白志余，周東蕊，張仁敏，李娜，白志茂，張紅琳，張麗玲，龐桂芬

（1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北 承德 067000；2.東南大學(xué)學(xué)習(xí)科學(xué)研究中心，江蘇 南京 210000；3.東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京 210000；4.南京曉莊學(xué)院，江蘇 南京 210017）

腸內(nèi)代謝物腹腔注射對大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌和行為學(xué)的影響*

白志余1，周東蕊2，張仁敏2，李娜2，白志茂3，張紅琳4，張麗玲4，龐桂芬1

（1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北 承德 067000；2.東南大學(xué)學(xué)習(xí)科學(xué)研究中心，江蘇 南京 210000；3.東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京 210000；4.南京曉莊學(xué)院，江蘇 南京 210017）

目的觀察腸內(nèi)代謝物對大鼠行為學(xué)的影響，并初步探討其可能機(jī)制。方法采集健康兒童新鮮糞便，用低溫高速離心法提取腸內(nèi)代謝物。將26只SD大鼠隨機(jī)分為兩組（對照組10只，實(shí)驗(yàn)組16只），實(shí)驗(yàn)組大鼠于腹腔注射腸內(nèi)代謝產(chǎn)物（0.5ml/只），對照組大鼠用生理鹽水處理。采用高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)觀察兩組大鼠行為學(xué)差異，并測定其腦組織海馬區(qū)、下丘腦、紋狀體內(nèi)5-羥色胺（5-HT）及多巴胺（DA）表達(dá)水平。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組與對照組SD大鼠行為學(xué)比較，發(fā)現(xiàn)進(jìn)臂總次數(shù)[實(shí)驗(yàn)組（38.00±7.51）次、對照組（14.75±8.62）次]和開臂時(shí)間比例[實(shí)驗(yàn)組（36.24±12.30）%、對照組（21.37±8.32）%]比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。海馬和下丘腦內(nèi)5-HT含量、海馬和紋狀體內(nèi)DA含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論健康兒童腸內(nèi)代謝物使大鼠行為學(xué)明顯改變，并對腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)有一定影響。

腸內(nèi)代謝物；腹腔注射；大鼠行為學(xué)；5-羥色胺；多巴胺

腸內(nèi)代謝產(chǎn)物是消化系統(tǒng)內(nèi)消化酶與腸道菌群共同代謝的產(chǎn)物，既有對機(jī)體有益的營養(yǎng)物質(zhì)、生物因子，也有一些有毒物質(zhì)[1-2]。當(dāng)飲食相同的情況下，除遺傳基因個體差異外，代謝產(chǎn)物的差異主要取決于機(jī)體腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。腸道微生物是存在于宿主消化道內(nèi)的微生物群落，數(shù)量極其龐大，人體腸道微生物細(xì)菌數(shù)量是人體細(xì)胞的10倍[3]，其編碼基因約為人體編碼基因的100倍[4]。這么龐大一個微生物群體起著營養(yǎng)物質(zhì)降解與消化吸收，合成人體需要的某些免疫因子、神經(jīng)遞質(zhì)及前體物質(zhì)等重要作用。腸道微生物及其代謝產(chǎn)物對機(jī)體免疫和神經(jīng)信號傳導(dǎo)等起重要的調(diào)節(jié)作用[5-6]。多項(xiàng)研究表明，腸道和大腦之間通過腸道微生物的分泌與代謝作用，以及腸道微生物對腸神經(jīng)和免疫系統(tǒng)的刺激作用，來完成重要的雙向調(diào)節(jié)功能，稱為菌群腦腸軸[7]，如腸道微生物及其代謝產(chǎn)物直接參與某些神經(jīng)與免疫的關(guān)鍵信號通路傳導(dǎo)[8]，參與大腦與神經(jīng)的發(fā)育，以及調(diào)節(jié)人體的行為表現(xiàn)等[9]。健康狀態(tài)下腸道微生物組成一個復(fù)雜而穩(wěn)定的微生態(tài)環(huán)境，起重要的腸黏膜屏障作用。當(dāng)機(jī)體受創(chuàng)，免疫功能缺損或胃腸功能紊亂，腸黏膜屏障受損的情況下，本不能通過腸黏膜屏障的代謝物就會突破腸黏膜屏障，使機(jī)體出現(xiàn)病變。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，功能性胃腸疾病患者多數(shù)存在焦慮、抑郁等情緒行為異常[10-11]。自閉癥作為一項(xiàng)廣泛性神經(jīng)發(fā)育異常疾病，近年來發(fā)病率逐年增高。自閉癥兒童多數(shù)具有胃腸道問題，如反復(fù)的胃腸炎癥及腸漏[12]。腸黏膜的通透性增加，腸內(nèi)代謝物及一些有毒分子進(jìn)入血液循環(huán)，某些分子甚至能夠通過血腦屏障作用于大腦，引起行為學(xué)及腦神經(jīng)遞質(zhì)的變化[13]。本實(shí)驗(yàn)通過對大鼠腹腔注射腸內(nèi)代謝物，避開腸黏膜屏障，建立腸漏模型，進(jìn)一步了解腸內(nèi)代謝產(chǎn)物對大鼠行為及腦神經(jīng)遞質(zhì)分泌，如5-羥色胺（Serotonin，5-HT）、多巴胺（Dopamine，DA）的影響。為自閉癥等神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

