潘寶龍，馬潤玫

（昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650031）

妊娠期糖尿病大網(wǎng)膜前脂肪細胞原代培養(yǎng)及增殖分化模型的建立*

潘寶龍，馬潤玫

（昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650031）

目的建立妊娠期糖尿?。℅DM）大網(wǎng)膜前脂肪細胞原代培養(yǎng)及向成熟脂肪細胞增殖分化的模型，為脂肪細胞體外研究奠定基礎(chǔ)。方法使用改良的細胞培養(yǎng)法，以GDM剖宮產(chǎn)患者大網(wǎng)膜純脂肪組織為原材料，作前脂肪細胞的原代培養(yǎng)和傳代，繪制傳代前脂肪細胞的生長曲線，并對傳代前脂肪細胞做誘導(dǎo)分化，對已誘導(dǎo)分化細胞通過油紅O染色和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測脂聯(lián)素mR NA，并進行細胞凍存和復(fù)蘇實驗。結(jié)果培養(yǎng)出的前脂肪細胞基本均為梭形細胞，增殖旺盛，第4天細胞開始快速增殖，倍增時間約為48h。第7天原代前脂肪細胞開始出現(xiàn)脂肪顆粒，而傳代細胞仍然保持梭形和無脂滴。傳代前脂肪細胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)，出現(xiàn)定向分化，經(jīng)油紅O脂肪染色和脂聯(lián)素mR NA測定，證明已誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細胞。結(jié)論GDM大網(wǎng)膜脂肪組織中具有前脂肪細胞，可進行連續(xù)傳代和大量擴增。原代前脂肪細胞在培養(yǎng)增殖過程中，會自然出現(xiàn)向成熟脂肪細胞分化，而傳代后前脂肪細胞則失去分化能力，經(jīng)適當誘導(dǎo)后可定向分化為成熟脂肪細胞。模型的建立，可為后續(xù)脂肪細胞體外實驗研究做好前期準備。

前脂肪細胞；細胞培養(yǎng)；細胞模型

脂肪組織是一個功能強大的內(nèi)分泌器官，可分泌瘦素、脂聯(lián)素等脂肪因子，其可能對胰島素抵抗、心血管功能、糖脂代謝、系統(tǒng)炎癥及骨代謝起調(diào)節(jié)作用[1-3]。目前，學(xué)術(shù)界對脂肪因子展開的生物學(xué)研究的體外實驗載體基本采用嚙齒類動物脂肪細胞[4-6]。不可忽視的一個影響因素是，嚙齒類動物與人類存在明顯的遺傳學(xué)差異，兩者的代謝途徑也截然不同。因此，將其作為實驗載體往往難以避免潛在的實驗缺陷問題，從而影響實驗數(shù)據(jù)和結(jié)論的科學(xué)性。相對而言，人源前脂肪細胞是人體中一種特異化的前體細胞，具有增殖能力和向成熟脂肪細胞定向分化的能力，在人的一生中均存在并持續(xù)作用，且與糖尿病、肥胖、動脈硬化等代謝類疾病關(guān)系密切[7]。以人源細胞作為研究載體，更具科學(xué)性，并且以取自相應(yīng)疾病患者網(wǎng)膜組織而培養(yǎng)傳代的前脂肪細胞，可能更多地保留該疾病其他的基因信息，更真實地模擬疾病的基因環(huán)境，使結(jié)果更具有說服力。本研究在查閱大量文獻的基礎(chǔ)上，對體外脂肪細胞的培養(yǎng)方法做一定程度的改良，嘗試建立妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）患者大網(wǎng)膜前脂肪細胞體外原代培養(yǎng)及增殖分化模型，以期為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1前脂肪細胞的原代培養(yǎng)

實驗前，遵循醫(yī)學(xué)倫理學(xué)規(guī)定報批，并取得患者知情同意。取GDM剖宮產(chǎn)患者大網(wǎng)膜相對純凈脂肪組織10～20g，去除可見血管及纖維成分，pH 7.2磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌，剪成盡可能小的碎糊狀。按照1∶2體積比加入Ⅰ型膠原酶溶液（2mg/ml），5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱，37℃消化3 h，1 000 r/min離心10 min。棄上清液和漂浮的脂肪細胞，37℃紅細胞裂解液處理沉淀細胞5～10min，分別以100和200目不銹鋼網(wǎng)過濾。1000r/min離心10min，棄上清，將沉淀細胞加入前脂肪細胞基本培養(yǎng)基[杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco modified eagle medium，DMEM）]，輕輕吹打懸浮細胞，調(diào)配細胞濃度為1×105個/cm3，接種于6孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)。觀察細胞貼壁后立即進行培養(yǎng)基更換，并除去未貼壁細胞。每日監(jiān)測，每3天進行1次培養(yǎng)基更換。

