張麗娟， 楊曉明， 王 昶， 陸建英， 閔庚梅

(甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物研究所, 蘭州 730070)

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豌豆組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

張麗娟， 楊曉明， 王 昶， 陸建英， 閔庚梅

(甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物研究所, 蘭州 730070)

對(duì)近年來(lái)國(guó)內(nèi)外豌豆組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化方面的研究進(jìn)行了綜合性概述。介紹了豌豆組織培養(yǎng)過(guò)程中基因型、外植體、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、外源激素等方面的研究成果，重點(diǎn)綜述了不同激素種類、濃度及其激素的不同組合對(duì)豌豆愈傷組織誘導(dǎo)和根芽分化的影響，同時(shí)總結(jié)了豌豆轉(zhuǎn)基因方面的研究進(jìn)展，并對(duì)豌豆遺傳轉(zhuǎn)化的主要問(wèn)題和今后的研究方向進(jìn)行探討和展望。

豌豆；組織培養(yǎng)；遺傳轉(zhuǎn)化；基因型

豌豆(PisumsativumL.)具有較全面而均衡的營(yíng)養(yǎng)，易于消化吸收，兼作蔬菜飼料，可作為世界范圍內(nèi)人類和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)來(lái)源之一[1]。近年來(lái)，豌豆在食用、深加工和畜牧飼料方面發(fā)展迅猛，中國(guó)已成為世界上生產(chǎn)干豌豆的第二大國(guó)和生產(chǎn)青豌豆的第一大國(guó)[2]。但是病蟲(chóng)害和非生物脅迫等因素嚴(yán)重影響豌豆的品質(zhì)和產(chǎn)量[3]。利用組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行豌豆快速繁殖、品種改良、基因工程育種、種質(zhì)純化與保存及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)等越來(lái)越為人們所關(guān)注。傳統(tǒng)育種手段進(jìn)行豌豆改良受限于豌豆自然變異有限,轉(zhuǎn)基因技術(shù)巨大的潛能可以實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。豌豆組織培養(yǎng)及再生研究作為遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)成為研究的重點(diǎn)。本文就多年來(lái)國(guó)內(nèi)外有關(guān)豌豆組織培養(yǎng)技術(shù)及遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展進(jìn)行概述，以期對(duì)今后豌豆育種研究有所裨益。

1　豌豆組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

近年來(lái)，對(duì)豌豆的研究主要集中在通過(guò)再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行轉(zhuǎn)基因豌豆生產(chǎn)，組織培養(yǎng)技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)也用于其他豆類植物，相比其他許多作物更具優(yōu)勢(shì)。一個(gè)高效的再生體系作為通過(guò)基因工程手段導(dǎo)入外源基因進(jìn)行品種選育的研究基礎(chǔ)。這個(gè)再生系統(tǒng)必須快速、可靠、適用于多種基因型。

早在20世紀(jì)70年代，Malmberg等[4]就開(kāi)始了豌豆組織培養(yǎng)的研究。先后有通過(guò)原生質(zhì)體和一系列外植體進(jìn)行豌豆不定芽再生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生的報(bào)道。但豆科植物再生較為困難，豌豆再生的研究由于基因型決定、再生頻率低、可重復(fù)性差等原因進(jìn)展緩慢。國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者進(jìn)行豌豆組織培養(yǎng)研究多通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生和器官發(fā)生兩個(gè)途徑進(jìn)行，在豌豆組織培養(yǎng)的關(guān)鍵影響因素如基因型、外植體選擇、培養(yǎng)基類型和外源激素等研究中取得一些成果。