無特定病原體級SD大鼠，26只，10 d大小，南京青龍山動物飼養(yǎng)廠提供。標(biāo)準(zhǔn)品5-HT、5-羥吲哚乙酸、3，4-二羥基苯甲胺氫溴酸鹽，購自美國Sigma aldrich公司，乙腈（色譜純）購自山東禹王實(shí)業(yè)公司化學(xué)試劑廠，乙二胺四乙酸、庚烷磺酸鈉購自上?；瘜W(xué)試劑研究所，石蠟?zāi)べ徸悦绹鳤lcan Packaging公司。

1.2儀器與設(shè)備

低溫高速離心機(jī)Eppendorf 5804R購自德國Eppendorf公司，旋渦振蕩器Vortex-2 Genie購自美國Scientific Industries公司，大鼠高架十字迷宮（elevated plus maze，EPM）購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，LC-20AD高效液相色譜儀、L-ECD-6A電化學(xué)檢測器、LC-20AD雙泵購自日本島津公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1腸內(nèi)代謝物的提取將采集的健康兒童新鮮糞便用一定體積的無菌0.9%生理鹽水溶解1.0∶0.5（重量g∶體積ml），混勻，低溫4℃、500r/min離心5min。取上清液，低溫4℃、5000r/min離心10min。取上清液，低溫4℃、8000r/min離心15min。取上清液，低溫4℃、12000r/min離心30min，收集上清液。過濾（0.22μm孔徑），重復(fù)2次，將液體4℃保存。整個手動操作過程要在低溫冰上進(jìn)行，離心過程管口用蠟?zāi)し饪?，避免揮發(fā)性成分揮發(fā)。

1.3.2大鼠腹腔注射將26只SD大鼠飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境后，隨機(jī)分為兩組（對照組10只，實(shí)驗(yàn)組16只），以腸內(nèi)代謝物和0.9%生理鹽水按0.5 ml分別注射實(shí)驗(yàn)組和對照組，隔天注射1次，連續(xù)注射20d后停止注射，然后飼養(yǎng)半個月。動物房室溫25～30℃。

1.3.3大鼠行為學(xué)測試實(shí)驗(yàn)室內(nèi)光線昏暗并保持恒亮，室溫25℃左右，保持安靜。迷宮測試前將每只大鼠單獨(dú)放入塑料盒中，任其自由探究5 min后迅速置于EPM的中央平臺處，使其頭部正對其中一個開放臂，釋放后即開始記錄下述指標(biāo)：進(jìn)入開放臂次數(shù)（open arm entry，OE）、進(jìn)入開放臂時(shí)間（open arm time，OT）、進(jìn)入封閉臂次數(shù)（close alm entry，CE）、進(jìn)入封閉臂時(shí)間（close arm time，CT）。由以上指標(biāo)分別計(jì)算出：①進(jìn)入開放臂和封閉臂的總次數(shù)（OE+CE）；