1.2前脂肪細胞的傳代

待細胞生長至單層融合接近80%時，可進行細胞傳代。實驗前用75%酒精擦拭超凈工作臺，并提前開啟紫外燈靜態(tài)殺菌30min。棄培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)基，PBS洗滌細胞2次，棄PBS液，加入2 ml胰酶37℃進行消化，待細胞稍微變圓后，立即將培養(yǎng)瓶豎起使胰酶與細胞分離，棄瓶中胰酶，加入新鮮培養(yǎng)基，并將瓶壁上的細胞吸管反復(fù)吹打混勻，調(diào)整細胞密度為1×105個/cm3，分別接種至75 cm2培養(yǎng)皿6和24孔板中。每3天進行1次培養(yǎng)基更換。當傳代細胞生長至單層融合接近80%時，可再次進行，往下傳代。

1.3繪制傳代前脂肪細胞的生長曲線

使用1個24孔板作為細胞生長曲線監(jiān)測板，每2孔為1組，將24孔隨機分成12組，每天檢測1組，計數(shù)2孔各自細胞總數(shù)，取平均值，以此類推，連續(xù)計數(shù)12d，至12組結(jié)束，并繪制細胞生長曲線。

1.4傳代前脂肪細胞的誘導(dǎo)分化

待傳代細胞生長至單層融合接近80%時，可進行細胞誘導(dǎo)分化。將培養(yǎng)基更換為分化培養(yǎng)基（制備方法見附表），5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，更換培養(yǎng)基為含10μg/ml胰島素的基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后，將培養(yǎng)基更換為基本培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，監(jiān)測細胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪顆粒的數(shù)量和速度?？筛鶕?jù)實驗需求繼續(xù)或停止培養(yǎng)。

1.5油紅O染色

吸棄孔板內(nèi)培養(yǎng)液，PBS沖洗細胞3次，每孔分別加入10%甲醛磷酸鹽緩沖溶液1.5ml，在常溫下固定20 min，吸棄固定液，PBS沖洗細胞3次，60%異丙醇沖洗1次，37℃干燥5 min，每孔加入油紅O染液1.5 ml，室溫染色2 h，雙蒸水反復(fù)沖洗將油紅洗去，37℃干燥5min，置顯微鏡下觀察和拍照。

附表　分化培養(yǎng)基配制

1.6前脂肪細胞、成熟脂肪細胞逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測脂聯(lián)素mRNA

1.6.1R NA提取使用美國Invitrogen公司生產(chǎn)的Trizol試劑抽提，按照試劑盒說明書進行操作，以日本UV-2450紫外分光光度計檢測所抽提RNA含量和純度。

1.6.2聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增和瓊脂糖凝膠電泳脂聯(lián)素mRNA引物序列：正向引物：5'-ATCGGTGAAACCGGAGTACC-3'，反向引物：5'-GCATGTTGGGGATAGTAACGTAA-3'，擴增產(chǎn)物長度148bp，體系為25μl。擴增產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下判讀，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.7細胞凍存

培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞經(jīng)消化和吹打制成細胞懸液，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入1 ml冷凍液保存（DMEM∶胎牛血清∶二甲基亞砜=8∶1∶1）吹打混勻后移入凍存管，封口，4℃放置40 min，置入-20℃冰箱冷凍2 h，再置入-80℃冰箱冷凍保存，如短期內(nèi)不使用則移入液氮（-196℃）中保存。

1.8細胞復(fù)蘇

從液氮中取出冷凍管，迅速投到37℃水中，并不斷搖動（使管中的液體迅速融化），待完全溶解后取出，75%酒精擦拭凍存管外壁，超凈工作臺內(nèi)取出管內(nèi)液體，1000r/min離心10min，棄上清液，加入37℃、10 ml基本培養(yǎng)基，吹打制成細胞懸液，計數(shù)后調(diào)整濃度為1×105個/ml，分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，24h后更換為新鮮培養(yǎng)基，每日監(jiān)測，每3天進行1次培養(yǎng)基更換。待細胞長到培養(yǎng)瓶的80%后進行傳代培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1原代培養(yǎng)的前脂肪細胞

