夏 雪 馬晨雨 白青河 馮園園 王順友 王 喜 周青利 席章?tīng)I(yíng)

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 小麥玉米作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南鄭州450002

玉米籽粒發(fā)育相關(guān)基因ZmMADS-RIN的克隆及表達(dá)分析

夏 雪 馬晨雨 白青河 馮園園 王順友 王 喜 周青利 席章?tīng)I(yíng)*

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 小麥玉米作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南鄭州450002

玉米籽粒發(fā)育及產(chǎn)量是玉米重要的經(jīng)濟(jì)性狀。本研究以玉米骨干自交系鄭58為試材, 采用同源克隆法得到一個(gè)與玉米籽粒發(fā)育相關(guān)的基因ZmMADS-RIN。該基因的cDNA全長(zhǎng)859 bp, 開(kāi)放閱讀框?yàn)?68 bp, 編碼255個(gè)氨基酸, 與玉米B73中所對(duì)應(yīng)的cDNA的編碼區(qū)序列相比, 共有6個(gè)SNP位點(diǎn)的差異, 3個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了變化。生物信息學(xué)分析表明, ZmMADS-RIN蛋白的相對(duì)分子量為29.23 kD, 理論等電點(diǎn)為8.84, 是一種親水性蛋白, 不含信號(hào)肽序列, 也不含跨膜結(jié)構(gòu); 具有5個(gè)磷酸化位點(diǎn); 二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有50.20%的α-螺旋(alpha helix)、27.45%的無(wú)規(guī)則卷曲(random coil)、14.51%的延伸鏈(extended strand)和7.84%的β-轉(zhuǎn)角(beta turn)。該蛋白位于細(xì)胞核內(nèi); 其氨基酸序列中含有高度保守的MADS結(jié)構(gòu)域、相對(duì)保守的K結(jié)構(gòu)域、低保守的I結(jié)構(gòu)域和最不穩(wěn)定的C結(jié)構(gòu)域, 是典型的MIKC 型MADS-box蛋白; 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明, ZmMADS-RIN蛋白屬于A(yíng)GL6分支, 與水稻基因OsMADS6的相似性最高, 為89%。ZmMADS-RIN基因在玉米自交系鄭58的籽粒中特異表達(dá), 在根及不同時(shí)期的葉片中沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)信號(hào)。熒光定量PCR結(jié)果顯示, ZmMADS-RIN基因的表達(dá)量在玉米籽粒發(fā)育的不同階段呈一定規(guī)律的變化, 在授粉后0~20 d, 呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì), 授粉后25 d表達(dá)量迅速下降至較低水平, 而在授粉后30~40 d則檢測(cè)不到其表達(dá)。推測(cè)該基因可能與玉米籽粒的發(fā)育有關(guān)。

玉米; 籽粒發(fā)育; ZmMADS-RIN; 基因克隆; RT-PCR

MADS-box基因編碼一種重要的轉(zhuǎn)錄因子, 參與調(diào)節(jié)真核生物的發(fā)育過(guò)程和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[1], 該種基因的名稱(chēng)是由釀酒酵母細(xì)胞調(diào)節(jié)因子 MCM1 (Minichromosome maintenance 1)、擬南芥花器官特征基因 AG (AGAMOUS)、金魚(yú)草花器官特征基因DEF (DEFICIENS)和人類(lèi)血清應(yīng)答因子SRF (Serum Response Factor)的蛋白首字母的縮寫(xiě)組成的[2-3]。研究表明, 這種轉(zhuǎn)錄因子中都含有一個(gè)由 56~58個(gè)氨基酸組成的高度保守的MADS-box結(jié)構(gòu)域, 故將具有這一結(jié)構(gòu)域的基因統(tǒng)稱(chēng)為MADS-box基因[2-3]。