1.1基因型的影響

豌豆的再生途徑主要有體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑和器官發(fā)生途徑兩種：1)體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑是指體細(xì)胞在特定條件下，未經(jīng)性細(xì)胞融合而通過(guò)與合子胚胎發(fā)生類似的途徑發(fā)育出新個(gè)體的形態(tài)發(fā)生過(guò)程。外植體通過(guò)培養(yǎng)分化出胚狀體而發(fā)育成再生植株的過(guò)程。2)器官發(fā)生途徑是由外植體直接或間接通過(guò)愈傷組織階段，誘導(dǎo)出不定芽或不定根原的器官發(fā)生，包括從愈傷組織或懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞和原生質(zhì)體再生植株。在豌豆組織培養(yǎng)研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，基因型對(duì)豌豆再生的影響很大。有關(guān)基因型影響的豌豆體細(xì)胞胚胎發(fā)生和器官發(fā)生再生途徑均有報(bào)道。不同基因型體細(xì)胞胚胎發(fā)生效率不同。在對(duì)6個(gè)不同波蘭豌豆品種進(jìn)行再生研究發(fā)現(xiàn)不同品種的胚胎發(fā)生能力不同，只有3個(gè)品種形成胚狀體。其中Heiga外植體有43%響應(yīng)，而Cud Ameryki只有6%[5]。Loiseau等[6]同樣研究發(fā)現(xiàn)不同豌豆品種體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力存在差異。采用生長(zhǎng)兩周的海邊香豌豆[Lathyrusmaritimus(L.) Bigel]無(wú)菌苗可誘導(dǎo)形成大量球形胚和心形胚以及極少量魚(yú)雷胚和子葉胚[7]。Tzitzikas等[8]以4個(gè)豌豆品種(Espace,Classic, Solara and Puget)進(jìn)行植株再生的研究，結(jié)果表明4個(gè)品種體細(xì)胞胚胎發(fā)生均能再生成完整植株且是由基因型所決定。Sánchez等[9]采用豌豆品種Santa Isabel不同外植體進(jìn)行再生研究并獲得再生植株。 采用不同基因型保加利亞豌豆品種進(jìn)行再生研究，發(fā)現(xiàn)器官發(fā)生過(guò)程中其響應(yīng)存在差異[10]。以豌豆品種Espace為材料進(jìn)行器官發(fā)生的研究，再生頻率高達(dá)100%[11]。蘇承剛等[12]采用食莢型豌豆1號(hào)進(jìn)行植株再生的研究，誘導(dǎo)的再生植株移栽成活率達(dá)85%左右。研究認(rèn)為不同基因型豌豆品種Terese, Solara, Frisson and P64 (Frisson的變種) 誘導(dǎo)枝芽發(fā)生或體細(xì)胞胚胎發(fā)生與基因型有關(guān)，考慮體細(xì)胞胚胎發(fā)生可能是多細(xì)胞起源，故認(rèn)為枝芽發(fā)生的再生途徑比體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑更為可行，少數(shù)外植體可不受基因型影響進(jìn)行體細(xì)胞胚胎發(fā)生[13]。幾個(gè)波蘭豌豆栽培種誘導(dǎo)的再生植株移栽成活可提高豌豆再生率并用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化[14]。而Das等[3]最新研究結(jié)果顯示6個(gè)獨(dú)立基因型的印度紫花豌豆品種均可誘導(dǎo)大量不定芽進(jìn)行再生，再生苗成功移栽溫室發(fā)育成熟，故認(rèn)為這種豌豆再生的方法不受基因型限制。

