宋曉兵， 彭埃天， 陳 霞， 凌金鋒， 張煉輝

(1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所 廣東省植物保護新技術(shù)重點實驗室，廣州 510640；2. 廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室，廣州 510640)

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柑橘黃龍病寄主長春花愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖

宋曉兵1,2， 彭埃天1， 陳 霞1， 凌金鋒1， 張煉輝2

(1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所 廣東省植物保護新技術(shù)重點實驗室，廣州 510640；2. 廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室，廣州 510640)

以柑橘黃龍病寄主長春花為試材，研究建立長春花的組織培養(yǎng)體系。取長春花幼嫩葉片為外植體，進行外植體的消毒處理及不同激素的配方篩選，建立長春花愈傷組織誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)體系。試驗表明外植體消毒處理組合為75%乙醇處理30～45 s，0.1%氯化汞處理3 min；培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，愈傷組織誘導(dǎo)的激素組合：2,4-D 1.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1，愈傷組織增殖的激素組合：NAA 1.0 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1，長春花愈傷組織誘導(dǎo)率達到90%以上。建立了長春花愈傷組織誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)體系，對利用轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)抗病育種從而控制柑橘黃龍病具有重要意義。

長春花；愈傷組織；誘導(dǎo)；增殖

柑橘黃龍病(huanglongbing)由韌皮部桿菌屬細菌(CandidatusLiberobacter sp.)[1-2]侵染引起，是柑橘生產(chǎn)上的毀滅性病害，已成為制約柑橘產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[3]。長春花是柑橘黃龍病的寄主之一，長春花被柑橘黃龍病菌侵染過后，葉片表現(xiàn)為黃化、斑駁等癥狀，與感染黃龍病的柑橘植株癥狀極其相似，病原可在長春花篩管細胞內(nèi)大量繁殖[4]。研究建立長春花的組織培養(yǎng)體系，有助于柑橘黃龍病病原的分離培養(yǎng)[5]，對利用轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)抗病育種從而控制柑橘黃龍病具有重要意義[6]。

1　材料與方法

1.1材料

供試材料為長春花[Catharathusroseus(L.) G. Don]，采自廣東省農(nóng)業(yè)科學院綠化帶花圃，移至實驗室盆栽。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基及激素的選擇

基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。1)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+2,4-D 1.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1；2)愈傷組織增殖培養(yǎng)基：MS+NAA 1.0 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1。兩種培養(yǎng)基均加入蔗糖30 g/L，瓊脂粉7 g/L，pH值調(diào)至5.8，121℃高溫滅菌20 min。

1.2.2外植體處理

選取長春花的新生幼嫩葉片，清水沖洗30 min，然后用無菌水沖洗1次，置于無菌培養(yǎng)皿中，加入適量75%酒精浸泡30～45 s，無菌水漂洗1次后，再轉(zhuǎn)入0.1%氯化汞溶液中浸泡3 min，無菌水漂洗3次，然后用無菌剪刀將葉片切成5 mm×5 mm左右的小塊。

1.2.3愈傷組織的誘導(dǎo)

將消毒處理后的長春花葉片小塊用無菌鑷子平放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，隨后進行組織培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度27℃，暗培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d后統(tǒng)計外植體生成愈傷組織的數(shù)量，并計算誘導(dǎo)率。誘導(dǎo)率(%)=(形成愈傷組織的外植體塊數(shù)/總接種外植體的塊數(shù))×100%。

1.2.4愈傷組織的增殖

外植體脫分化形成一定大小的愈傷組織后，將愈傷組織切成小塊重新接入增殖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。

2　結(jié)果與分析

2.1外植體的選擇及處理

長春花的外植體一般可選擇幼嫩葉片、種子、葉柄、無菌苗下胚軸等[7]，唐忠海等以根、莖、葉為外植體，葉片對愈傷組織的誘導(dǎo)率高達88%，為最高，根次之，莖的誘導(dǎo)率最低[8]；嚴春艷等以幼嫩葉片為外植體，誘導(dǎo)率達90%[9]。本試驗發(fā)現(xiàn)長春花幼嫩葉片的愈傷組織誘導(dǎo)率明顯高于老葉，但是長春花葉片的內(nèi)生真菌豐富，若外植體消毒不徹底，極易污染內(nèi)生真菌，顯微鏡檢多為鐮刀菌。