目前, 已經(jīng)從不同的植物中分離到了大量的MADS-box基因, 例如, 擬南芥中有132個(gè)MADS-box基因, 水稻中有97個(gè)MADS-box基因, 番茄中有 36個(gè) MADS-box基因[4-5], 大豆中有 106個(gè)MADS-box基因[6]等。大量研究證明, 植物中的MADS-box基因表達(dá)的蛋白能與真核基因啟動(dòng)子區(qū)域中的順式作用元件特異結(jié)合, 從而使靶基因以特定的強(qiáng)度在特定的時(shí)間和空間表達(dá)[7], 并在生物體中通過(guò)調(diào)節(jié)其他基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)發(fā)揮其調(diào)控作用。植物MADS-box基因的功能主要集中在開(kāi)花時(shí)間的調(diào)控、分生組織和花器官功能決定等方面, 包括營(yíng)養(yǎng)器官如葉和根的發(fā)育甚至根瘤的形成[8-9]、頂端分生組織的分化[10-11]、花器官的決定[2]、激素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[12]、開(kāi)花時(shí)間的控制[13]、光合作用和營(yíng)養(yǎng)代謝的調(diào)控[14]、以及非生物脅迫應(yīng)答[4]等。近年來(lái)有關(guān)MADS-box基因?qū)麑?shí)的發(fā)育和成熟[15-17]以及胚的發(fā)育[18-19]的調(diào)節(jié)作用的研究越來(lái)越多, 在水稻[20]、大豆[15]、番茄[16,21-22]、擬南芥[23-24]、草莓[25-26]等物種上均有報(bào)道, 說(shuō)明這個(gè)基因家族具有不同的調(diào)節(jié)功能[27-28]。

眾所周知, 植物的果實(shí)是人類(lèi)和動(dòng)物食物中的重要組成部分, 因此, 研究果實(shí)的發(fā)育和成熟對(duì)于確保人類(lèi)的食物安全具有重要意義。番茄通常被作為一種研究果實(shí)發(fā)育和成熟的模式作物, 研究番茄果實(shí)成熟機(jī)制的文獻(xiàn)比較多, 也發(fā)現(xiàn)了許多番茄果實(shí)成熟缺陷的突變體, 如成熟抑制(ripening inhibitor, rin)、從不成熟(never ripe, Nr)、不成熟(nonripening, nor)、顏色不成熟(color nonripening, cnr)等[17,29]。其中rin突變體具有較大的萼片, 并且抑制果實(shí)成熟。這種突變型是由于 2個(gè) MADS-box轉(zhuǎn)錄因子(SlMADS-MC和 SlMADS-RIN)的功能缺失造成的。其中SlMADS-MC參與萼片的發(fā)育, 而SlMADS-RIN則調(diào)節(jié)果實(shí)成熟, 是番茄果實(shí)成熟過(guò)程中的一個(gè)重要的正向調(diào)控因子, 其與乙烯的生物合成、感知乙烯和乙烯響應(yīng)有關(guān)[17]。該基因的發(fā)現(xiàn), 對(duì)于研究果實(shí)發(fā)育與成熟機(jī)制具有重要的意義。

在玉米中, 有142個(gè)MADS-box基因被注釋在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)(plant transcription factor database PlnTFDB)中, 其中的36個(gè)已經(jīng)被克隆[4,30]。它們中的大多數(shù)都參與花發(fā)育的調(diào)控, 如卵細(xì)胞、小花、小穗的發(fā)育以及花粉管生長(zhǎng)、花藥開(kāi)裂和花粉成熟[4]等。Malcomber等[31]發(fā)現(xiàn)玉米的LEAFY HULL STERILE1 (LHS1)基因在小穗、小花中不同的表達(dá)模式導(dǎo)致了花序形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。ZMM8和 ZMM14這兩個(gè)基因只在發(fā)育小穗的上位花中表達(dá), 對(duì)上位小花分生組織的分化起決定性作用[7]。ZAG3 (即bde)[32]能夠影響玉米分生組織的發(fā)育和決定性, 在bde突變體中, 上部花分生組織促進(jìn)形成額外的鑲嵌或者融合花器官, 而下部分生組織則產(chǎn)生一些額外的花分生組織。Becker等[7]發(fā)現(xiàn)玉米的 ZAG2基因在胚珠中特異表達(dá), 該基因在胚珠和心皮的內(nèi)表面上表達(dá), 其氨基酸序列與水稻胚珠特異基因OsMADS13[33]的同源性為 65.31%, 屬于 MADS-box基因家族中的AGAMOUS(AG)-like亞家族。相對(duì)而言, MADS-box基因?qū)τ谟衩鬃蚜０l(fā)育調(diào)控的研究非常少。