培養(yǎng)6 h即可見部分細胞貼壁，13 h細胞貼壁率70%，24 h后基本全部貼壁，細胞呈不規(guī)則形，較為分散，數(shù)目較少。第3天觀察基本變?yōu)樗笮渭毎?，少?shù)呈多角形，細胞數(shù)目也有所增加。第4天細胞開始進入快速增殖，第7天原代前脂肪細胞形態(tài)出現(xiàn)改變，逐漸由梭形變橢圓或圓形，胞內(nèi)可見脂肪顆粒，而傳代后細胞形態(tài)仍然保持梭形，局部可出現(xiàn)單層融合，細胞排列較為緊密。第9天發(fā)現(xiàn)原代前脂肪細胞內(nèi)含有大量脂肪顆粒，說明大量原代細胞已自行分化為成熟脂肪細胞。而傳代細胞至第9天后仍繼續(xù)保持梭形，細胞基本單層融合，排列緊密，油紅O染色仍未著色。見圖1～3。

圖1　原代前脂肪細胞第3天（油紅O染色×100）

圖2　原代前脂肪細胞第4天（油紅O染色×100）

圖3　原代前脂肪細胞第9天（油紅O染色×100）

2.2傳代培養(yǎng)的前脂肪細胞

傳代后前脂肪細胞前4 d細胞形態(tài)及生長狀況與原代前脂肪細胞極為相似，基本為梭形，大小較為均勻。5～6d后細胞進入快速增殖，排列平行緊密。通常第7天即可完成單層融合，光鏡下觀察，細胞內(nèi)無反光小滴，說明無脂肪顆粒產(chǎn)生，即便培養(yǎng)9 d后油紅O染色仍未著色（見圖4）。其連續(xù)傳代可大量擴增，但發(fā)現(xiàn)傳代到5代后，增殖和分化率開始降低。

圖4　傳代前脂肪細胞第9天（油紅O染色×100）

2.3前脂肪細胞的生長曲線

以第2代傳代細胞為監(jiān)測對象，使用1個24孔板作為細胞生長曲線監(jiān)測板，每天隨機計數(shù)2孔細胞，取平均值，連續(xù)計數(shù)12d。見圖5。

圖5　前脂肪細胞生長曲線

2.4第3代傳代前脂肪細胞誘導(dǎo)分化

第3代傳代細胞誘導(dǎo)后，出現(xiàn)向成熟脂肪細胞的定向分化。第6天即可見部分細胞開始出現(xiàn)單個散在反光小滴。隨培養(yǎng)時間延長，細胞內(nèi)脂滴逐漸增多，第12天可見胞內(nèi)已聚集大量脂滴，經(jīng)油紅O染色初步證實分化成功。見圖6、7。

圖6　分化第6天（油紅O染色×400）

圖7　分化第12天（油紅O染色×400）

2.5逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

前脂肪細胞無脂聯(lián)素mRNA表達，成熟脂肪細胞有脂聯(lián)素mRNA表達。見圖8。

圖8　逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

3 討論

在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，脂肪組織僅被認為是人體儲存脂質(zhì)的場所，在人體能量不足的情況下，受刺激而釋放能量。直到上世紀90年代，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)脂肪瘦素的存在，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對脂肪的認知才得以改變。脂肪組織不但可以作為人體能量的儲存“庫房”，同時其自身也具有活躍的內(nèi)分泌功能，包括脂肪因子等，在人體能量穩(wěn)態(tài)及調(diào)控糖、脂代謝平衡的維持中，發(fā)揮著重要作用。近年來，針對脂肪因子的研究越來越受到學(xué)術(shù)界的關(guān)注[8-10]，因涉及醫(yī)學(xué)倫理學(xué)原因，許多研究只能是局限于人體血清學(xué)和體內(nèi)組織學(xué)的表象研究，而進一步更深層次的研究，如對于基因表達（過表達或沉默）與疾病的關(guān)系研究，只能以體外實驗方式進行，常見的是細胞培養(yǎng)和動物模型。體外前脂肪細胞的培養(yǎng)，對于研究脂肪細胞、脂肪因子、相應(yīng)細胞因子等與相關(guān)疾病的關(guān)系，具有重要的作用。同時，作為理想的脂肪細胞研究模型，有利于觀察各種相關(guān)因素在脂肪組織發(fā)生、增殖及肥大整個演變過程中的調(diào)控作用，有助于對相關(guān)機制進行深入研究。