4)對于共塔架設(shè)線路，為了盡量降低雙極閉鎖概率，建議接地極線進行配置絕緣時，除了考慮操作過電壓水平，還應(yīng)進行雷電過電壓校核。通過技術(shù)經(jīng)濟比較，對于±800 kV滇西北至廣東特高壓直流輸電工程共塔架設(shè)段線路，推薦采用提高接地極線絕緣配置的反事故措施，建議將由操作過電壓水平確定的9片170 mm結(jié)構(gòu)高度絕緣子提高到由雷電過電壓水平確定的15片170 mm結(jié)構(gòu)高度絕緣子。

2.2愈傷組織形成

將外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，2～3 d后葉片增厚變肥大，5～7 d后葉片開始彎曲，切口處萌發(fā)出淺白色愈傷組織(圖1)，10 d左右逐漸長滿白色至淺黃色的瘤狀愈傷組織(圖2)，再經(jīng)2周愈傷組織團直徑可達1 cm以上(圖3)。本試驗培養(yǎng)基組合長春花愈傷組織的誘導(dǎo)率達到90%以上。

2.3愈傷組織的增殖

將誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的愈傷組織團粒接種到增殖培養(yǎng)基上，2周后愈傷組織團直徑可達3 cm以上，愈傷組織結(jié)構(gòu)致密，顏色白色，生長速率較快(圖4)?；究梢詽M足轉(zhuǎn)基因試驗的需求。

圖1 長春花葉片愈傷誘導(dǎo)5～7 d

Fig 1 Leaf callus induction ofCatharathusroseusafter 5 to 7 days

圖2 長春花葉片愈傷誘導(dǎo)10 d

Fig 2 Leaf callus induction ofCatharathusroseusafter 10 days

圖3 長春花葉片愈傷誘導(dǎo)30 d

Fig 3 Leaf callus induction ofCatharathusroseusafter 30 days

圖4 長春花葉片愈傷組織的增殖

Fig 4 Proliferation ofCatharathusroseusleaf callus

3　討論

3.1外植體的消毒處理

3.2激素的選擇

研究表明植物激素NAA和2,4-D組合使用對長春花愈傷組織的誘導(dǎo)效果均較明顯，但單獨使用NAA誘導(dǎo)的愈傷組織顏色偏黃，生長緩慢[11]；KT對長春花愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng)不明顯[9]，或者單獨使用KT無愈傷組織產(chǎn)生[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，激素2,4-D在長春花愈傷組織誘導(dǎo)中有著至關(guān)重要的作用，在不添加2,4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，愈傷組織的誘導(dǎo)率低于30%。

3.3激素的用量

孫敏等研究表明2,4-D濃度較高時外植體容易褐化死亡[11]，本試驗中2,4-D濃度在1.0 mg·L-1時外植體褐化率較低，愈傷組織呈乳白色顆粒狀。郭勝娟等研究發(fā)現(xiàn)，當6-BA濃度高于3.0 mg·L-1時反而抑制愈傷組織的產(chǎn)生[12]，本試驗中6-BA濃度在2.0 mg·L-1時愈傷組織結(jié)構(gòu)疏松，生長速度較快。植物激素的種類、濃度及激素之間的配比都會影響愈傷組織的生長狀態(tài)，增加2, 4-D濃度可提高愈傷組織的生長速度，降低6-BA的濃度可降低褐化率[13]，MS培養(yǎng)基添加2,4-D 1.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1時愈傷組織誘導(dǎo)效果較好，為本試驗篩選出的最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

