朱皖宜, 任　敏, 王冬梅, 朱鵬飛, 翟志華, 林青平,張　睿, 朱　杰, 陳穎瑛, 李慧娟, 凌青云

(江蘇凌云藥業(yè)， 常州 213200)

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多拉菌素產(chǎn)生菌的誘變及其發(fā)酵研究

朱皖宜, 任敏, 王冬梅, 朱鵬飛, 翟志華, 林青平,張睿, 朱杰, 陳穎瑛, 李慧娟, 凌青云

(江蘇凌云藥業(yè)， 常州 213200)

用實驗室保藏的阿維鏈霉菌Streptomycesarermitilis13#為出發(fā)菌種，經(jīng)過誘變選育獲得高產(chǎn)突變株，并研究該菌株及工業(yè)化發(fā)酵工藝。經(jīng)連續(xù)誘變，結(jié)合配方改良和發(fā)酵罐上工藝優(yōu)化，獲得的高產(chǎn)突變株其生產(chǎn)能力比出發(fā)株提高了127%，采用連續(xù)或間歇流加補糖的方式可延長產(chǎn)素周期，適合工業(yè)化生產(chǎn)。此突變株及發(fā)酵工藝的確定為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。

多拉菌素；誘變；發(fā)酵

多拉菌素(又名朵拉克汀，英文名doramectin)是以阿維鏈霉菌Streptomycesavermitilis衍生的第3代抗寄生蟲藥物(圖1)，與其他市售的同類產(chǎn)品比較，其抗寄生蟲范圍廣，抗蟲活性強、效果好、殘留低、對環(huán)境友好，是目前最有開發(fā)潛力的獸用抗寄生蟲新藥[1]。

圖1 多拉菌素的化學結(jié)構(gòu)Fig 1 The chemical structure of doramectin

對于我國這樣一個農(nóng)業(yè)大國來說，大力開發(fā)和使用無公害生物農(nóng)藥，無疑有著廣闊的市場和光明的前景。

對多拉菌素產(chǎn)生菌的出發(fā)株13#進行連續(xù)誘變篩選，獲得一株產(chǎn)量有顯著提高的突變株1692#；又對該株進行了發(fā)酵配方和發(fā)酵工藝的優(yōu)化，突變株的產(chǎn)素能力、遺傳穩(wěn)定性有了大幅提升，研制的發(fā)酵工藝符合工業(yè)化生產(chǎn)要求。

1 材料和方法

1.1出發(fā)菌株和試劑

阿維鏈霉菌Streptomycesarermitilis13#為出發(fā)菌種(實驗室保存)；標準品(Ehrenstorfer公司)。

1.2儀器和設(shè)備

搖瓶機：ZP-96(常州)；發(fā)酵罐：50 L(上海)；HPLC：Shimadzu LC-10Avp(日本)。

1.3培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基(%)：蔗糖0.5 ，脫脂奶粉 0.1，酵母抽提物0.4，磷酸二氫鉀0.1,微量元素1，瓊脂粉1.5，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基(%)：蔗糖0.5，玉米淀粉2，黃豆餅粉2，硫酸鎂0.1, 磷酸二氫鉀0.1, CaCO30.2，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(%)：玉米淀粉14，淀粉酶0.03，葡萄糖1，丙三醇0.15，黃豆餅粉3，酵母粉0.5，磷酸二氫鉀0.1,硫酸鎂0.3，丙酸鈉0.3， 微量元素1，CaCO30.3，環(huán)己甲酸鈉0.15， pH 7.4。

1.4突變株的篩選

挑取適量的菌體制成孢子懸浮液，放入含有玻璃珠的燒瓶中，振蕩1 min，取其5 mL孢子懸浮液以紫外線等誘變劑進行誘變處理(致死率控制在90%左右)[2]，經(jīng)連續(xù)稀釋，涂布在含有一定劑量的化學藥物的固體平板上進行物理、化學的單一、復(fù)合誘變的培養(yǎng)，未經(jīng)誘變的孢子懸浮液適當稀釋后涂布于未加誘變劑的平板上培養(yǎng)作為對照。

以紫外線等誘變劑誘變處理后的孢子懸浮液，再經(jīng)搖床培養(yǎng)30～60 min, 經(jīng)連續(xù)稀釋，其余的步驟同上。

單孢子分離長出的單菌落再隨機斜面?zhèn)鞔瑩u瓶發(fā)酵培養(yǎng)后檢測效價。再對挑選出的突變菌株進行搖瓶復(fù)篩實驗，最終挑選出產(chǎn)量高、雜質(zhì)含量低、遺傳穩(wěn)定性良好的優(yōu)良菌株[3]。