為了研究玉米中MADS-box基因?qū)ψ蚜０l(fā)育的調(diào)控, 本研究利用番茄中調(diào)節(jié)果實(shí)成熟發(fā)育的基因LeMADS-RIN (AF448522)[17,34]的氨基酸序列對(duì)玉米B73的all maize protein sequences數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.maizegdb.org/)進(jìn)行同源搜索, 發(fā)現(xiàn)一個(gè)未知其功能的 MADS-box蛋白(GenBank登錄號(hào)為 ACF80378,其對(duì)應(yīng)的基因 GenBank登錄號(hào)為 BT035373.1), 其氨基酸序列與番茄LeMADS-RIN的氨基酸序列的同源性為 53.57%, 經(jīng)序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn), 該基因的氨基酸序列與辣椒中調(diào)節(jié)果實(shí)成熟發(fā)育的基因 CaRIN (DQ999998)[3 5]、草莓中果實(shí)特異表達(dá)的基因FaMADS9 (AF484683)[26]、葡萄中籽粒發(fā)育相關(guān)基因VvMADS39 (XM_002263003)[36]和香蕉中果實(shí)發(fā)育與成熟相關(guān)的基因MuMADS1 (DQ060444)[37]的氨基酸序列的同源性分別為52%、51%、51%和52%, 說(shuō)明它與以上調(diào)控果實(shí)發(fā)育的基因有著相對(duì)較高的同源性, 并且該基因中含有 MADS-box基因家族高度保守的MADS結(jié)構(gòu)域, 以及相對(duì)較保守的K結(jié)構(gòu)域,故將其命名為ZmMADS-RIN。本研究以玉米骨干自交系鄭58為試驗(yàn)材料, 從其籽粒中克隆了 ZmMADSRIN基因, 并進(jìn)行表達(dá)分析, 旨在為進(jìn)一步研究該基因調(diào)控玉米籽粒發(fā)育和成熟機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 玉米骨干自交系鄭58, 由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。將其種子播種于裝有蛭石的花盆中, 長(zhǎng)至三葉期時(shí), 用無(wú)菌水清洗根和葉片,再用干凈的吸水紙吸干, 液氮冷凍后保存于-80℃冰箱中。

將玉米骨干自交系鄭58的種子于2015年6月種植于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)鄭州毛莊科教園區(qū)(34°51′54.66″ N, 113°35′12.11″ E), 在大田中隨機(jī)選取生長(zhǎng)良好且長(zhǎng)勢(shì)一致的植株, 分別于五葉期、十葉期采集其葉片, 3次重復(fù); 自交授粉當(dāng)天標(biāo)記授粉日期, 隨后取授粉后0、5、10、15、20、25、30、35、40 d的籽粒, 液氮冷凍后保存于-80℃冰箱中備用。

1.1.2 主要試劑和菌株 柱式植物 RNA提取試劑盒CAT#: 71203購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司; FastQuant RT Kit (with gDNase)第1鏈合成試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司; Premix Taq (LA Taq Version 2.0 plus dye)、pMD18-T Vector Cloning Kit均購(gòu)自 TaKaRa (大連)公司; 大腸桿菌 DH5α Competent Cell、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基配制所需試劑(Tryptone, Yeart Extract, 瓊脂糖)均購(gòu)自康為世紀(jì)公司; 實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒GoTaq qPCR Master Mix購(gòu)自Promega (北京)生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA合成 取適量試驗(yàn)材料,置于經(jīng)高溫處理并用液氮預(yù)冷過(guò)的研缽中, 加液氮研磨, 按照天恩澤 CAT#: 71203試劑盒的操作說(shuō)明提取玉米骨干自交系鄭 58的幼苗長(zhǎng)至三葉期的根和葉片, 長(zhǎng)至五葉期、十葉期的葉片, 以及授粉后0、5、10、15、20、25、30、35、40 d的籽粒的總RNA,并用分光光度計(jì)檢測(cè) RNA的純度, 用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RNA的完整性, 于-80℃冰箱保存。用FastQuant RT Kit (with gDNase)第1鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA第 1鏈, 并以此為模板, 以玉米18S基因[38]作為內(nèi)參對(duì)照設(shè)計(jì)引物18S-F、18S-R (表1), PCR擴(kuò)增玉米18S基因, 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為174 bp, PCR反應(yīng)結(jié)束后取10 μL反應(yīng)物, 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)第1鏈合成的質(zhì)量。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物儲(chǔ)存于-20℃冰箱中用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 特異性引物設(shè)計(jì)及克隆 根據(jù)目前已公布的玉米 B73 all maize protein sequences數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.maizegdb.org/)中 MADS-box蛋白(GenBank登錄號(hào)為 ACF80378, 其對(duì)應(yīng)的基因 GenBank登錄號(hào)為BT035373.1)的cDNA序列, 利用Primer 5.0在開(kāi)放閱讀框兩端設(shè)計(jì)引物ZmMADS-RIN-F、ZmMADS-RIN-R(表1), 以玉米骨干自交系鄭 58授粉后 5 d的籽粒的cDNA為模板, 擴(kuò)增ZmMADS-RIN基因的全長(zhǎng)cDNA序列, PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 并使用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒純化回收目的條帶, 連接pMD-18T載體, 轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞并涂板, 將菌液PCR檢測(cè)的陽(yáng)性克隆送華大基因科技公司測(cè)序。

