(qū)和蛋白家族；用SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析蛋白信號肽序列；通過InterProscan 5(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域；選取相似性高的序列用ClustalX2進(jìn)行多序列比對；用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)Bootstrap值為1 000。

2　結(jié)果與分析

2.1濱麥 6-SFT基因的克隆及序列分析

通過RT-PCR結(jié)合RACE法擴(kuò)增到濱麥 6-SFT基因的全長cDNA，其長度約2 000 bp(圖1)。序列分析表明，濱麥 6-SFT基因的ORF長為1 866 bp，編碼621個(gè)氨基酸殘基(圖2)，含有5個(gè)N端糖基化位點(diǎn)(Asn-Xaa-Ser/Thr)，預(yù)測分子量為69.1 kDa，理論等電點(diǎn)為5.18(表1)。比較濱麥 6-SFT基因與小麥族(不同基因組)其他物種 6-SFT基因，發(fā)現(xiàn)不僅存在單堿基變異，而且序列長度也存在差異。小麥族其他物種 6-SFT基因的序列長度大多數(shù)一致，除大賴草外，均為1 851 bp，而濱麥 6-SFT基因的序列長度為1 866 bp，比小麥族其他物種該基因的序列長。濱麥與小麥族其他物種 6-SFT基因編碼蛋白分子量及等電點(diǎn)也存在差異，但等電點(diǎn)均小于6，為酸性蛋白。

M: Marker Ш; 1～7: 濱麥 6-SFT基因

1-7: 6-SFT gene fromLeymusmollis

圖1濱麥 6-SFT基因全長PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1Image of the full-length cDNA sequence of 6-SFT gene amplified fromLeymusmollis

圖2　濱麥 6-SFT基因的cDNA序列及預(yù)測的氨基酸序列Fig.2　cDNA sequence and predicted amino acid sequence of 6-SFT gene from Leymus mollis

2.2濱麥6-SFT蛋白的結(jié)構(gòu)域、保守區(qū)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

結(jié)構(gòu)功能域分析表明，濱麥6-SFT蛋白屬于糖基水解酶32家族，N端為β-螺旋模型，由5個(gè)刀片狀結(jié)構(gòu)組成，并含有伴刀豆球蛋白A凝集素/葡聚糖酶域(Concanavalin A-like lectin/glucanase domain)(圖3)。將濱麥6-SFT蛋白序列與已報(bào)道的幾個(gè)物種的6-SFT蛋白序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)濱麥6-SFT蛋白含有MSDPDG、RDP和EC結(jié)構(gòu)域，與冰草6-SFT蛋白的結(jié)構(gòu)域完全一致，而與通常認(rèn)為的糖基水解酶32家族的3個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域MSDPNG、RDP和EC存在差異(圖4)，說明6-SFT在進(jìn)化過程中相對較活躍。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果(圖5)表明，濱麥6-SFT蛋白序列與冰草 6-SFT基因推導(dǎo)的氨基酸序列親緣關(guān)系最近，相似性達(dá)87%，推測濱麥6-SFT蛋白與冰草6-SFT蛋白的功能相近。

圖3　保守模體預(yù)測結(jié)果Fig.3　Conserved motifs prediction

a: MSDPDG結(jié)構(gòu)域；b: RDP結(jié)構(gòu)域；c: EC結(jié)構(gòu)域; Ph、Lr、Lm、Ta、As、BA、Ac、Bp、PH、Ps、Pp、Lt和Lp表示對應(yīng)的序列分別來自華山新麥草、大賴草、濱麥、普通小麥、西爾斯山羊草、大麥、冰草、金雀花、貓尾草、偏生早熟禾、草地早熟禾、毒麥和多年生黑麥草。圖5中同

a:MSDPDG domain;b: RDP domain; c: EC domain; Ph,Lr,Lm,Ta,As,BA,Ac,Bp,PH,Ps,Pp,Lt and Lp represent the corresponding sequence derived fromPsathyrostachyshuashanica,Leymusracemosus,Leymusmollis,Triticumaestivum,Aegilopssearsii,Hordeumvulgaresubsp.vulgare,Agropyroncristatum,Bromuspictus,Phleumpratense,Poasecunda,Poapratensis,Loliumtemulentum,andLoliumperenne,respectively. The same as in Fig. 5

圖4濱麥6-SFT與其他物種6-SFT蛋白MSDPDG、RDP和EC結(jié)構(gòu)域序列比對

Fig.4Alignment of MSDPDG,RDP and EC domains of 6-SFT protein fromLeymusmollisand

6-SFT-like proteins from other plant species

2.3濱麥 6-SFT基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位

用WoLF PSORT軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果(表2)顯示，濱麥6-SFT蛋白主要定位在液泡內(nèi)。因此，推測該蛋白可能在液泡內(nèi)發(fā)揮作用。