搖瓶的初篩與復(fù)篩：按常規(guī)菌種選育的搖瓶篩選程序進行[4]。

1.5工藝流程

菌種庫→斜面→種子罐→發(fā)酵罐。

1.6效價測定(HPLC法)

色譜柱：C18反相色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；

流動相：甲醇∶水=90∶10, 流速：1 mL/min，檢測波長：245 nm，進樣量10 μL。

1.7發(fā)酵罐的工藝優(yōu)化

在50 L發(fā)酵罐上，考察驗證并調(diào)節(jié)突變株的發(fā)酵代謝途徑及發(fā)酵工藝的優(yōu)化。

將成熟的斜面孢子用10 mL無菌水洗下，將孢子懸浮液接種于15 L種子罐，種子罐裝液量為10 L，在28℃、通氣量1 vvm、攪拌轉(zhuǎn)速100～200 r/min條件下培養(yǎng)40 h，種子液以5%接種量接種到50 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，發(fā)酵罐裝液量為35 L。

1.7.1單批發(fā)酵

在50 L發(fā)酵罐中，發(fā)酵產(chǎn)程開始后，控制通氣量0.8 vvm、DO 30%。每天檢測DR產(chǎn)量、殘?zhí)?、菌濃、氨基氮和pH值。

1.7.2流加補料

在50 L發(fā)酵罐中進行分批補料實驗。根據(jù)單批實驗的結(jié)果，在殘?zhí)橇康陀?.5%時流加30%糖液，直到菌絲老化,停止發(fā)酵。在發(fā)酵過程中，控制通氣量0.8 vvm、DO 30%。每天檢測DR產(chǎn)量、殘?zhí)恰⒕鷿?、氨基氮和pH值。

2 結(jié)果

2.1誘變選育

經(jīng)UV、SP等的復(fù)合誘變，有效地改變菌種對誘變劑的敏感度，并結(jié)合配方優(yōu)化，發(fā)酵產(chǎn)物呈階梯狀遞升，產(chǎn)素能力提高了127%，選育流程及系譜圖(圖2)。突變株在固體上的菌落形態(tài)也發(fā)生很大的改變：出發(fā)株呈光禿型、淡黃色、花瓣狀、菌體生長緩慢；突變株鋸齒邊緣、多皺褶、褐色素、菌體生長快速、孢子量有了很大的改觀，產(chǎn)率加大，并具有穩(wěn)定的遺傳特性(見圖3)。

圖2 系譜圖

Fig 2 Family tree

注：UV為紫外線;SP為丙酸鈉;NS為自然分離

圖3 菌株和突變株的菌落形態(tài)Fig 3 Colony morphology of original and mutant strains

2.2發(fā)酵罐上工藝驗證

在50 L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵工藝驗證。經(jīng)過試驗比較，調(diào)整碳源的合理配比。優(yōu)化前工藝發(fā)酵中還原糖濃度較低，DR合成速率較低，并且難以支持較長的產(chǎn)素期；優(yōu)化后基礎(chǔ)培養(yǎng)基中糖的比例調(diào)整為14%淀粉和1%葡萄糖，葡萄糖在菌體對數(shù)生長期內(nèi)被快速利用[5]，待菌體生長進入穩(wěn)定期流加補入液化淀粉保持還原糖的濃度促進合成代謝產(chǎn)物(見圖4)。

在實際優(yōu)化實驗中，采用流加補液化淀粉的方式控制還原糖濃度在2.5%左右，可提高產(chǎn)素速率，結(jié)果如圖4所示,同時周期可延長到15～20 d[6]。在這一期間，DR產(chǎn)量增加迅速，彌補了發(fā)酵后期碳源的缺乏，提高了產(chǎn)量。從pH值的變化來看，發(fā)酵采用流加補糖工藝后，pH值全程穩(wěn)定，維持比較穩(wěn)定的發(fā)酵產(chǎn)程環(huán)境。