1.2外植體的選擇

根據(jù)植物細(xì)胞全能性，理論上任何活組織在適宜的條件下都能發(fā)育成完整的植株。但是，不同生長(zhǎng)狀況、發(fā)育階段、生長(zhǎng)環(huán)境和不同的外植體存在一定的生理生化差異，因此選擇不同外植體可影響組織培養(yǎng)的形態(tài)發(fā)生。通過(guò)未成熟子葉[15]、子葉節(jié)[16]、胚軸[7]、胚[9]、愈傷組織[17]、成熟種子[11]、子葉[14]及原生質(zhì)體[19]等進(jìn)行豌豆不定芽再生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生已有報(bào)道。但植株再生體系的研究進(jìn)展緩慢且再生頻率低。一個(gè)外植體單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化幾率很低，因此一個(gè)主要目的是篩選出可形成豐富芽原基或體細(xì)胞胚的豌豆外植體，豌豆未成熟子葉被證明可作為最佳外植體。通過(guò)豌豆未成熟子葉誘導(dǎo)不定芽再生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生是個(gè)簡(jiǎn)便有效的豌豆再生方法。Griga等[15]以未成熟子葉為外植體，利用器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生進(jìn)行豌豆組織培養(yǎng)的研究。器官發(fā)生還多通過(guò)豌豆子葉節(jié)和胚軸誘導(dǎo)不定芽從而建立豌豆再生體系。以紫花豌豆未成熟子葉節(jié)和胚軸為外植體進(jìn)行試管內(nèi)再生，可誘導(dǎo)大量不定芽形成完整植株[3]。分離單個(gè)豌豆胚軸愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，不定芽嫁接到年輕的豌豆幼苗可再生成健壯植株[17]。以10個(gè)保加利亞豌豆品種胚軸為外植體進(jìn)行愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)，均具有高再生率(50%～100%)[10]。王江波[7]采用下胚軸為外植體誘導(dǎo)胚性愈傷組織。以下胚軸節(jié)段為外植體通過(guò)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量不定芽并正常生根，獲得再生植株并正常開(kāi)花結(jié)籽[13]。利用具有分生能力的帶節(jié)莖段誘導(dǎo)形成大量不定芽，進(jìn)而再生成完整植株[8]。蘇承剛等[12]以葉、莖、真葉為材料進(jìn)行外植體篩選及組織培養(yǎng)研究，試驗(yàn)結(jié)果表明豌豆帶節(jié)莖段是最佳試驗(yàn)材料。楊柯[20]發(fā)現(xiàn)莖段最易誘導(dǎo)形成愈傷組織，其細(xì)胞胚性較強(qiáng)，有利于細(xì)胞分裂和分化。以埃及豌豆栽培種下胚軸、葉片、根和成熟胚為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，其中下胚軸是愈傷增殖最佳外植體；下胚軸、葉片和未成熟子葉可作為不定芽器官發(fā)生的最佳外植體[21]。近子葉端的胚軸具有較高再生能力，然而，胚軸的存在抑制不定芽再生[22]。另外，Pniewski等[14]以子葉為外植體誘導(dǎo)形成的愈傷組織均可再生不定芽。SHAN等[18]用豌豆種子直接進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)，器官再生頻率高達(dá)100%。Sánchez等[9]利用豌豆鮮籽粒合子胚進(jìn)行再生研究。

不同的外植體器官分化能力不同，故認(rèn)為外植體是影響豌豆器官分化頻率的因素之一。未成熟胚和芽尖組織作為常用外植體不僅可進(jìn)行器官發(fā)生，也可作為體細(xì)胞胚胎發(fā)生的外植體。而Tzitzikas等[8]認(rèn)為由胚直接再生的概率較低。以不同來(lái)源29個(gè)豌豆品種莖尖，未成熟子葉和胚軸為外植體進(jìn)行體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究，莖尖、未成熟子葉可產(chǎn)生胚狀體，而胚軸胚胎發(fā)育不良。利用形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)分析形成體細(xì)胞胚與外植體有關(guān)[6]。

