張曉東 李彩霞 王元忠

(1.玉溪師范學院資源環(huán)境學院，玉溪 653100； 2.云南省農(nóng)業(yè)科學院藥用植物研究所，昆明 650223)

* 通信作者：E-mail:boletus@126.com

滇龍膽GrCMS基因的克隆與表達分析

張曉東1李彩霞1王元忠2*

(1.玉溪師范學院資源環(huán)境學院，玉溪 653100；2.云南省農(nóng)業(yè)科學院藥用植物研究所，昆明 650223)

2-C-甲基-D-赤蘚醇4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶是赤蘚糖磷酸酯(MEP)途徑中的第三個催化酶。以滇龍膽轉(zhuǎn)錄組為基礎，采用RT-PCR技術從滇龍膽幼葉克隆2-C-甲基-D-赤蘚醇4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶基因GrCMS，并進行原核表達和組織特異性表達分析。序列分析顯示，GrCMS基因(登錄號KJ917164)開放閱讀框(ORF)長933 bp，編碼310氨基酸，推測分子量為34.23 kD，等電點為7.68。蛋白質(zhì)序列分析顯示，GrCMS無信號肽，為親水穩(wěn)定蛋白，主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構成，可能定位葉綠體；具有CMS保守結構域。進化分析結果表明，GrCMS蛋白與長春花CrCMS蛋白親緣關系最近。原核表達結果表明，GrCMS與預期蛋白大小一致。定量PCR結果表明，GrCMS基因主要在葉中表達。結果為進一步研究該基因功能和龍膽苦苷生物合成途徑奠定基礎。

滇龍膽；2-C-甲基-D-赤蘚醇4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶；基因克??；表達分析

滇龍膽(Gentianarigescens)為常用大宗藥材，是200多種中藥的主要成分[1]。近年來，龍膽市場需求量年遞增約10%，國內(nèi)外市場對龍膽的需求量高達3 000～4 000噸，導致野生滇龍膽遭到人為大肆破壞[1]。2013年7月，云南省啟動了龍膽草航天育種工程，其目標主要是提高主要藥效成分龍膽苦苷含量、抗逆性和擴大種植范圍[2]。由于龍膽屬區(qū)域性分布物種，在世界上其它國家，許多龍膽屬植物也都相繼成為瀕危物種[3]。要解決龍膽藥源問題和保護其野生資源，必須弄清其主要藥效成分龍膽苦苷的生物合成途徑及其調(diào)控機理，為培育龍膽新品種和通過生物工程手段生成龍膽苦苷提供幫助。

在植物中，龍膽苦苷是通過質(zhì)體赤蘚糖磷酸酯(MEP)途徑和胞質(zhì)甲羥戊酸途徑(MVA)合成的[2,4]。2-C-甲基-D-赤蘚醇4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶(2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphatecytidyltransferase，EC 2.7.7.60，在已報道文獻中簡寫為CMS、MCT、ispD、ATMEPCT、IspD)是MEP途徑中的第三個催化酶，能催化2-C-甲基-D-赤蘚醇4-磷酸(MEP)生成4-胞苷-5-磷酸-2-C-甲基-D-赤蘚醇(CDP-ME)，該反應依賴于CTP和Mg2+的存在[4～8]。目前，CMS基因已從擬南芥(Arabidopsisthaliana)[9～10]、蘿芙木(Rauvolfiaverticillata)[11]、曼地亞紅豆杉(Taxus×media)[12]、銀杏(Ginkgobiloba)[13]、橡膠樹(Heveabrasiliensis)[14]、水稻(Oryzasativa)[15]、秦艽(Gentianamacrophylla)[4]和杜仲(Eucommiaulmoides)[16]等許多植物中分離。早在十多年前，CMS蛋白晶體結構就已獲得[17]。CMS基因在模式植物擬南芥中研究的比較多。在擬南芥中，僅存在一個AtCMS基因[5]，其開放閱讀框(ORF)全長909 bp，將其中編碼的76-302肽鏈在大腸桿菌內(nèi)表達，獲得的蛋白具有和大腸桿菌(E.coli)EcCMS酶同樣的活性[10]。Hojo等對采用EMS化學誘變法獲得的兩種擬南芥CMS基因部分失活突變體isp1-1和isp1-2進行研究，結果發(fā)現(xiàn)二者隱性突變能導致葉綠素熒光增強、生長速率減慢和非光化學猝滅增加[6]。而擬南芥T-DNA插入突變體ispD-1和ispD-2則為白化致死表型，質(zhì)體發(fā)育停止在前質(zhì)體階段，葉綠素和類胡蘿卜素累積受阻[7]。采用反義技術獲得的擬南芥MCT基因突變體AS1-1和AS3-1株系，也出現(xiàn)了與T-DNA插入突變體類似的表型，而且其對映貝殼杉烯含量減少[9]。

