李 璐， 王 璐， 陳光亮， 黃梅仙， 宋 睿， 魏 強

(安徽中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院 中西醫(yī)結(jié)合研究所，合肥 230012)

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白藜蘆醇抑制肝癌Smmc-7721細胞增殖及機制研究

李 璐， 王 璐， 陳光亮， 黃梅仙， 宋 睿， 魏 強

(安徽中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院 中西醫(yī)結(jié)合研究所，合肥 230012)

采用MTT法研究白藜蘆醇對肝癌Smmc-7721細胞增殖的影響，并采用Western blotting法分析p-Erk1/2/Erk1/2、p-mTOR/mTOR和p-Akt/Akt蛋白水平。結(jié)果表明：白藜蘆醇處理肝癌Smmc-7721細胞后，細胞活力受到明顯抑制(P< 0.001)。80 μM白藜蘆醇處理肝癌Smmc-7721細胞24 h時，細胞的p-Erk1/2/Erk1/2蛋白水平明顯降低(P= 0.009)。且白藜蘆醇處理肝癌Smmc-7721細胞72 h時，p-mTOR/mTOR蛋白水平明顯提高，但p-Akt/Akt蛋白水平卻無明顯差異。白藜蘆醇可通過Erk1/2信號途徑抑制肝癌細胞增殖。同時，白藜蘆醇可通過Akt非依賴的途徑激活mTOR信號通路，提示白藜蘆醇可調(diào)控肝癌Smmc-7721細胞的能量代謝。

肝癌；白藜蘆醇；p-Erk1/2/Erk1/2；p-mTOR/mTOR；p-Akt/Akt；能量代謝

肝癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，癌癥中病死率位于第二，療效差，由于患者年齡、性別、免疫功能、肝臟狀態(tài)、腫瘤分期等因素影響[1]，預(yù)后不佳，尋找有效的治療藥物尤為重要。白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是從虎杖等植物中分離提取的一種多酚類化合物?；⒄茸鳛槲覈鴤鹘y(tǒng)的天然中草藥，是《中國藥典》《國家藥品中藥標(biāo)準(zhǔn)》等藥典中所記載的保肝制劑類藥的常見組成成分。而白藜蘆醇作為虎杖中重要成分之一，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，具有抗炎[2]、抗氧化[3]、抗癌[4-6]、抗心肌肥大[7]等作用。但其作用機理目前卻不清楚。本文通過研究白藜蘆醇對肝癌Smmc-7721細胞活力的影響及機理，旨在探尋白藜蘆醇抗肝癌的有效靶點。

1　材料與方法

1．1材料

人肝癌Smmc-7721細胞(上海交通大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院提供)；白藜蘆醇(購自sigma)；二甲亞砜、MTT、RIPA強裂解液、Bradford蛋白定量試劑盒(均購自碧云天生物技術(shù)研究所)；兔抗人p-Akt單克隆抗體(磷酸化位點Thr308)、兔抗人Akt單克隆抗體、兔抗人p-mTOR單克隆抗體(磷酸化位點Ser2448)、兔抗人mTOR單克隆抗體、兔抗人p-Erk1/2單克隆抗體(磷酸化位點Thr 202/Tyr 204)、兔抗人Erk1/2單克隆抗體、兔抗人β-actin和兔抗人β-Tublin(均購自Cell Signaling Technology)；羊抗兔熒光二抗(美國LI-COR公司提供)；RPMI 1640培養(yǎng)基(購自Gibco)；胎牛血清(購自Hyclone)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肝癌Smmc-7721細胞按常規(guī)培養(yǎng)于含12%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取生長對數(shù)期細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 藥物處理 白藜蘆醇溶解于二甲亞砜中，終濃度100 mM于4℃保存?zhèn)溆?。分別以 5、10、20、40、80和100 μM白藜蘆醇處理細胞，以0.1% 二甲亞砜作為溶媒對照組。