1.3培養(yǎng)基的影響

植物組織誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)在很大程度上取決于對(duì)培養(yǎng)基的選擇。不同培養(yǎng)基有不同特點(diǎn)，適合于不同的植物種類和接種材料。豌豆組織培養(yǎng)最常用的基本培養(yǎng)基為MS和1/2MS培養(yǎng)基，也有用B5培養(yǎng)基的[10]，還有使用MB5培養(yǎng)基即1/2MS的大量元素加上B5培養(yǎng)基的維生素。除此之外，使用其他培養(yǎng)基進(jìn)行豌豆組織培養(yǎng)還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。MB5培養(yǎng)基多用于愈傷組織誘導(dǎo)。Griga等[15]采用MB5培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo),進(jìn)而誘導(dǎo)胚胎發(fā)生。Madsen等[23]研究發(fā)現(xiàn)由薄層細(xì)胞(TCLn)誘導(dǎo)不定芽再生的植株仍舊是二倍體(2n=14)。說(shuō)明薄層細(xì)胞(TCLn)產(chǎn)生的不定芽誘導(dǎo)根的分化主要是受不定芽再生培養(yǎng)基的影響而不是生根培養(yǎng)基的影響。這個(gè)結(jié)論意味著再生培養(yǎng)基具有相當(dāng)長(zhǎng)并持久的影響。除培養(yǎng)基本身，其他添加物也會(huì)對(duì)豌豆組織培養(yǎng)產(chǎn)生不同影響。碳源作為培養(yǎng)基不可或缺的成分，在對(duì)29個(gè)不同豌豆品種進(jìn)行體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)果糖代替蔗糖時(shí)，有22個(gè)品種莖尖可產(chǎn)生更多的胚狀體。當(dāng)麥芽糖代替蔗糖時(shí)，由未成熟子葉為外植體進(jìn)行體細(xì)胞胚胎發(fā)生的品種由20個(gè)增至29個(gè)。因此，碳源在豌豆體細(xì)胞胚胎發(fā)生中起重要作用[6]。Madsen等[23]認(rèn)為1.5%或3.0%的葡萄糖或蔗糖對(duì)誘導(dǎo)芽再生和分化根的能力沒(méi)有太大影響。在芽分化培養(yǎng)基中添加硝酸銀可減少玻璃化，但同時(shí)大大降低生根率。Ozcan等[22]認(rèn)為附加AgNO3不能提高不定芽的增殖數(shù)量但能促進(jìn)不定芽形成發(fā)達(dá)的卷須和大的托葉以提高其支持能力。王江波[7]認(rèn)為NaCl對(duì)于胚性愈傷組織的誘導(dǎo)十分關(guān)鍵。

1.4外源激素植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物

不同的再生途徑和誘導(dǎo)目標(biāo)，使用的激素種類和配比也有所不同。調(diào)節(jié)外源生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的含量和比例，或分階段使用不同激素添加物不僅能誘導(dǎo)細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)，還能控制細(xì)胞分化與形態(tài)建成[24]。

1.4.1愈傷組織誘導(dǎo)

愈傷組織誘導(dǎo)中常用的激素有NAA、2,4-D和BA。Ozcan等[22]通過(guò)MS培養(yǎng)基附加0.5 mg/L 6-BA和4 mg/LNAA可誘導(dǎo)愈傷組織。在附加2 mg/L 2,4-D和1 mg/Lkin(激動(dòng)素)的MB5培養(yǎng)基上也可誘導(dǎo)愈傷組織[21]。Kosturkova等[10]則認(rèn)為只附加0.2 mM 2,4-D或5 mM BA即可誘導(dǎo)愈傷組織。將生長(zhǎng)兩周的海邊香豌豆[Lathyrusmaritimus(L.)Bigel]無(wú)菌苗下胚軸培養(yǎng)于含有1 mg/L 2,4-D,0.5 mg/L 6-BA和0.5%NaCl的MS培養(yǎng)基中，4周后將誘導(dǎo)出胚性愈傷組織。研究表明誘導(dǎo)體細(xì)胞胚適宜的2,4-D濃度為0.5 mg/L。較高濃度的2,4-D雖會(huì)阻止體細(xì)胞胚越過(guò)球形期發(fā)育,但有利于體細(xì)胞胚產(chǎn)生率的提高。體細(xì)胞胚發(fā)生的頻率會(huì)隨胚性愈傷組織開(kāi)始的幾次繼代降低，以后逐漸趨于穩(wěn)定[7]。未成熟合子胚在附加2.26 mM 2,4-D的培養(yǎng)基中可誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織[25]。而Sánchez[9]認(rèn)為合子胚在附加1至2.5 mg/L BAP的光照條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)效果最佳。蘇承剛等[12]研究結(jié)果表明，在附加1 mg/L 6-BA和1 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基中，愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)100%。但通過(guò)愈傷組織途徑再生的植株比直接再生植株發(fā)生體細(xì)胞突變的概率大很多。