CMS基因的表達具有組織特異性，并被生物和非生物因素誘導，影響萜類及其衍生物的生物合成。在蘿芙木中，RvCMS基因在嫩葉中的表達量最高，然后依次是老葉、樹皮、根和莖[18]。使用乙酰水楊酸處理蘿芙木毛狀根24 h后，與對照組相比，RvCMS基因上調(diào)10倍以上[19]。最新研究結果表明，在AtPIF5過表達擬南芥培養(yǎng)細胞株系中，AtCMS基因的表達上調(diào)2～3倍[20]。在生物誘導劑(100 mg·mL-1酵母提取物)和非生物誘導劑(30 mmol·L-1Ag+)共同誘導36 h，丹參(Salviamiltiorrhiza)SmCMS基因在誘導后12 h內(nèi)下降到最低，然后逐漸升高，在36 h時表達量達到最高[21]。在ABA處理的蘿芙木毛狀根中，MEP途徑基因RvDXR(1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶)、RvCMS、RvMCS(2-C-甲基赤蘚醇-2，4-環(huán)焦磷酸合成酶)、RvHDS(羥甲基丁烯基-4-磷酸合成酶)和RvHDR(1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯酸-4-焦磷酸還原酶)的表達顯著上調(diào)，而生物堿阿馬里新途徑特異性基因RvTDC(色氨酸脫羧酶)、RvSTR(異胡豆苷合成酶)和RvSGD(異胡豆苷合成酶)的表達并未上調(diào)，結果阿馬里新干重含量提高約15.15%[22]。使用乙酰水楊酸處理蘿芙木的毛狀根，上調(diào)了MEP途徑相關基因(RvDXR、RvCMS、RvMCS、RvHDS和RvHDR)的表達，但同時也下調(diào)了阿瑪堿合成途徑特異性基因RvSTR和RvSGD的表達，最終導致阿瑪堿含量降低約6.71%[23]。并非所有的CMS基因均參與萜類的合成，如在橡膠樹中，HbCMS1和HbCMS2參與類胡蘿卜素的生物合成，而非橡膠的生物合成[14]。

目前，國內(nèi)外對龍膽的研究主要集中在種子萌發(fā)、裂環(huán)烯醚萜苷鑒定[24]、藥材辨別[25]、DNA條碼、轉(zhuǎn)錄因子功能、新品種選育[2]等方面，還未見對滇龍膽GrCMS基因進行克隆和表達分析的報道。本研究是基于滇龍膽根和葉轉(zhuǎn)錄組預測的GrCMS基因序列，設計一對基因特異性引物，通過RT-PCR技術從栽培滇龍膽中成功擴增到GrCMS基因，并進行序列分析、原核表達和根莖葉中的表達分析，以期為滇龍膽GrCMS基因功能研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

滇龍膽植株栽培于玉溪師范學院4教202室。使用滇龍膽無菌苗幼葉進行RNA提取和基因擴增。2014年5月17日，對土壤栽培滇龍膽的根、莖和葉采樣，用于基因表達分析。