1.2.3 MTT實驗 細胞以每孔5×103個密度接種于96孔板中，貼壁良好后，分別加入上述不同濃度的白藜蘆醇處理，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，另設(shè)陰性對照組和溶媒對照組。于加藥24 h、48 h和72 h后分別加20 μL MTT(終濃度5 mg/mL)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸除上清，每孔加150 μL二甲亞砜顯色，檢測490 nm的吸光度值(D490 nm)表示為細胞活力。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 蛋白提取定量及Western blotting實驗 細胞以80 μM白藜蘆醇分別處理24、48和72 h后，用RIPA強裂解液抽提蛋白，并按Bradford法進行蛋白定量。另設(shè)陰性對照組和溶媒對照組。定量后的蛋白進行SDS凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后，分別一抗4℃孵育過夜。其中p-Akt(1∶1000)、Akt(1∶1000)、p-mTOR(1∶1000)、mTOR(1∶1000)、p-Erk1/2(1∶1000)、Erk1/2(1∶1000)。以β-actin或β-Tublin作為內(nèi)參(1∶1000)。洗膜后，以熒光羊抗兔二抗(1∶10 000)于室溫孵育1 h，洗膜3次后，于Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)掃描成像，Image J軟件分析結(jié)果。實驗重復(fù)3次，取平均值。

2　結(jié)果

2.1 MTT結(jié)果

如圖1所示，白藜蘆醇處理肝癌Smmc-7721細胞24 h，僅100 μM處理組的細胞活力受到顯著抑制(P=0.005)。但隨著處理時間延長至48 h和72 h時，80 μM白藜蘆醇也明顯抑制肝癌Smmc-7721細胞活力(P< 0.001)。說明白藜蘆醇對肝癌Smmc-7721細胞活力的抑制作用具有一定的劑量-時間依賴效應(yīng)。但用較低濃度(< 80 μM)的白藜蘆醇處理24、48和72 h，均未觀察到顯著的抑制作用。

圖 1 白藜蘆醇處理肝癌Smmc-7721細胞24、48和72 h的結(jié)果Fig 1 Cell viability in Smmc-7721 cells treated with resveratrol for 24, 48 and 72 h

2.2 p-Akt/Akt蛋白水平變化

如圖2所示，80 μM白藜蘆醇處理肝癌Smmc-7721細胞24、48和72 h，細胞p-Akt/Akt蛋白水平與空白對照組和溶媒對照組相比，均未出現(xiàn)明顯差異。

圖2 80 μM白藜蘆醇處理肝癌Smmc-7721細胞 24、48和72 h p-Akt/Akt蛋白水平Fig 2 The protein level of p-Akt/Akt in Smmc-7721 cells treated with 80 μM resveratrol for 24, 48 and 72 h

圖3 80 μM白藜蘆醇處理肝癌Smmc-7721細胞 24 h、48 h和72 h p-mTOR/mTOR蛋白水平Fig 3 The protein level of p-mTOR/mTOR in Smmc-7721 cells treated with 80 μM resveratrol for 24, 48 and 72 h

2.3 p-mTOR/mTOR蛋白水平變化

如圖3所示，80 μM白藜蘆醇處理肝癌Smmc-7721細胞24 h和48 h，細胞 p-mTOR/mTOR蛋白水平與空白對照組和溶媒對照組相比，未出現(xiàn)明顯差異。但當(dāng)處理72 h時，p-mTOR/mTOR蛋白水平則出現(xiàn)明顯升高(P= 0.001)。

2.4 p-Erk1/2/Erk1/2蛋白水平變化

如圖4所示，80 μM白藜蘆醇處理肝癌Smmc-7721細胞24 h，p-Erk1/2/Erk1/2蛋白水平明顯降低(P= 0.009)。而處理48 h和72 h時，p-Erk1/2/Erk1/2蛋白水平無明顯差異。

圖4 80 μM白藜蘆醇處理肝癌Smmc-7721細胞 24、48和72 h p-Erk1/2/Erk1/2蛋白水平Fig 4 The protein level of p-Erk1/2/Erk1/2 in Smmc-7721 cells treated with 80 μM resveratrol for 24, 48 and 72 h

3 討論

近年研究表明白藜蘆醇可依靠其抗氧化性，突變作用，誘導(dǎo)第二相藥代酶，傳遞抗炎作用，以及抑制環(huán)氧合酶和過氧代氫酶功能[8]等方式，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及促進過程中都具有顯著的抗腫瘤功效。Bishayee等對二乙亞硝胺誘導(dǎo)的肝癌動物模型研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可能通過上調(diào)Nrf2核轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的相關(guān)基因表達，從而促進肝癌細胞凋亡[9]。Xu等研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可通過下調(diào)miR-151 和FAK mRNA表達發(fā)揮抗肝癌Hep G2細胞增殖的作用，且具有劑量依賴效應(yīng)[10]。這與本研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇對肝癌Smmc-7721細胞活力具有顯著的抑制作用，且具有一定的劑量-時間依賴效應(yīng)。