1.4.2誘導(dǎo)不定芽

不定芽主要起源于胚軸的表皮和皮層細(xì)胞，為外起源，形成的不定芽結(jié)構(gòu)與正常芽相同。豌豆遺傳轉(zhuǎn)化多采用不定芽再生途徑。一般在培養(yǎng)基中添加較高濃度的細(xì)胞分裂素(如BA、KT、TDZ)和較低濃度的生長(zhǎng)素類物質(zhì)(如NAA、2,4-D、IBA)能促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)和不定芽的產(chǎn)生。豌豆子葉節(jié)在附加1 mg/L BAP的MS培養(yǎng)基可誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生。通過(guò)刮擦節(jié)點(diǎn)處或提高細(xì)胞分裂素濃度增加不定芽的數(shù)量。大于5 mg/L的細(xì)胞分裂素會(huì)增加不定芽的數(shù)量但易玻璃化和不生根[17]。2 mg/L BA+1 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基是誘導(dǎo)不定芽的最佳培養(yǎng)基，未成熟子葉附加1 mg/L BA可進(jìn)行不定芽高頻增殖[21]。胚軸在附加10 mM BA和1 mM NAA的培養(yǎng)基可直接形成不定芽[10]。愈傷組織在附加4.5 mg/L BAP的MB5培養(yǎng)基可再生數(shù)個(gè)不定芽[14]。帶節(jié)莖段在附加2～3 mg/L BA和0.1 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基中,腋芽和叢生芽產(chǎn)生率達(dá)100%,芽增殖系數(shù)在3以上[12]。附加1.0 mg/L BAP和0.2 mg/L NAA每個(gè)外植體可形成22.34個(gè)芽, 附加2.0 mg/L BAP和0.4 mg/L NAA出芽率最高可達(dá)(67.55±4.74)%[3]。

TDZ作為一種新興的外源激素已被廣泛用于體細(xì)胞胚胎發(fā)生和不定芽誘導(dǎo)。顯示出細(xì)胞分裂素作用的功能特點(diǎn)，可抑制頂端分生組織生長(zhǎng)而促進(jìn)側(cè)生分生組織形成不定芽。在培養(yǎng)基中加入TDZ可以使體細(xì)胞胚胎在完整豌豆、花生和鷹嘴豆幼苗不同部位產(chǎn)生，而嘌呤型細(xì)胞分裂素BA(N6-芐基腺嘌呤)只能使芽再生，TDZ較BA具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)分生能力，這表明TDZ誘導(dǎo)的體細(xì)胞胚胎發(fā)生反應(yīng)是完全不同于細(xì)胞分裂素[26]。

在豌豆組織培養(yǎng)中，利用TDZ進(jìn)行豌豆不定芽誘導(dǎo)已得到廣泛應(yīng)用。有研究表明豌豆種子在只附加TDZ的培養(yǎng)基中可誘導(dǎo)形成大量不定芽。TDZ濃度和培養(yǎng)時(shí)間影響叢生芽的數(shù)量及不定芽成苗。添加TDZ豌豆可形成水樣組織同時(shí)產(chǎn)生不定芽。豌豆種子在附加4 mg/L TDZ的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)12周后，每粒種子產(chǎn)生的叢生枝數(shù)量可達(dá)到200多個(gè)[11]。帶有一個(gè)節(jié)點(diǎn)約(1cm size)的莖段在附加TDZ的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，產(chǎn)生大量形態(tài)正常且膨大的不定芽，經(jīng)繼代形成膨大的水漬狀含芽組織，進(jìn)而形成不定芽。研究表明從多重芽上隔離單個(gè)芽可再生成完整植株[8]。TDZ濃度為10μM時(shí)愈傷組織的芽分化率最佳。不定芽在附加腺嘌呤(N-isopentenyl adenine)和吲哚丁酸(IBA)的培養(yǎng)基中生殖生長(zhǎng)。但由TDZ誘導(dǎo)的不定芽幾乎不生根[17]。