1.2.3 ZmMADS-RIN基因的生物信息學(xué)分析、序列比對(duì)以及進(jìn)化樹(shù)分析 利用在線(xiàn)工具 ProtParam tool分析ZmMADS-RIN基因編碼的蛋白的理化性質(zhì);利用 Signalp 4.1 server軟件預(yù)測(cè)信號(hào)肽; 利用TMHMM Server v.2.0在線(xiàn)軟件分析跨膜結(jié)構(gòu); 利用在線(xiàn)工具 SOPMA軟件分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu); 運(yùn)用Netphos 2.0 server軟件預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn); 用PSORT II Prediction預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位; 運(yùn)用ProtScale在線(xiàn)分析軟件預(yù)測(cè)疏水性/親水性; 利用 SMART網(wǎng)站(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析蛋白的結(jié)構(gòu)域;使用DNAMAN Version 6.0軟件將ZmMADS-RIN與B73的all maize protein sequences數(shù)據(jù)庫(kù)中GenBank登錄號(hào)為 BT035373.1的基因的編碼區(qū)序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列進(jìn)行差異分析, 同時(shí)與番茄 LeMADSRIN (AF448522)[17,34]、辣椒CaRIN (DQ999998)[35]、草莓 FaMADS9 (AF484683)[26]、葡萄 VvMADS39 (XM_002263003)[36]和香蕉MuMADS1 (DQ060444)[37]基因的氨基酸序列比對(duì)分析; 用MEGA 6軟件結(jié)合NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)將 ZmMADS-RIN蛋白序列與玉米中已克隆的36個(gè)MADS-box蛋白序列[4,30], 以及番茄中的13個(gè)、水稻中的7個(gè)和擬南芥中的15個(gè), 共72個(gè)MADS-box基因的蛋白序列進(jìn)行分子進(jìn)化樹(shù)分析。

1.2.4 ZmMADS-RIN基因相對(duì)表達(dá)量分析 以玉米骨干自交系鄭 58不同部位(三葉期的根和葉片,五葉期和十葉期的葉片, 以及授粉后5 d的籽粒)的cDNA 為模板, 通過(guò) RT-PCR 反應(yīng), 進(jìn)行ZmMADS-RIN基因器官特異性表達(dá)分析。反應(yīng)體系含Premix Taq (LA Taq Version 2.0 plus dye) 12.5 μL,引物 ZmMADS-RIN-F、ZmMADS-RIN-R (表1)(10 μmol L–1)各0.8 μL, cDNA模板2 μL, 加水至終體積25 μL。反應(yīng)條件為95℃ 180 s; 94℃ 30 s, 55℃ 50 s, 72℃ 60 s, 35個(gè)循環(huán); 72℃ 600 s; 4℃保存。同時(shí)以玉米18S基因[38]作為內(nèi)參對(duì)照, 將擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳分離。

以玉米骨干自交系鄭58不同生長(zhǎng)時(shí)期的籽粒的cDNA為模板, 以玉米18S基因[38]作為內(nèi)參基因, 將目的基因的 cDNA序列與基因組 DNA序列比對(duì),在基因的編碼序列中跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物Q-PCR-F、Q-PCR-R (表1), PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為199 bp。按照 Promega的實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒 GoTaq qPCR Master Mix的說(shuō)明書(shū)操作, 反應(yīng)體系含GoTaq qPCR Master Mix 2 ×12.5 μL, 引物 Q-PCR-F、Q-PCR-R (表1)(10 μmol L–1)各0.8 μL, cDNA模板2 μL, 加水至終體積25 μL。使用Biorad chorom 4實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀擴(kuò)增, 反應(yīng)條件為94℃ 180 s; 94 ℃ 10 s, 58℃ 20 s, 72℃ 20 s, 40個(gè)循環(huán); 72℃讀取熒光值; 循環(huán)結(jié)束后 60℃保溫 60 s; 進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析, 由熔解曲線(xiàn)判定PCR反應(yīng)的特異性。進(jìn)行3 次PCR重復(fù), 參照基因的2–ΔΔCt法[39]計(jì)算結(jié)果。