1.3.4大鼠腦組織神經(jīng)遞質(zhì)檢測①大鼠EPM行為學(xué)測試結(jié)束后，立即斷頭處死，迅速在冰盤上剪開顱蓋和腦膜，然后分離腦組織，包括海馬、下丘腦、紋狀體，迅速置于液氮中冷凍保存；②取各部分組織置于玻璃勻漿器中，加入少量高氯酸（15%），上下勻漿5 min，將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，用15%高氯酸蕩洗勻漿器，洗液并入離心管，用15%高氯酸定容至1ml。腦組織勻漿12000r/min高速離心6min，取上清液，置入-70℃冰箱冷凍保存待測；③樣品測定時(shí)取上清液500μl于離心管中，加入10μg/ml內(nèi)標(biāo)3，4-二羥基苯甲胺氫溴酸鹽溶液，渦旋，20μl直接進(jìn)樣，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算樣品中神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和DA的含量。流動相：30mmol/L檸檬酸，45mmol/L磷酸二氫鈉，2mmol/L庚烷磺酸鈉，0.3mmol/L乙二胺四乙酸，6%（v/v）乙腈，NaOH調(diào)pH 4.00；流速為1.0 ml/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量20μl。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，實(shí)驗(yàn)組與對照組均數(shù)間的比較，在方差齊時(shí)選用成組t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)選用校正t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大鼠行為學(xué)測試結(jié)果

隨機(jī)挑選4只對照組大鼠和6只實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行行為學(xué)測試。從EPM視頻采集大鼠運(yùn)動軌跡分析圖中可知實(shí)驗(yàn)組和對照組大鼠運(yùn)動軌跡明顯不同。實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)臂總次數(shù)為（38.00±7.51）次，對照組大鼠進(jìn)臂總次數(shù)為（14.75±8.62）次，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)臂總次數(shù)高于對照組大鼠進(jìn)臂總次數(shù)。實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)入開臂時(shí)間比例為（36.24±12.30）%，對照組大鼠進(jìn)入開臂時(shí)間比例為（21.37±8.32）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)入開臂時(shí)間比例比對照組大鼠高。見表1和附圖。

表1　兩組大鼠高架迷宮行為學(xué)測試結(jié)果（±s）

表1　兩組大鼠高架迷宮行為學(xué)測試結(jié)果（±s）

組別進(jìn)臂總次數(shù)進(jìn)臂總時(shí)間/s開臂次數(shù)比例/%開臂時(shí)間比例/%對照組（n=4）實(shí)驗(yàn)組（n=6）14.75±8.62 38.00±7.51 779.92±81.38 780.17±61.34 40.08±9.53 48.55±9.37 21.37±8.32 36.24±12.30 t值4.5340.0061.3912.381 P值0.0020.9960.2020.044

2.2SD大鼠腦神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)水平

兩組大鼠腦組織內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)水平明顯不同，實(shí)驗(yàn)組和對照組大鼠海馬內(nèi)5-HT含量分別為（54.21±19.68）和（147.59±74.63）ng/g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬內(nèi)5-HT含量低于對照組。實(shí)驗(yàn)組和對照組大鼠下丘腦內(nèi)5-HT含量分別為（116.09±57.70）和（577.34±340.97）ng/g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組大鼠下丘腦內(nèi)5-HT含量低于對照組。實(shí)驗(yàn)組和對照組大鼠海馬內(nèi)DA含量分別為（18.78±14.08）和（68.34±30.09）ng/g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬內(nèi)DA含量低于對照組。實(shí)驗(yàn)組和對照組大鼠紋狀體內(nèi)DA含量分別為（274.11±180.78）和（736.37±204.68）ng/g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組大鼠紋狀體內(nèi)DA含量低于對照組，表明腸內(nèi)代謝物對腦部神經(jīng)遞質(zhì)有顯著影響。見表2、3。

附圖　SD大鼠行為學(xué)測試結(jié)果（軌跡圖）

表2　兩組大鼠腦組織內(nèi)5-HT含量比較（ng/g±s）

表2　兩組大鼠腦組織內(nèi)5-HT含量比較（ng/g±s）

組別海馬下丘腦紋狀體對照組（n=4）147.59±74.63577.34±340.97349.15±257.41實(shí)驗(yàn)組（n=6）54.21±19.68116.09±57.7059.99±21.93 t值2.4462.6802.241 P值0.0400.0280.055