1.4.3根的分化

一般來(lái)講，低濃度的生長(zhǎng)素(如NAA、IBA、IAA)即可誘導(dǎo)生根。不定芽在附加1 mg/L IBA的1/2MS培養(yǎng)基中易生根，進(jìn)而可進(jìn)行移栽[22]。Ghanem等[21]認(rèn)為最佳生根培養(yǎng)基是1/2MS附加40 g/L蔗糖和2 mg/L NAA。Tzitzikas等[8]認(rèn)為分別附加0.5 mg/L NAA、IAA 或IBA的生根培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)生根。不定芽在附加3 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上生根率可達(dá)86%；試管苗移栽成活率85%左右[12]。Shan等[18]發(fā)現(xiàn)不定芽在附加2～3 mg/L IAA和2 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基中可高頻生根。Das等[3]認(rèn)為不定芽在分別附加不同生長(zhǎng)素IBA、IAA、NAA的1/2MS培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)生根，且結(jié)果相似。由于前期培養(yǎng)目的不同，所使用的培養(yǎng)基、激素種類及濃度會(huì)對(duì)誘導(dǎo)生根產(chǎn)生影響。但有研究發(fā)現(xiàn)BCT在附加TDZ的培養(yǎng)基上繼代超過(guò)2年再生芽形成根的能力下降。過(guò)量的TDZ抑制根芽的分化[26]。Madsen等[23]研究發(fā)現(xiàn)豌豆長(zhǎng)期培養(yǎng)在附加TDZ或BAP的培養(yǎng)基中會(huì)抑制芽分化根的能力。培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞分裂素的添加使得細(xì)胞內(nèi)源細(xì)胞分裂素水平升高直接影響后期生根困難[27]。Pniewski等[14]認(rèn)為在附加0.02 mg/L BAP的培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽預(yù)培養(yǎng)有益于誘導(dǎo)生根或移栽，在附加1.0 mg/L NAA的生根培養(yǎng)基中生根率大大提高。TDZ可促進(jìn)乙烯產(chǎn)生，不利于苗生根，將TDZ誘導(dǎo)的苗轉(zhuǎn)移到含生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中才可能生根[28]。附加乙烯抑制劑AgNO3可促進(jìn)根的形成，適宜的AgNO3濃度可以增加根長(zhǎng)、根數(shù)和促進(jìn)根的生長(zhǎng)[29]。

2　豌豆遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

植物遺傳轉(zhuǎn)化(genetic transformation)是指以離體培養(yǎng)的植物組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體作為受體，通過(guò)某種技術(shù)途徑將人工分離和修飾過(guò)的外源基因?qū)胫参锘蚪M中使得外源基因能夠穩(wěn)定地表達(dá)，獲得的轉(zhuǎn)基因植物由于導(dǎo)入基因的表達(dá)而引起可遺傳性狀修飾的技術(shù)?；蚬こ炭梢愿牧汲Ｒ?guī)育種難以改造的性狀如品質(zhì)、抗蟲(chóng)性、抗病性、抗旱性和產(chǎn)量等。基因修飾成功與否取決于轉(zhuǎn)化細(xì)胞是否具有獨(dú)立再生能力并與所轉(zhuǎn)基因相融合，通常是通過(guò)耦合有抗生素抗性或抗除草劑的基因來(lái)實(shí)現(xiàn)。適宜的抗生素或除草劑添加到培養(yǎng)基中從而區(qū)分轉(zhuǎn)化細(xì)胞。豌豆作為重要的豆類作物，起初認(rèn)為不能進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，有關(guān)豌豆遺傳轉(zhuǎn)化的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道并不多。

2.1轉(zhuǎn)化方法的研究

植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法有很多種，如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管通道法、莖尖轉(zhuǎn)化法、PEG法、電穿孔法等。目前用于豌豆遺傳轉(zhuǎn)化的方法主要是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是以農(nóng)桿菌為中間介體，質(zhì)粒編碼的VIR蛋白將經(jīng)過(guò)或未經(jīng)過(guò)改造的T-DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞中，進(jìn)而轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。用于遺傳轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌有根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)和發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)2種，分別攜帶Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，可誘導(dǎo)產(chǎn)生冠狀瘤和毛狀根。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是植物基因工程中應(yīng)用最多、效果最理想的方法。