表1 基因克隆及其熒光定量PCR分析所用引物Table1 Primers used for gene cloning and analysis of real-time PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米自交系鄭58總RNA的提取與cDNA第1鏈的合成、檢測(cè)

用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 提取的玉米各部分的RNA條帶清晰, 說(shuō)明RNA完整性良好, 無(wú)明顯降解。對(duì)經(jīng)FastQuant RT Kit (with gDNase)試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第1鏈進(jìn)行18S基因[38]內(nèi)參對(duì)照擴(kuò)增檢測(cè), 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示, 目的條帶清晰, 說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄的cDNA質(zhì)量良好。

2.2 ZmMADS-RIN基因的克隆

以反轉(zhuǎn)錄的授粉后5 d的籽粒的cDNA第1鏈為模板, 利用設(shè)計(jì)的引物 ZmMADS-RIN-F、ZmMADS-RIN-R進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增, 擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到1條約1000 bp的條帶, 和預(yù)測(cè)的目的片段大小一致(圖1)。目的條帶經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化后, 挑取單克隆進(jìn)行菌液檢測(cè)。將陽(yáng)性菌液測(cè)序經(jīng)BioXM 2.6處理發(fā)現(xiàn), 該基因的cDNA全長(zhǎng)為859 bp, 開(kāi)放閱讀框?yàn)?68 bp, 將其與玉米B73的all maize protein sequences數(shù)據(jù)庫(kù)中BT035373.1對(duì)應(yīng)的cDNA的編碼區(qū)序列比對(duì)(圖2)發(fā)現(xiàn), 共有 6個(gè)核苷酸(SNP)位點(diǎn)的差異, 對(duì)應(yīng)有3個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了變化。

2.3 ZmMADS-RIN蛋白生物信息學(xué)分析

圖1 ZmMADS-RIN基因的cDNA擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of ZmMADS-RIN cDNA

ZmMADS-RIN基因編碼的蛋白生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn), 該蛋白由 255個(gè)氨基酸組成, 分子式為C1275H2028N380O381S14, 相對(duì)分子量為29.23 kD, 理論等電點(diǎn)(pI)為 8.84, 其不穩(wěn)定參數(shù)為 49.18, 屬于不穩(wěn)定蛋白。該基因編碼的多肽含亮氨酸(Leu, L)最多, 達(dá) 11.4%; 其次是谷氨酸(Glu, E), 為 9.80%。其中,帶負(fù)電荷的氨基酸(Asp +Glu)殘基總數(shù)為29個(gè), 帶正電荷的氨基酸(Arg +Lys)殘基總數(shù)為34個(gè), 不含吡咯賴(lài)氨酸(Pyl, O)和硒半胱氨酸(Sec, U), 其總的疏水性平均系數(shù)(GRAVY)為-0.704, 屬于親水性蛋白。該蛋白不含信號(hào)肽序列, 屬于非分泌蛋白; 也不含跨膜結(jié)構(gòu), 為非跨膜蛋白。該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)類(lèi)型為α-螺旋(alpha helix)50.20%; 無(wú)規(guī)則卷曲(random coil)和延伸鏈(extended strand)分別為27.45%和14.51%; β-轉(zhuǎn)角(beta turn)的比例最小, 為7.84%。該蛋白序列中含有16個(gè)絲氨酸(S), 其中5個(gè)可能是磷酸化位點(diǎn)。該蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)(細(xì)胞核: 60.9%, 細(xì)胞質(zhì): 17.4%, 線(xiàn)粒體: 17.4%, 細(xì)胞骨架: 4.3%)。

圖2 鄭58 ZmMADS-RIN與B73 BT035373.1的編碼區(qū)的差異分析Fig.2 Variable analysis between ZmMADS-RIN of Zheng 58 and BT035373.1 of B73 in coding region方框內(nèi)表示具有差異的編碼序列。The differences in coding region are marked with box.