1.2 方法

1.2.1葉片總RNA提取及GrCMS基因ORF的克隆

按照RNA提取試劑RNAiso(Takara，大連)說明書從滇龍膽幼葉提取總RNA；按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，大連)說明書合成第一鏈cDNA。根據(jù)pGEX-4T-1質(zhì)粒多克隆位點和滇龍膽轉(zhuǎn)錄組GrCMS基因序列，設計一對基因特異引物GrCMSBamHⅠ-F和GrCMSXhoⅠ-R(表1，捷瑞，上海)。以cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系為TransTaqTaq DNA Polymerase High Fidelity(2.5 U·μL-1，全式金，北京)0.5 μL，10×TransTaqHiFi Buffer Ⅱ 5 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1，Takara，大連)4 μL，模板2 μL，正反向引物(10 μmol·L-1)各1 μL，加ddH2O補足50 μL。PCR反應條件為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后割膠，使用膠回收試劑盒(Qiagen，德國)回收目的片段，將其連接到pMD19-T載體(Takara，大連)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(Takara，大連)后，進行藍白篩選，挑取白斑搖菌；使用堿裂解法提取質(zhì)粒，經(jīng)質(zhì)粒大小檢測后，再進行酶切檢測，正確后進行DNA測序(上海生工，上海)，獲得重組質(zhì)粒pMD19-GrCMS。

表1GrCMS基因克隆和表達分析的引物

Table1PrimersforGrCMSgenecloningandreal-timePCRanalysis

用途Usage引物名稱Primername引物序列(5'—3')Primersequence(5'—3')退火溫度Tm(℃)GrCMS基因克隆GenecloningofGrCMSGrCMSBamHⅠ-FGrCMSXhoⅠ-RGGATCCATGTCTATTCTTCAATTGGGCTTCCTCGAGTTATGATTTTGCAGAGGCAGTG55GrCMS定量分析qPCRofGrCMSGrCMS-FGrCMS-RAAAGTACCCAAAGTTGACCCGCCTTCACTTCAGCCATACGAG60GAPDH內(nèi)參基因InternalcontrolGAPDHGrGAPDH-FGrGAPDH-RAAGGGAGGTGCGAAGAAAGTAAGGAGCAAGACAGTTGGTTGT60

1.2.2 GrCMS基因原核表達載體構建

對質(zhì)粒pGEX-4T-1(Amersham，瑞典)和pMD19-GrCMS分別進行BamHⅠ(Takara，大連)和XhoⅠ(Takara，大連)雙酶切，回收載體片段和目的基因，按摩爾比1∶4進行過夜連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞(Takara，大連)，涂布于添加100 mg·L-1氨芐青霉素(Takara，大連)的LB固體平板，12 h后挑取克?。粨u菌后，提取質(zhì)粒，經(jīng)質(zhì)粒大小檢測后，再進行酶切檢測，檢測正確后，獲得原核表達載體pGEX-4T-1-GrCMS。

1.2.3 GrCMS基因的生物信息學分析

按表2中的軟件分別進行序列拼接、多序列比對、系統(tǒng)發(fā)育分析、蛋白理化性質(zhì)分析等。

1.2.4 GrCMS基因的原核表達

使用熱激法將重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-GrCMS轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞(全式金，北京)，挑取單菌落接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)12 h。然后以1∶100比例接種到無抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至OD600≈0.8，使用終濃度1 mmol·L-1IPTG進行誘導表達，以相同條件的pGEX-4T-1轉(zhuǎn)化菌作對照；分別誘導0、2、4、6和8 h后，收集菌液2 mL。4℃離心集菌，棄上清，加入100 μL ddH2O、25 μL的5×SDS-PAGE上樣緩沖液，震蕩懸菌，沸水煮10 min。4℃離心5 min。取20 μL樣品上樣，進行SDS-PAGE(5%濃縮膠和12%分離膠)電泳檢測。