2.2農(nóng)桿菌菌株

農(nóng)桿菌菌株自身因素對(duì)其侵染能力有很大影響，不同菌株，不同培養(yǎng)條件侵染能力存在差異。在豌豆遺傳轉(zhuǎn)化中多采用根癌農(nóng)桿菌，使用較多的有農(nóng)桿菌菌株LBA4404、EHA101和C58。采用根癌農(nóng)桿菌C58 和ACH5，野生型發(fā)根農(nóng)桿菌9402轉(zhuǎn)化豌豆不同組織的研究中發(fā)現(xiàn)，只有經(jīng)C58和9402轉(zhuǎn)化的外植體可分別形成根瘤和發(fā)狀根[30]。Nadolska等比較了LBA4404，C58C1和EHA105 3種菌株對(duì)豌豆的轉(zhuǎn)化效率，其中LBA4404每轉(zhuǎn)化100株獲得1株轉(zhuǎn)基因植株，C58C1菌株獲得2.2株，EHA105菌株獲得8.2株，認(rèn)為EHA105的轉(zhuǎn)化效率最強(qiáng)[31]。植物遺傳轉(zhuǎn)化的研究中，農(nóng)桿菌LBA4404菌株廣譜性好, 對(duì)多種植物均有較好侵染力，且易于保存繁殖，常作為遺傳轉(zhuǎn)化的首選菌株。

2.3外源基因種類

在豌豆遺傳轉(zhuǎn)化的研究中，轉(zhuǎn)移的多數(shù)為篩選標(biāo)記GUS和NPTII。新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptII)是豌豆轉(zhuǎn)化研究中最常使用的標(biāo)記基因。潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)和抗除草劑基因(bar)等選擇標(biāo)記基因在豌豆遺傳轉(zhuǎn)化中也有使用。根據(jù)轉(zhuǎn)化時(shí)質(zhì)粒上所攜帶的標(biāo)記基因，選擇一定的抗生素進(jìn)行篩選，使轉(zhuǎn)化體與未轉(zhuǎn)化體進(jìn)行區(qū)分。另外，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將目的性狀改良的基因?qū)胪愣沟难芯恳矊⒅鸩介_(kāi)展。

Jordan等[16]構(gòu)建含有nos、gus和nptII的雙元載體，通過(guò)根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化外植體在卡那霉素選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)21 d后進(jìn)行觀察，可獲得轉(zhuǎn)基因單株。但其后代中插入基因在表達(dá)時(shí)發(fā)生分離，說(shuō)明所轉(zhuǎn)基因的遺傳和表達(dá)至少經(jīng)歷2代。構(gòu)建含有pIBGUS、一個(gè)內(nèi)含子、35S-啟動(dòng)子gusA和2個(gè)選擇標(biāo)記基因的雙元質(zhì)粒，通過(guò)高毒性農(nóng)桿菌EHA101介導(dǎo)豌豆組織細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化，農(nóng)桿菌侵染后4 d，根據(jù)GUS的活動(dòng)情況進(jìn)行檢測(cè)，gusA瞬間表達(dá)[32]。Nadolska等采用含有nptII、hpt、dhfr或bar中任一基因的雙元載體pGPTV，通過(guò)農(nóng)桿菌EHA105菌株進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)PCR和Southern雜交檢測(cè)T-DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)入下一代[31]。Petra構(gòu)建含有報(bào)告基因uidA和選擇標(biāo)記基因bar的表達(dá)載體，通過(guò)根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化豌豆外植體，經(jīng)抗性選擇獲得uidA表達(dá)的再生芽。最后轉(zhuǎn)化株生根并成功移栽[33]。王秀峰[34]首次利用基于豌豆早褐病毒(PEBV)的pCAPE1和pCAPE2-GFP表達(dá)載體，建立豌豆瞬時(shí)表達(dá)體系，抗人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(acidicfibroblastgrowthfactor,aFGF)的單鏈抗體在豌豆中瞬時(shí)表達(dá)。