ZmMADS-RIN蛋白的親水性和疏水性預(yù)測(cè)分析(圖3)顯示, 在33~50位氨基酸表現(xiàn)極強(qiáng)的疏水性,其他序列則均表現(xiàn)親水性, 總體來(lái)說(shuō)表現(xiàn)親水性,與之前預(yù)測(cè)的總的疏水性平均系數(shù)(GRAVY)值的預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。

圖3 ZmMADS-RIN蛋白的親水性/疏水性預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of hydrophilicity/hydrophobicity for ZmMADS-RIN protein

該蛋白含有 MADS結(jié)構(gòu)域(1~60), 具有與特異DNA結(jié)合和蛋白質(zhì)二聚化等功能; 以及 K結(jié)構(gòu)域(118~175), 形成 3個(gè) α螺旋組成的卷曲—卷曲(coiled-coil)結(jié)構(gòu), 參與蛋白質(zhì)間的相互作用。將ZmMADS-RIN 蛋 白 與 番 茄 LeMADS-RIN (AAM15775.1)[17,34]、辣椒CaRIN (ABJ98752.1)[35]、草莓FaMADS9 (AAO49380.1)[26]、葡萄VvMADS39 (XP_002263039.1)[36]和香蕉MuMADS1 (AAY53908.1)[37]的氨基酸序列比對(duì)(圖4), 發(fā)現(xiàn)這6個(gè)物種的氨基酸序列中的MADS結(jié)構(gòu)域和K結(jié)構(gòu)域在物種間具有高度的相似性。

進(jìn)化樹(shù)(圖5)分析表明, ZmMADS-RIN基因的蛋白序列屬于A(yíng)GL6分支, 其他的玉米MADS-box基因的蛋白序列則屬于不同的亞家族。ZmMADS-RIN基因的蛋白序列與AGL6分支中的一個(gè)調(diào)控胚珠發(fā)育的水稻基因OsMADS6[40]的相似度最高, 為89%。

圖4 玉米ZmMADS-RIN蛋白與其他植物物種蛋白的氨基酸序列比對(duì)Fig.4 Homology analysis of the deduced amino acid sequences from ZmMADS-RIN and those of other plant species

2.4 ZmMADS-RIN基因表達(dá)分析

2.4.1 組織特異性表達(dá)分析 半定量 RT-PCR分析結(jié)果(圖6)表明, 該基因主要在玉米籽粒中表達(dá),而在三葉期的根和葉片、五葉期以及十葉期的葉片中均沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)信號(hào)。

2.4.2 在籽粒發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)分析 圖7表明,該基因的表達(dá)量在玉米自交系鄭58籽粒發(fā)育的不同階段呈現(xiàn)一定規(guī)律的變化, 在授粉后0~20 d, 籽粒中ZmMADS-RIN基因的表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì), 且在授粉后20 d達(dá)最高峰, 之后迅速下降, 在授粉后25 d已降到較低水平, 而在授粉后30~40 d則檢測(cè)不到其表達(dá)。

3 討論

序列分析結(jié)果顯示, ZmMADS-RIN基因所推導(dǎo)的氨基酸序列有高度保守的MADS結(jié)構(gòu)域, 相對(duì)保守的K結(jié)構(gòu)域, 低保守的I結(jié)構(gòu)域和最不穩(wěn)定的C結(jié)構(gòu)域(圖4), 說(shuō)明該蛋白是典型的 MIKC型MADS-box蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示, ZmMADSRIN基因的蛋白序列屬于 AGL6分枝, 其蛋白序列與 AGL6分支中的一個(gè)調(diào)控胚珠發(fā)育的水稻基因OsMADS6[40]的蛋白序列的相似度最高, 為89%。組織特異性表達(dá)分析顯示, ZmMADS-RIN基因在玉米籽粒中高度表達(dá)。以上結(jié)果表明, ZmMADS-RIN基因可能參與籽粒的發(fā)育。一般來(lái)說(shuō), MADS-box基因的表達(dá)部位與其功能密切相關(guān)。本研究中 ZmMADSRIN基因的這種表達(dá)模式與其他植物中調(diào)控果實(shí)發(fā)育的MADS-box基因的表達(dá)模式相似, 即主要在生殖器官中表達(dá)。如水稻中調(diào)控胚珠發(fā)育的基因OsMADS6[40]在花和發(fā)育中的種子中高度表達(dá), 但是在根、葉和懸浮細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到, OsMADS13[33]主要在胚珠中大量表達(dá), 而 OsMADS21[41]只在發(fā)育的種子中表達(dá); 大豆種子發(fā)育調(diào)控的基因GmAGL15[15]在幼胚中表達(dá)量最高; 番茄中與果實(shí)發(fā)育有關(guān)的基因TAG1、TAGL1、TAGL2和TAGL11[42]只在花和果實(shí)中表達(dá), SlMADS1[29]在萼片和果實(shí)中高度表達(dá), LeMADS-RIN[17,34]主要在果實(shí)中表達(dá); 擬南芥中調(diào)控籽粒發(fā)育的基因SHP1和SHP2[28]在籽粒中高度表達(dá), 調(diào)控果實(shí)開(kāi)裂。