表2GrCMS基因的生物信息學分析

Table2BioinformaticsanalysisofGrCMSgene

項目Item軟件Software網(wǎng)址Website序列分析SequenceanalysisGenetyx6.1.8;DNAMAN7;BLASTn;BLASTphttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi多序列比對MultisequencealignmentDNAMAN7http://www.lynnon.com系統(tǒng)發(fā)育樹構建ConstructionofphylogenetictreeClustalX2.1MEGA6.0http://www.clustal.orghttp://www.megasoftware.net蛋白理化性質(zhì)分析PredictionofproteinphysicochemicalpropertiesProtParamhttp://web.expasy.org/protparam/稀有密碼子AnalysisofrarecodonCodonfrequencieshttp://molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_11.html葉綠體轉(zhuǎn)運肽預測PredictionofChloroplasttransitpeptideChloroPv1.1http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP保守結構域預測PredictionofconservativedomainsInterprohttp://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html信號肽預測PredictionofsignalpeptideSignalP4.1http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/蛋白疏水性預測PredictionofproteinhydrophobicityProtScalehttp://web.expasy.org/protscale/跨膜螺旋區(qū)預測PredictionoftransmembraneregionsTMHMM2.0http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/亞細胞定位預測PredictionofsubcellularlocalizationWOLFPSORThttp://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html二級結構預測PredictionofsecondarystructureSSprohttp://download.igb.uci.edu/sspro4.html三級結構預測PredictionoftertiarystructureSwiss-ModelWorkspacehttp://swissmodel.expasy.org/workspace/

1.2.5 GrCMS基因的實時定量分析

分別取盆栽3年生滇龍膽的葉、莖和根，首先提取總RNA，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后使用DNaseⅠ處理除去基因組DNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，大連)合成第一鏈cDNA。根據(jù)GrCMS基因的cDNA序列設計基因特異性引物GrCMS-F和GrCMS-R(表1)。使用SuperReal PreMix Plus試劑盒(天根，北京)進行qPCR，PCR擴增條件為：95℃ 3 min，95℃ 15 s，60℃ 31 s。每個反應重復3次。反應在ABI7000熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，美國)上進行擴增，擴增曲線、溶解曲線、標準曲線由定量PCR儀軟件自動生成。以GrGAPDH基因為內(nèi)參(表1)，計算根莖葉中GrCMS基因相對表達量。采用比較Ct值的“2-△△Ct”的方法進行定量數(shù)據(jù)的分析處理。

2 結果與分析

2.1 滇龍膽GrCMS基因的克隆

以滇龍膽cDNA為模板，使用基因特異性引物GrCMSBamHⅠ-F和GrCMSXhoⅠ-R擴增出約1 000 bp的片段(圖1)。通過TA克隆方法，獲得重組質(zhì)粒pMD19-GrCMS。

2.2 GrCMS基因的生物信息學分析

利用Genetyx和DNAMAN軟件對GrCMS基因ORF序列進行分析，結果顯示GrCMS基因(GenBank登錄號：KJ917164)ORF全長933 bp，編碼310個氨基酸。

使用BLASTp軟件對GrCMS蛋白氨基酸序列

進行相似性分析，結果表明滇龍膽GrCMS與長春花CrCMS蛋白序列相似性最高，為78.57%；與褐藻EsCMS蛋白相似性較低，為43.31%。利用DNAMAN軟件將GrCMS蛋白與NCBI中相似性較高的序列進行多序列比對分析，結果表明GrCMS蛋白與已知蛋白序列在N端轉(zhuǎn)運肽序列部分相似性較低，而在催化區(qū)域相似性很高(圖2)。利用MEGA軟件將GrCMS蛋白與相似性較高的部分序列和文獻已報道的部分序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結果顯示滇龍膽GrCMS與長春花(Catharanthusroseus)CrCMS蛋白處于同一進化枝(圖3)，表明二者的親緣關系較近。

圖1 滇龍膽GrCMS基因的PCR擴增 M. DNA MarkerⅢ；1.GrCMS基因擴增結果Fig.1 PCR amplification of GrCMS gene in G.rigescens M. DNA Marker Ⅲ; 1. PCR result of GrCMS gene

圖2 滇龍膽與其它植物CMS的氨基酸序列比對分析 黑色：相似性等于100%；粉紅色：75%≤相似性<100%；淺藍色：50%≤相似性<75%Fig.2 The amino acids sequence alignment of CMS between G.rigescens and other plants Black: Similarity:100%; Pink: 75%≤similarity<100%; Light blue: 50%≤similarity<75%

圖3 滇龍膽和其它植物CMS蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic tree of CMS G.rigescens and other plants