2.4轉(zhuǎn)化受體的研究

轉(zhuǎn)化效率的高低除了轉(zhuǎn)化方法本身特點(diǎn)的影響外，還與受體系統(tǒng)自身的生物因素有關(guān)。不同植物、同一植物不同器官或同一器官的不同發(fā)育階段對(duì)于遺傳轉(zhuǎn)化成功與否具有重要意義。在許多作物中，抗性選擇在如愈傷組織等一致的細(xì)胞中進(jìn)行。作為受體系統(tǒng)要求具有良好的再生能力和充足的外植體來(lái)源。已報(bào)道的豌豆遺傳轉(zhuǎn)化研究中采用了多種受體系統(tǒng)材料，如豌豆子葉節(jié)[16], 胚軸[7]和未成熟子葉[15]等。Hussey[30]起初認(rèn)為豌豆芽尖是最佳轉(zhuǎn)化器官。而Kathen等[32]在探索豌豆組織細(xì)胞是否能進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化受體僅限于子葉和上胚軸去分化后的組織細(xì)胞。以子葉分生組織為外植體可重復(fù)進(jìn)行根癌桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，子葉分生組織不經(jīng)過(guò)愈傷組織階段迅速產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因芽。這個(gè)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)更有利于縮短遺傳轉(zhuǎn)化再生周期[35]。含芽組織(BCT)的再生特性也有利于進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。通過(guò)攜帶熒光素酶報(bào)告基因的根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)轉(zhuǎn)化BCT，獲得熒光素酶基因表達(dá)的BCT，進(jìn)而形成轉(zhuǎn)基因植株。通過(guò)誘導(dǎo)不定芽建立豌豆再生體系從而獲得轉(zhuǎn)基因植株，這個(gè)方法的缺點(diǎn)是再生芽的選擇效率低，轉(zhuǎn)化植株畸變率高。很大可能是分生組織復(fù)雜的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)使得單個(gè)細(xì)胞獨(dú)立劃分困難[8]。 認(rèn)為以豌豆成熟種胚截段為受體材料進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化最為高效，再生芽中GUS瞬間表達(dá)。

3　展望

雖然豌豆的組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化取得了一定進(jìn)展，但目前建立的方法不能夠廣泛適用于大多數(shù)豌豆品種。豌豆遺傳轉(zhuǎn)化主要問(wèn)題是轉(zhuǎn)化率低，外源基因表達(dá)強(qiáng)度不夠，原因可能是轉(zhuǎn)化細(xì)胞的存活率低，穩(wěn)定性差。進(jìn)一步研究影響豌豆再生及遺傳轉(zhuǎn)化的因素，提高再生率及轉(zhuǎn)化率。加大轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的穩(wěn)定表達(dá)以及穩(wěn)定傳遞于后代的相關(guān)研究，將國(guó)外已發(fā)現(xiàn)的與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記盡快應(yīng)用于育種實(shí)踐，使農(nóng)桿菌介導(dǎo)的豌豆轉(zhuǎn)基因體系在育種工作中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，不失為一種好的育種策略。

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Advances in tissue culture and genetic transformation of pea

ZHANG Li-juan,YANG Xiao-ming, WANG Chang， LU Jian-ying, MIN Geng-mei

( Institute of Crop, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070, China)

This paper reviewed new development on tissue culture and genetic transformation of pea at home and abroad in recent years. It described research achievements on genotypes, explants, basic medium, exogenous hormones in the process of tissue culture, etc, and summarized emphasisly the effects of different types, concentration and combinations of hormone on callus induction, root and buds differentiation in pea. At the same time, the paper summarized research progress on genetic transformation of pea, and finally discussed and prospected the main problems and future research directions of genetic transformation in pea.

pea; tissue culture; genetic transformation; genotype

2015-12-22；

2016-02-01

國(guó)家自然科學(xué)基金(31160304)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)食用豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-09-G8)；蘭州市農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目(2015-3-54)

張麗娟，碩士研究生，研究方向?yàn)槭秤枚惯z傳育種及病蟲(chóng)害防控，E-mail:binglingbeer103@163.com

楊曉明，研究員，主要從事豌豆育種及病蟲(chóng)害防治工作，E-mail：yangxm04@hotmail.com

S643.3

A

2095-1736(2016)05-0094-06

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.05.094