圖4 發(fā)酵曲線Fig 4 Fermentation curve

A:優(yōu)化前; b:優(yōu)化后?！?pH值； □ 氨基氮； ◇朵拉； ×還原糖；▼菌濃

3　討論

原實驗室保存的菌種由于產(chǎn)率低，不具備工業(yè)化生產(chǎn)的意義[7]。經(jīng)過誘變篩選和配方優(yōu)化，獲得的突變株其生產(chǎn)能力比出發(fā)株提高了127%，單位產(chǎn)量和遺傳穩(wěn)定性有了大幅提升。有效的物理、化學復(fù)合誘變是短期內(nèi)篩選順利的關(guān)鍵。復(fù)合誘變技術(shù)的利用，獲取的突變株數(shù)目較多。

菌落形態(tài)由初始的半光禿型突變?yōu)楫a(chǎn)孢能力較強的灰褐孢型，從而促進了菌體在發(fā)酵過程中的生長，改善了對氧的利用率，提高了單位產(chǎn)量；發(fā)酵罐實驗中維持適當?shù)倪€原糖濃度能促進DR的合成，產(chǎn)量攀升加快。配方和發(fā)酵工藝的不斷優(yōu)化保證了突變株良好的表現(xiàn)[8]。

葡萄糖是微生物生長的優(yōu)質(zhì)碳源，但在抗生素生產(chǎn)中卻會抑制產(chǎn)物的合成。葡萄糖的阻遏機理已經(jīng)在很多品種的生物合成途徑中有了合理的解釋[9]。發(fā)酵生產(chǎn)的實踐已經(jīng)證明用緩慢利用的多糖組成的碳源，有利于產(chǎn)物的形成[10]。選擇最適碳源對提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量是非常重要的。

另外發(fā)酵前期的過早高黏度和菌濃直接影響了產(chǎn)物的合成和代謝過程中的溶氧，通過配方優(yōu)化和流加補碳源工藝后，黏度和菌濃下降、溶氧上升，產(chǎn)率呈階梯狀增進，取得了良好的效果,突變株的產(chǎn)素能力有了大幅提升。

[1]張穎，李坤林.多拉菌素的研究進展及應(yīng)用[J]. 動物保健，2006(8):36-37.

[2]朱皖宜,羅紅瑜，張賽萍，等.尼莫克丁產(chǎn)生菌的誘變育種[J]，生物學雜志，2008，25(2)：62-66.

[3]朱皖宜, 陳華,邱海瀟， 等. 格爾德霉素高產(chǎn)菌株的抗性篩選及其發(fā)酵的研究[J]. 中國抗生素雜志， 2014, 39(2): 106-145.

[4]俞俊棠，唐孝宣.生物工藝學(上冊)[M]. 上海：華東化工學院出版社，1991:82.

[5]IKEDA H,KOTAKI H,TANAKA H, et al. Involvement of glucose catabolism in avemermectin production byStreptomycesavermiltilis[J].Antimsicrob Angents Chemother, 1998, 32(2):282-284.

[6]儲炬，李友榮.現(xiàn)代工業(yè)微生物發(fā)酵調(diào)控學[M].北京：化學工業(yè)出版社，2002：223.

[7]唐文力，張祝蘭.MW+NTG復(fù)合誘變組合抗性突變篩選埃波霉素高產(chǎn)菌[C].宜昌：2015年中國微生物學會學術(shù)年會論文摘要集，2015：229.

[8]熊宗貴.發(fā)酵工藝原理[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2000:55.

[9]岑沛霖，蔡謹.工業(yè)微生物學[M].北京：化學工業(yè)出版社，2000：335.

[10]白秀峰.發(fā)酵工藝學[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2003：137.

Mutation breeding of doramectin mutant strain and study on fermentation

ZHU Wan-yi, REN Min, WANG Dong-mei, ZHU Peng-fei, ZHAI Zhi-hua, LIN Qing-ping,ZHANG Rui, ZHU Jie, CHEN Ying-ying, LI Hui-juan, LING Qing-yun

(Jiangsu Lingyun Pharmaceutical Company, Changzhou 213200, China)

The mutant strain 1692#was obtained from an original strainStreptomycesarermitilis13#using strain mutation screening method. Within the optimizing of the fermentation medium composition and the fermentation process, the production of the mutant strain was 127% higher than that of the original one. The mutant strain and the optimized fermentation process would provided a reference for the industrialized production of doramectin.

doramectin; mutation; fermentation

2015-10-28;

2015-11-23

朱皖宜，高級工程師, 研究方向為工業(yè)微生物育種， E-mail:zwyhz@hotmail.com

Q933

B

2095-1736(2016)05-0106-03

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.05.106