圖5 玉米、番茄、水稻和擬南芥中MADS-box蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析Fig.5 Phylogenetic analysis of MADS-box proteins from Zea mays, Solanum lycopersicum, Oryza sativa, and Arabidopsis thaliana

圖6 ZmMADS-RIN基因在不同器官中的表達(dá)Fig.6 RT-PCR analysis of ZmMADS-RIN gene in different organs

圖7 ZmMADS-RIN基因在不同授粉天數(shù)的籽粒中的表達(dá)Fig.7 Expression of ZmMADS-RIN gene in developing kernel

近年來(lái)的研究表明, 大量MADS-box基因與果實(shí)發(fā)育和成熟相關(guān), 因此研究其在果實(shí)中的表達(dá)趨勢(shì), 對(duì)其功能的發(fā)掘有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn), 水稻的 OsMADS6基因[40]在胚珠中減數(shù)分裂時(shí)期大量表達(dá), 授粉后10 d的胚乳中表達(dá)量最高, 授粉后20 d在胚乳中的表達(dá)量略有降低; 而OsMADS13基因[33]在胚珠中高度表達(dá), 并隨著胚珠的發(fā)育表達(dá)量不斷提高。大豆的 GmAGL15基因[15]在大豆發(fā)育的種子中都有表達(dá), 它在花后15 d的幼胚中表達(dá)量比較高,出現(xiàn)第一個(gè)峰值, 而在花后30 d的幼胚中表達(dá)量最高, 然后迅速下降, 這種表達(dá)模式明顯與種子的發(fā)育過(guò)程有關(guān)。番茄的 TAG1基因受精前在胚珠和心皮中高度表達(dá), 受精后大大降低, 然后隨著果實(shí)的發(fā)育逐漸減少直至沒(méi)有; TAGL1基因和TAGL11基因在花和種子中的表達(dá)模式相似, 優(yōu)先表達(dá)于發(fā)育的種子中, 受精后仍然高度表達(dá), 且沒(méi)有明顯變化; TAGL2基因在種子中高度表達(dá), 但是隨著種子的成熟而不斷減少[42]; SlMADS1基因[29]的轉(zhuǎn)錄物主要積累在果實(shí)中, 并隨著果實(shí)的發(fā)育和成熟而不斷減少; 而LeMADS-RIN基因[17,34]的表達(dá)量在果實(shí)中隨著果實(shí)的成熟而不斷提高。由此看來(lái), 不同的MADS-box家族基因在植物的果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)趨勢(shì)不盡相同。本研究表明, ZmMADS-RIN基因的表達(dá)量在玉米自交系鄭58籽粒發(fā)育的不同階段呈現(xiàn)一定規(guī)律的變化, 在授粉后0~20 d, 籽粒中ZmMADS-RIN基因的表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì), 且在授粉后 20 d達(dá)最高峰,之后迅速下降, 在授粉后 25 d已降到較低水平, 而在授粉后30~40 d則檢測(cè)不到其表達(dá)。這些結(jié)果表明, ZmMADS-RIN基因可能與玉米籽粒的發(fā)育有關(guān)。同時(shí), 參考張冬梅等[43]的研究結(jié)果, 玉米骨干自交系鄭58的籽粒灌漿速率整體表現(xiàn)為快–快–慢的節(jié)奏,即籽粒的平均灌漿速率表現(xiàn)出在授粉后前20 d迅速增快, 授粉后20~30 d緩慢加快, 而在授粉后30~40 d明顯減慢的趨勢(shì)。很明顯, 玉米骨干自交系鄭 58的籽粒的平均灌漿速率的變化趨勢(shì)與本研究中ZmMADS-RIN基因的表達(dá)趨勢(shì)基本一致, 說(shuō)明ZmMADS-RIN基因很可能與玉米籽粒的平均灌漿速率有關(guān)。至于該基因在調(diào)控玉米籽粒發(fā)育過(guò)程的機(jī)制中的確切作用, 將在后續(xù)研究中探討。