近年來，隨著對人體脂肪組織大量研究工作的開展，對前脂肪細胞的原代培養(yǎng)方法、分離獲取能力也提出更高的要求。學(xué)者們的培養(yǎng)方法不盡一致，各操作者自身的經(jīng)驗不一，實驗室的條件也不盡相同，因而得出的結(jié)果和經(jīng)驗也各具特點[11-13]。對于人源前脂肪細胞培養(yǎng)，目前采用較多的是血管基質(zhì)組分細胞培養(yǎng)法，操作較為簡便，但最大的缺點是細胞的增殖和分化速度較慢，培養(yǎng)基中雜質(zhì)較多，并且容易出現(xiàn)細胞大小不均，導(dǎo)致后期實驗結(jié)果容易受到影響[12-13]。GARCIA等[14]曾提出細胞島學(xué)說，認為細胞島存在于成熟脂肪組織中，島內(nèi)細胞均為前脂肪細胞，具有高增殖速度和高分化能力，是脂肪組織的發(fā)源地，對脂肪組織的增生和肥大起至關(guān)緊要的作用。本研究筆者基于上述學(xué)說，總結(jié)前人經(jīng)驗，將天花板培養(yǎng)與脂肪組織塊貼壁的方法相結(jié)合，著重加強和改良消化方式，將多數(shù)文獻使用的消化方式（37℃、1 mg/mlⅠ型膠原酶，30～120 min）改良為按照1∶2體積比加入Ⅰ型膠原酶溶液（2 mg/ml），5%CO2培養(yǎng)箱，37℃消化3h，增加消化液使用量和濃度，延長消化時間，并且使用紅細胞裂解液37℃處理沉淀細胞5～10min，以去除殘留紅細胞的污染，從而盡可能地達到較好地消化效果。實踐證明上述改良是較為成功的，所得到培養(yǎng)細胞成分均一，數(shù)量較多，增殖較為旺盛，可能延長消化時間，更完全地消化成熟脂肪細胞，也更多地分離出細胞島中前脂肪細胞。

對于前脂肪細胞的判別標準，有學(xué)者提出必須滿足3個條件[15-16]：①細胞為經(jīng)典的梭形形態(tài)，脂肪組織來源，胞漿內(nèi)極少或無脂肪顆粒；②細胞增殖速度與同一個體的成纖維細胞類似，增倍時間短；③胰島素促進下，細胞在單層融合后能形成成熟脂肪細胞，胞內(nèi)可見脂肪滴，或者能檢出特異性酶或脂聯(lián)素。本研究取材于剖宮產(chǎn)GDM患者大網(wǎng)膜組織，經(jīng)過消化、過濾、離心等系列處理后得到一些長梭形細胞，光鏡下胞漿內(nèi)不見反光小滴，也不能被油紅O著色，培養(yǎng)之后細胞增殖快速，從細胞生長曲線可以看出，倍增時間約為48h，控制條件下可進行傳代培養(yǎng)，傳代細胞經(jīng)誘導(dǎo)后可出現(xiàn)分化，經(jīng)過油紅O染色，初步證實分化成功。脂聯(lián)素是目前國內(nèi)外已經(jīng)公認的成熟脂肪細胞特有的細胞因子[17-19]，運用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)對誘導(dǎo)分化前后的細胞進行脂聯(lián)素mRNA表達檢測，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)分化后的細胞有脂聯(lián)素mRNA的表達，而未經(jīng)誘導(dǎo)的傳代細胞未能檢測到脂聯(lián)素mRNA，從而證實誘導(dǎo)分化后的細胞為成熟脂肪細胞。而本實驗從網(wǎng)膜組織中分離得到的細胞，上述3個條件，是人源原代前脂肪細胞。