表3　兩組大鼠腦組織內(nèi)DA含量比較（ng/g±s）

表3　兩組大鼠腦組織內(nèi)DA含量比較（ng/g±s）

組別海馬下丘腦紋狀體對照組（n=4）68.34±30.0988.01±70.52736.37±204.68實(shí)驗(yàn)組（n=6）18.78±14.0837.95±28.31274.11±180.78 t值3.0771.3493.767 P值0.0150.2140.005

3 討論

本研究以腸內(nèi)代謝產(chǎn)物對SD大鼠進(jìn)行腹腔注射，避開腸黏膜屏障，模擬腸黏膜通透性較大時(shí)，腸內(nèi)代謝物易位進(jìn)入機(jī)體內(nèi)，從而對大鼠行為及神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)的影響。通過EPM實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腸內(nèi)代謝產(chǎn)物可以導(dǎo)致SD大鼠行為學(xué)明顯改變，并使腦組織內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)（5-HT、DA）的表達(dá)出現(xiàn)顯著變化。

EPM模型為抗焦慮研究中公認(rèn)的非條件反射模型。以進(jìn)入開放臂的百分?jǐn)?shù)和在開放臂停留時(shí)間的百分?jǐn)?shù)為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，來反映動物的焦慮狀態(tài)。如果一個因素增加動物對開臂的偏愛（即增加進(jìn)入開臂的次數(shù)和在開臂內(nèi)滯留時(shí)間），卻不改變?nèi)氡劭偞螖?shù)和入臂總時(shí)間，即開臂進(jìn)入次數(shù)百分比和開臂滯留時(shí)間百分比升高，則認(rèn)為該因素具有抗焦慮的作用。實(shí)驗(yàn)組與對照組開臂時(shí)間比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明實(shí)驗(yàn)組未出現(xiàn)對照組應(yīng)有的焦慮狀態(tài)。人類和嚙齒類動物的焦慮情緒及焦慮樣行為基本機(jī)制可能不同。嚙齒類動物的焦慮樣行為是反應(yīng)探索和逃避危險(xiǎn)之間的平衡。本研究的實(shí)驗(yàn)組比對照組焦慮行為減弱的現(xiàn)象，不能單純的看做抗焦慮作用，可能實(shí)驗(yàn)組大鼠沒有正常大鼠的恐懼感或不能如正常大鼠那樣識別危險(xiǎn)，而孤獨(dú)癥兒童有時(shí)也不能識別危險(xiǎn)[14]。因此筆者推測腸內(nèi)代謝物毒素可能導(dǎo)致大鼠孤獨(dú)癥癥狀類似的情緒、行為異常狀態(tài)。

5-HT是單胺類中樞神經(jīng)遞質(zhì)，通過受體介導(dǎo)調(diào)節(jié)情緒、睡眠、食欲、痛覺等。DA也是單胺類中樞性神經(jīng)遞質(zhì)，通過多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體作用于多巴胺受體，在認(rèn)知、情感等中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能過程中發(fā)揮作用。孤獨(dú)癥等精神障礙疾病患者存在腦神經(jīng)遞質(zhì)的變化。比如孤獨(dú)癥兒童存在單胺類神經(jīng)遞質(zhì)異常，部分孤獨(dú)癥兒童腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)存在異常，也有報(bào)道稱，孤獨(dú)癥兒童腦內(nèi)5-HT表達(dá)出現(xiàn)異常[15-16]。但孤獨(dú)癥亞型非常多，病因及患病機(jī)制都非常復(fù)雜，臨床癥狀也不盡相同，至今仍存在爭論，沒有統(tǒng)一的共識。雖有報(bào)道稱，約30%的孤獨(dú)癥兒童腦中5-HT較正常兒童高[17]，部分患兒腦內(nèi)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體增高，可見不是全部孤獨(dú)癥兒童都會5-HT過度表達(dá)，也不是全部孤獨(dú)癥兒童都會多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體增高。而可以肯定的是，該類患者腦神經(jīng)遞質(zhì)都會出現(xiàn)或多或少的異常表達(dá)。本研究實(shí)驗(yàn)組與對照組比較大鼠海馬中的5-HT、海馬、紋狀體內(nèi)的DA含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明腸內(nèi)代謝物確實(shí)可以導(dǎo)致單胺類神經(jīng)遞質(zhì)出現(xiàn)異常表達(dá)。