3.4研究意義

柑橘黃龍病由局限于韌皮部的革蘭氏陰性細菌侵染所引起，國內(nèi)外陸續(xù)有黃龍病病菌成功培養(yǎng)的報道，但至今尚未獲得廣泛認可的純培養(yǎng)[14]。趙鴻燕等將感染黃龍病的柑橘葉片消毒、勻漿，用細菌過濾器無菌抽濾后，接種于改良的液體培養(yǎng)基中，隨后涂布固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)出的病原菌對四環(huán)素有高度敏感性以及對長春花具有侵染性[15]；張景寧等以感染黃龍病的柑橘葉脈浸出液培養(yǎng)病菌，獲得的病原菌以蟲傳、針注、剝皮接種、浸根等方法接種健康的柑橘幼苗，均表現(xiàn)出典型的黃龍病癥狀[16]；Davis等利用放線菌(Propionibacteriumacnes)與黃龍病病菌共培養(yǎng)，培養(yǎng)物經(jīng)PCR檢測黃龍病菌為陽性[17]；Sechler等報道培養(yǎng)出黃龍病原菌，病菌接種至柑橘幼苗葉片，表現(xiàn)典型的黃龍病癥狀，再次分離培養(yǎng)該病原菌并利用PCR檢測，16s rDNA測序驗證為柑橘黃龍病菌[18]。

長春花是適宜柑橘黃龍病菌大量增殖的草本寄主[19]，柯穗等研究證實利用菟絲子可將柑橘黃龍病病原從感病柑橘上接種到長春花[20]，柯沖等用電鏡觀察感染柑橘黃龍病菌的長春花葉脈，發(fā)現(xiàn)在其篩管細胞中存在柑橘黃龍病病原，且數(shù)量遠比柑橘病苗上的多[21]，田亞南等利用qPCR分別檢測柑橘黃龍病菌在不同寄主中的濃度，結(jié)果表明柑橘木虱中病原菌含量最高、長春花次之、柑橘中帶菌量最少[22]。可見黃龍病菌能在長春花體內(nèi)大量增殖，研究長春花的組織培養(yǎng)體系對于黃龍病原菌的分離培養(yǎng)具有重要意義。本研究采用長春花幼嫩葉片誘導(dǎo)出愈傷組織，愈傷組織再增殖培養(yǎng)出大量的愈傷組織，建立了愈傷組織誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)體系，為今后研究柑橘黃龍病病原的分離培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)，對利用轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)抗病育種防治柑橘黃龍病具有重要意義。

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Callus induction and proliferation of citrus huanglongbing host plant Catharathus roseus (L.) G. Don

SONG Xiao-bing1,2， PENG Ai-tian1， CHEN Xia1， LING Jin-feng1， ZHANG Lian-hui2

(1.Research Institute of Plant Protection, Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou 510640； 2.Guangdong Province Key Laboratory of Microbial Signals and Disease Control， Guangzhou 510640, China)

In this study, the tissue culture system ofCatharathusroseus(L.) G. was presented. Using the young leaves ofC.roseus(L.) G. as explants, the callus induction and proliferation system ofC.roseus(L.) G. was explored through screening disinfection treatment of explants and different hormone formulation. The results showed the explants sterilization treatment combination was 75% ethanol for 30-45 s and 0.1% mercuric chloride for 3 min. The medium was MS, the hormones combination were 2,4-D 1.0 mg/L-1+NAA 1.0 mg/L-1+6-BA 2.0 mg L-1for the callus induction, and the hormones combination were NAA 1.0 mg L-1+6-BA 2.0 mg L-1for callus proliferation. The results showed that the callus induced ratio ofC.roseus(L.) G was higher than 90%. The culture system of callus induction and proliferation was established, which will be important for the resistance breeding using transgenic engineering technology to control citrus huanglongbing disease.

Catharathusroseus(L.) G. Don; callus tissue; induction; proliferation

2015-12-16；

2016-01-25

廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室開放基金(MSDC-01)；廣東省科技計劃項目(廣東省農(nóng)作物病蟲害綠色防控技術(shù)研究開發(fā)中心建設(shè))；廣東省農(nóng)業(yè)領(lǐng)域引導(dǎo)項目(2013B020309004)；廣東省公益研究與能力建設(shè)項目(2014B020203003)

宋曉兵，博士研究生，研究方向為病原細菌學,E-mail:xbsong@126.com

彭埃天，研究員，主要從事果樹病害防控等工作,E-mail:pengait@163.com

Q943.1; S436.66

A

2095-1736(2016)05-0031-03

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.05.031