值得一提的是，本實驗中筆者在原代和傳代培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，原代前脂肪細胞第7天開始有部分細胞形態(tài)發(fā)生改變，逐漸由梭形變橢圓乃至圓形，并且光鏡下胞內(nèi)可見脂肪顆粒，第9天發(fā)現(xiàn)原代前脂肪細胞內(nèi)含有大量脂肪顆粒，說明大量原代細胞已自行分化為成熟脂肪細胞。而傳代后前脂肪細胞直至第12天仍繼續(xù)保持梭形，油紅O染色仍未著色，必須經(jīng)過誘導(dǎo)，才會出現(xiàn)細胞分化。本實驗中經(jīng)過多次重復(fù)培養(yǎng)，仍然出現(xiàn)該現(xiàn)象，證實GDM原代前脂肪細胞在體外培養(yǎng)過程中，會自然出現(xiàn)向成熟脂肪細胞分化，并不需要外加高濃度胰島素和地塞米松，而傳代后前脂肪細胞則出現(xiàn)失去分化的能力。原代前脂肪細胞會出現(xiàn)自然分化，無法傳代，可能與該現(xiàn)象有關(guān)。而該現(xiàn)象的發(fā)生，可能與原代細胞來源于體內(nèi)成熟脂肪組織，在體內(nèi)可能已經(jīng)被激活，或者仍然會攜帶某些體內(nèi)分化因子，與外加的誘導(dǎo)劑作用相類似[20]。而傳代后前脂肪細胞出現(xiàn)失去分化的能力，可能是隨著不斷傳代，與人體內(nèi)環(huán)境比較，體外培養(yǎng)環(huán)境出現(xiàn)越來越大的偏差，導(dǎo)致傳代細胞發(fā)生一定程度生物學(xué)特性的變化，并且該變化隨傳代數(shù)增加而表現(xiàn)越發(fā)明顯，具體表現(xiàn)為增殖和分化能力的不斷下降。本研究結(jié)果也證實，通常傳代在5代以內(nèi)時，細胞的增殖及分化能力尚可，再往后傳代則增殖和分化率開始降低。本實驗后期所做細胞凍存和復(fù)蘇實驗中，也發(fā)現(xiàn)冷凍保存的細胞最佳選擇為傳代第2代或第3代細胞，并且只宜凍存復(fù)蘇1次。同樣涉及到細胞增殖和分化能力降低的問題，也從一個側(cè)面說明本實驗?zāi)壳八褂脙龃婧蛷?fù)蘇技術(shù)還存在一定的缺陷，有待進一步改進。

綜上所述，GDM大網(wǎng)膜脂肪組織中具有前脂肪細胞，可進行連續(xù)傳代和大量擴增。經(jīng)適當誘導(dǎo)后可定向分化為成熟脂肪細胞。本課題組成功建立GDM患者大網(wǎng)膜前脂肪細胞原代培養(yǎng)及增殖的模型，為脂肪組織體外細胞學(xué)研究、脂肪因子體外表達研究、疾病發(fā)病機理等實驗研究奠定基礎(chǔ)。

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（童穎丹編輯）

Establishment of primary culture，proliferation and differentiation model of GDM preadipocytes*

Bao-long Pan，Run-mei Ma
（Kunming Medical University，Kunming，Yunnan 650031，China）

Objective To establish the model of primary culture，proliferation and differentiation of the gestational diabetes mellitus（GDM）epiploon preadipocytes，so as to lay the foundation for the follow-up study. Methods Using improved cell culture method，the pure fat tissue of greater omentum from GDM patients having cesarean section was used for the primary culture and passage.The growth curve of the preadipocytes was drawn.The adipocytes differentiated from preadipocytes after induction were determined by oil red O staining，and their adiponectin mRNA level was detected with RT-PCR to confirm the differentiation，and then the experimentsofcellcryopreservationandresuscitationwerecarriedout.ResultsTheprimarycultured preadipocytes were almost spindle cells with strong proliferation capacity.They began to proliferate rapidly on the 4th day，the doubling time was about 48 h.On the 7th day，the original generation of preadipocytes began to have fat particles，and the passage cells remained to be spindle without lipid drops.After induction，the passage preadipocytes showed oriented differentiation，oil red O staining and adiponectin mRNA measurement proved that the cells had differentiated into mature adipocytes.Conclusions Preadipocytes exit in GDM mature adipose tissue，can be continuously passaged and greatly amplified.In the culture progress，the original generation of preadipocytes will naturally differentiate into mature adipocytes，but the passaged preadipocyteslose the ability of differentiation，after appropriate induction，they can differentiate into mature fat cells. Keywords：preadipocyte；cell culture；cell model

R 714.255；R 589.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.19.003

1005-8982（2016）19-0011-06

2016-05-23

國家自然科學(xué)基金（No：81160082）

馬潤玫，E-mail：pbl6916@163.com