3　討 論

本研究首次從濱麥中克隆到含完整編碼區(qū)序列的 6-SFT基因，序列分析表明，濱麥 6-SFT基因和小麥族其他禾本科物種中已克隆得到的 6-SFT基因相似性很高，但本研究克隆到的 6-SFT基因其cDNA編碼區(qū)序列長度(1 866 bp)與小麥族其他禾本科物種 6-SFT基因存在差異。Gao等[18]從小麥族不同基因組中分離的 6-SFT基因序列長度均為1 851 bp，岳愛琴等[23]從6份普通小麥和10份二倍體小麥分離的 6-SFT基因序列長度均為1 863 bp，He等[15]從華山新麥草中分離的 6-SFT基因序列長度為1 851 bp，賀曉嵐等[16]從大賴草中分離的 6-SFT基因序列長度為1 863 bp，Wei和Chatterton[11]從冰草分離的 6-SFT基因序列長度為1 872 bp，均與本研究克隆到的 6-SFT基因序列長度存在差異，這表明6-SFT基因在進(jìn)化過程中相對較活躍，具有物種特異性。結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，該基因的N端為β-螺旋模型，由5個(gè)刀片狀結(jié)構(gòu)組成，含有一個(gè)伴刀豆球蛋白A凝集素/葡聚糖酶域，C末端存在一個(gè)β-夾心模型。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，6-SFT蛋白屬于植物糖基水解酶家族32(GH32)。序列比對結(jié)果顯示，濱麥 6-SFT基因核苷酸序列所推導(dǎo)的氨基酸序列包含SDPDG、RDP和EC保守結(jié)構(gòu)域，與Wei和Chatterton[11]分離到的冰草 6-SFT基因核苷酸序列所推導(dǎo)的氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域完全相同，與其他物種的保守結(jié)構(gòu)域SDPNG、RDP和EC略存在差異。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，濱麥 6-SFT基因推導(dǎo)的氨基酸序列與冰草6-SFT蛋白序列親緣關(guān)系最近。因此，推測本研究分離到的濱麥 6-SFT基因功能可能與冰麥 6-SFT基因相似。蛋白亞細(xì)胞定位分析結(jié)果表明，濱麥6-SFT蛋白分布在液泡中的可能性最大，并且濱麥 6-SFT基因推導(dǎo)的氨基酸序列存在液泡定位信號TLPI。因此，推測該基因可能在液泡中發(fā)揮作用。此外，序列相似性分析結(jié)果表明，濱麥6-SFT與冰草 6-SFT基因推導(dǎo)的氨基酸序列相似性達(dá)87%，存在多處氨基酸替換、插入和缺失。以上研究結(jié)果表明，雖然 6-SFT基因在進(jìn)化過程中保持了較高的遺傳穩(wěn)定性，但是不同物種的 6-SFT基因序列差異較大。因此，分離并進(jìn)一步分析濱麥 6-SFT基因的多態(tài)性及其表達(dá)方式對揭示其抗逆性差異具有重要的研究意義。本研究為進(jìn)一步研究濱麥 6-SFT基因的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。

“★”表示本研究得到的濱麥6-SFT蛋白;Dv、Tt、Tu和AE表示對應(yīng)的序列分別來自簇毛麥、圓錐小麥、烏拉爾圖小麥和粗山羊草

“★” represents 6-SFT protein fromLeymusmollisin this study；Dv,Tt,Tu and AE represent the corresponding sequence derived fromDasypyrumvillosumL.,Triticumturgidumsubsp.durum,Triticumurartu,andAegilopstauschii,respectively

圖5　濱麥6-SFT蛋白與其他物種6-SFT蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.5　Phylogenic tree analysis of 6-SFTs from various species based on amino acid sequences表2　濱麥6-SFT蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果Table 2　The subcellular localization of 6-SFT protein from Leymus mollis

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Cloning and Bioinformatics Analysis of cDNA of Sucrose:Fructan-6-Fructosyltransferase (6-SFT) Gene fromLeymusmollis

HE Xiaolan1,WANG Jianwei2,ZHAO Jixin1,LI Wenxu3,WU Jun1,CHEN Xinhong1

(1.Shaanxi Key Laboratory of Plant Genetic Engineering Breeding,College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China; 2.College of Environment and Life Science,Kaili University,Kaili,Guizhou 556011,China;3.Institute for Wheat Research,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou,Henan 450002,China)

In order to explore the abiotic stress resistance gene ofLeymusmollis(2n=4x=28,JJNN) and broaden the abiotic stress resistance gene resources in wheat,the reverse transcription PCR (RT-PCR) and rapid-amplification of cDNA ends (RACE) techniques were used to clone a full-length cDNA sequence of Lm-6-SFT gene fromL.mollisleaves,and the bioinformatics analysis was conducted. The results showed that the full-length cDNA sequence,designated as Lm-6-SFT,with 2 086 bp in length,contains an open reading frame (ORF) with 1 866 bp. Lm-6-SFT was predicted to encode a 621 amino acids protein with molecular weight of 69.1 kDa and isoelectric point of 5.18,which belongs to the acidic protein. The deduced amino acids contain SDPDG,RDP,and EC conservative domains. Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis showed that the Lm-6-SFT protein shared high similarity with 6-SFT proteins fromAgropyroncristatum.

Leymusmollis; 6-SFT gene; Clone; Sequence analysis

時(shí)間：2016-05-10

2016-01-11

2016-02-16

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31571650)；西北農(nóng)林科技大學(xué)唐仲英育種基金項(xiàng)目

E-mail：helingzhi123@126.com

陳新宏(E-mail：cxh2089@126.com)

S512.1；S330

A

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