腸道微生物及其代謝產(chǎn)物可以影響腸道黏膜免疫系統(tǒng)，影響腸黏膜屏障功能。正常情況下，腸黏膜有選擇性通透，允許營養(yǎng)物質(zhì)及部分生物因子通過，阻礙有毒物質(zhì)的通過。大量研究證明，孤獨(dú)癥、焦慮、抑郁等疾病會引起腸道菌群失衡，進(jìn)而影響腸道黏膜免疫，出現(xiàn)慢性炎癥表現(xiàn)，破壞腸黏膜屏障功能，使腸道通透性增加，允許細(xì)菌產(chǎn)物，細(xì)胞因子和趨化因子，進(jìn)入流通和跨血腦屏障，影響大腦和行為[18]。近幾年，研究越來越多地考慮到腸道菌群與腦功能及心理構(gòu)成之間的相互關(guān)系[19]。對于腸道菌群及其代謝物通過菌群腦腸軸來調(diào)節(jié)大腦的發(fā)育及行為表現(xiàn)的研究也越來越深刻。研究發(fā)現(xiàn)，可以通過影響小鼠腸道菌群代謝產(chǎn)物來改變其行為[20]；增加益生菌可修復(fù)腸黏膜屏障，恢復(fù)其通透性[21]；孤獨(dú)癥兒童口服萬古霉素治療可明顯改善其行為、認(rèn)知及胃腸道癥狀[22]。上述研究都進(jìn)一步佐證腸道菌群紊亂、腸黏膜屏障受損導(dǎo)致其通透性增大后，腸道微生物及其代謝產(chǎn)物會引起或加重行為學(xué)及腦神經(jīng)遞質(zhì)的異常變化，即佐證本實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性、合理性。

在進(jìn)一步的研究中，筆者將會將不同疾病類型的代謝物通過腹腔注射和大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，來驗(yàn)證不同代謝物對大鼠行為學(xué)與神經(jīng)內(nèi)分泌的影響，并找出影響大鼠反應(yīng)的有效物，為各類精神疾病研究與治療提供更為有價(jià)值的理論依據(jù)，并且筆者會進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)方法，比如增加5-HT和DA組織切片，為實(shí)驗(yàn)結(jié)論提供更為有說服力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（童穎丹編輯）

Effects of intraperitoneal injection of intestinal metabolite on neurotransmitters and behavior in rats*

Zhi-yu Bai1,Dong-rui Zhou2,Ren-min Zhang2,Na Li2,Zhi-mao Bai3, Hong-lin Zhang4,Li-ling Zhang4,Gui-fen Pang1
（1.Department of Respiratory Medicine，the Affiliated Hospital of Chengde Medical College，Chengde，Hebei 067000，China；2.Research Center for Learning Science，Southeast University，Nanjing，Jiangsu 210000，China；3.School of Public Health，Southeast University，Nanjing，Jiangsu 210000，China；4.Nanjing Xiaozhuang University，Nanjing，Jiangsu 210017，China）

Objective To observe the effects of intestinal metabolites on behavior of rats，and explore its possible mechanism.Methods Fresh feces of healthy children was collected.The intestinal metabolites were extracted with high-speed centrifugation at low temperature.Twenty-six SD rats were randomly divided into 2 groups（10 in control group，16 in experimental group）.The rats of the experimental group in the hippocampus and striate body had significant differences between the experimental group and the control group（P＜0.05）.Conclusions Intestinal metabolites of healthy children can change the behavior of rats，and have certain influence on neurotransmitters in the brain.

intraperitoneal injection of intestinal metabolites（0.5 ml/rat），and the control group rats were treated with normal saline instead.The overhead cross maze experiment was used to observe the differences in behavior between the two groups.And 5-hydroxytryptamine（5-HT）and dopamine（DA）expression levels were determined in the hypothalamus，hippocampus and striate body of the rats.Results There were significant differences in the total number of reaching-in arm［（38.00±7.51）vs（14.75±8.62）］and open arm residence time［（36.24±12.30）vs（21.37±8.32）］bwteen the experimental group and the control group（P＜0.05）.The content of 5-HT and DA

intestinal metabolite；intraperitoneal injection；behavior；serotonin；dopamine

R 749；R 363

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.19.004

1005-8982（2016）19-0017-06

2016-03-29

江蘇省蘇州市科技支撐計(jì)劃（No：SS201337、SNG201449）

龐桂芬，E-mail：pang-gf@sohu.com