4 結(jié)論

玉米骨干自交系鄭58的ZmMADS-RIN基因與玉米B73中所對(duì)應(yīng)的cDNA的編碼區(qū)序列相比, 共有6 個(gè)SNP位點(diǎn)的差異, 對(duì)應(yīng)的氨基酸序列有3個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了變化。ZmMADS-RIN蛋白是一種親水性蛋白, 不含信號(hào)肽序列, 位于細(xì)胞核內(nèi), 具有高度保守的MADS結(jié)構(gòu)域, 相對(duì)保守的K結(jié)構(gòu)域, 低保守的I結(jié)構(gòu)域和最不穩(wěn)定的 C結(jié)構(gòu)域, 是典型的 MIKC型MADS-box蛋白, 與水稻基因OsMADS6的蛋白序列的相似性最高。ZmMADS- RIN基因在玉米籽粒中高度表達(dá), 其表達(dá)量在玉米籽粒發(fā)育的不同階段呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律, 授粉后0~20 d表達(dá)上調(diào), 出現(xiàn)一個(gè)明顯的表達(dá)高峰, 授粉后 25 d表達(dá)量迅速下降至較低水平,而在授粉后30~40 d則檢測(cè)不到其表達(dá)。ZmMADS-RIN基因很可能與玉米籽粒的平均灌漿速率有關(guān)。

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Cloning and Expression Analysis of ZmMADS-RIN Gene for Regulating the Kernel Development of Maize

XIA Xue, MA Chen-Yu, BAI Qing-He, FENG Yuan-Yuan, WANG Shun-You, WANG Xi, ZHOU Qing-Li, and XI Zhang-Ying*
College of Agronomy, Henan Agricultural University / State Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science, Zhengzhou 450002, China

Kernel development is the most important character of maize.In this study, a maize gene named ZmMADS-RIN encoding MADS-box protein relating to kernel development was isolated.The full length cDNA of ZmMADS-RIN is 859 bp, and it contains an open reading frame (ORF) with 768 nucleotides and encodes 255 amino acid residues.The variable analysis of ZmMADS-RIN in coding region showed that six nucleotides and three amino acid residues were different between Zheng 58 and B73.Bioinformatics analyses showed that ZmMADS-RIN was a hydrophilic protein with a molecular weight of 29.23 kD, a theoretical isoelectric point of 8.84, and five phosphorylation sites, but signal peptide sequence and transmembrane domain were not found.The secondary structure of ZmMADS-RIN protein contained 50.20% of alpha helix, 27.45% of random coil, 14.51% of extended strand and 7.84% of beta turn.ZmMADS-RIN protein was tested to be a typical MIKC-type protein localized in nucleus with highly conserved MADS domain, relatively conserved K domain, less weakly conserved I domain and most variable C domain.Phylogenetic analysis indicated that ZmMADS-RIN protein belongs to the same branch of AGL6, and shows high similarity of 89% to OsMADS6 protein from Oryza sativa.RT-PCR results showed that ZmMADS-RIN expressed in kernel specially, and not in root or leaf during different phases.In addition, qRT-PCR results indicated that the expression of ZmMADS-RIN increased continually from zero day to 20 days after pollination, and reached the highest level at the 20th day, then decreased significantly.And it could not be detected during 30th-40th days.These results demonstrated that ZmMADS-RIN might be associated with theregulation of developing kernel in maize.

Maize; Kernel development; ZmMADS-RIN; Gene cloning; RT-PCR

10.3724/SP.J.1006.2016.01656

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371629)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31371629).

*通訊作者(Corresponding author): 席章?tīng)I(yíng), E-mail: xizhangying@163.com

聯(lián)系方式: E-mail: xiaxue282522@163.com

稿日期): 2016-02-04; Accepted(接受日期): 2016-06-20; Published online(

日期): 2016-07-04.URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160704.0826.020.html