雖然白藜蘆醇的抗肝癌作用已經(jīng)明確，但其作用機制卻不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，80 μM白藜蘆醇處理肝癌Smmc-7721細胞24 h，細胞p-Erk1/2/Erk1/2蛋白水平明顯降低。Erk1/2是絲裂原活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路家族的一員。大量研究表明，在許多惡性腫瘤細胞中，Erk的過度活化增加了腫瘤細胞的增殖[11]和侵襲能力，影響細胞分化，抑制細胞凋亡[12-13]。研究表明阻斷Erk1/2信號通路可促進腫瘤細胞凋亡[14]。Seidman等以Erk抑制劑抑制Erk1/2活性后，能促進紫杉醇誘導(dǎo)的卵巢癌SKOV3細胞的凋亡[15]。本實驗研究表明，白藜蘆醇可能通過阻斷Erk1/2信號通路而發(fā)揮抑制腫瘤細胞活力的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇處理肝癌Smmc-7721細胞72 h時，細胞p-mTOR/mTOR水平會顯著提高，但p-Akt/Akt水平卻無顯著變化。mTOR是一種保守的酪氨酸激酶，在調(diào)節(jié)細胞增殖、生長、存活、分裂、運動和血管生成中起著關(guān)鍵作用[16]。現(xiàn)代研究表明，mTOR信號途徑磷酸化的途徑有兩條[17]：一條是PIK3/Akt/ mTOR途徑；另一條是非依賴Akt途徑，且此途徑與細胞能量代謝相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇可通過非Akt途徑激活mTOR，提示白藜蘆醇作用肝癌Smmc-7721細胞后，可調(diào)控細胞的能量代謝。

總之，本研究表明，白藜蘆醇可通過阻斷Erk1/2信號通路而發(fā)揮抑制腫瘤細胞活力的作用。此外，白藜蘆醇也可通過mTOR信號通路調(diào)控肝癌細胞的能量代謝。但在白藜蘆醇發(fā)揮抑制肝癌細胞的過程中，細胞能量代謝的調(diào)控扮演什么角色，目前還不清楚，有待進一步深入研究。

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The inhibitory effect of resveratrol in hepatocellular carcinoma Smmc-7721 cells

LI Lu, WANG Lu, CHEN Guang-liang, HUANG Mei-xian, SONG Rui, WEI Qiang

(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Anhui University of Chinese Medicine,Institute of Combined Traditional Chinese and Western Medicine, Anhui Academy of Chinese Medicine, Hefei 230012, China)

To investigate the inhibitory effect and mechanism of resveratrol in hepatocellular carcinoma cells, cell viabilities were detected by MTT assay and protein levels were detected by Western blotting. The results indicated that resveratrol significantly exhibited inhibitory effect in hepatocellular carcinoma Smmc-7721 cells. And the level of p-Erk1/2/Erk1/2 significantly decreased in cells treated with resveratrol. Furthermore, the level of p-mTOR/mTOR significantly increased in cells treated with resveratrol. But, there was no significant change in the level of p-Akt/Akt. The data suggest that resveratrol exhibits the inhibitory effect via Erk1/2 pathway in hepatocellular carcinoma cells. And resveratrol can regulate the energy metabolism via mTOR pathway in hepatocellular carcinoma cells.

liver neoplasms; resveratrol; p-Erk1/2/Erk1/2； p-mTOR/mTOR； p-Akt/Akt； energy metabolism

2015-12-16；

2015-12-23

安徽省自然科學(xué)基金項目(1408085QH171)；安徽高校省級自然科學(xué)研究項目(KJ2012Z216)；安徽中醫(yī)藥大學(xué)青年科研基金項目(2012qn06)；安徽中醫(yī)藥大學(xué)“安科生物大學(xué)生藥苑之星”科研項目(20140104)

李璐，博士，副教授，主要從事抗腫瘤藥理方面的研究，E-mail：deerlyee@hotmail.com

R966;R735.7

A

2095-1736(2016)05-0067-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.05.067