使用ProtParam軟件對GrCMS蛋白進行分析，結果表明GrCMS蛋白單體相對分子質(zhì)量為34.23 kD，pI為7.68，與曼地亞紅豆杉MCT蛋白類似[12]；帶正電氨基酸殘基(Arg+Lys)為38，帶負電氨基酸殘基(Asp+Glu)為37，化學方程式：C1541H2495N399O460S8。不穩(wěn)定指數(shù)37.49，為穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)103.10，總平均疏水性(GRAVY)為-0.053，屬親水蛋白。GrCMS蛋白含20種基本氨基酸，其中亮氨酸(Leu)含量最高，為12.9%；其次是絲氨酸(Ser)和賴氨酸(Lys)，分別為11.0%和8.7%；色氨酸(Trp)含量最低，為0.3%。

使用Sspro軟件對GrCMS進行二級結構分析，結果表明該蛋白二級結構中α-螺旋(H)占26.45%，無規(guī)則卷曲(C)占54.84%，延伸帶(E)占18.71%，這與蘿芙木RvCMS蛋白基本相同[18]。利用Swiss-Model Workspace軟件采用自動模式對GrCMS蛋白三級結構進行預測(圖4)，該模型是以擬南芥葉綠體2-C-甲基-D-赤蘚醇4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶[4nai.1]為模板，在第87-305氨基酸處建模，序列相似度為81.00%。使用InterPro軟件對GrCMS蛋白保守結構域進行預測，結果顯示GrCMS蛋白包含兩類保守結構域：核苷酸二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶結構域(38-94，95-304，84-304)和2-C-甲基-D-赤蘚醇4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶結構域(83-306，84-304，85-303)。

圖4 GrCMS蛋白二聚體的三維結構預測 紅色.α-螺旋；黃色.β-折疊；綠色.環(huán)Fig.4 Prediction of three dimensional structure of GrCMS protein in dimer Red.α-helix; Yellow.β-fold; Green. Loop

采用SignalP 4.1軟件對GrCMS蛋白信號肽進行預測，結果未發(fā)現(xiàn)信號肽，表明該蛋白為非分泌型蛋白。利用TMHMM2.0軟件對GrCMS蛋白跨膜螺旋區(qū)進行預測，結果顯示GrCMS蛋白不含跨膜螺旋區(qū)域(圖5)，為非膜蛋白。使用WoLF PSORT軟件進行亞細胞定位預測，結果表明GrCMS蛋白在葉綠體和線粒體的定位系數(shù)分別為11.5和1.5。使用ChloroP 1.1軟件對GrCMS蛋白的葉綠體轉(zhuǎn)運肽進行預測，結果顯示GrCMS蛋白N末端包含一個66氨基酸的轉(zhuǎn)運肽。

圖5 GrCMS蛋白可能跨膜螺旋的檢測Fig.5 Detection of putative transmembrane helixes of GrCMS protein

為選擇合適的表達菌，使用在線軟件對GrCMS基因進行稀有密碼子分析，結果顯示GrCMS基因中稀有密碼子僅占0.96%，并且沒有三聯(lián)或二聯(lián)稀有密碼子連續(xù)出現(xiàn)的情況，所以可以選擇大腸桿菌Rosetta(DE3)或BL21進行表達。

2.3 GrCMS基因原核表達載體的構建

使用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pGEX-4T-1-GrCMS質(zhì)粒，能夠切出目的片段GrCMS和載體pGEX-4T-1(圖6)，表明GrCMS基因已成功插入原核表達載體pGEX-4T-1中。

圖6 質(zhì)粒pGEX-4T-1-GrCMS酶切檢測 M. DNA Marker Ⅲ；1～2.質(zhì)粒pGEX-4T-1-GrCMS的BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切、XhoⅠ單酶切結果；3.質(zhì)粒對照Fig.6 Detection of plasmid pGEX-4T-1-GrCMS by digestions M. DNA Marker Ⅲ; 1-2. Digestion results of plasmid pGEX-4T-1-GrCMS by BamHⅠ and XhoⅠ, XhoⅠ; 3. Plasmid control

圖7 37℃下不同誘導時間對GrCMS蛋白表達量的影響M. ProteinRuler Ⅱ；1～2. 37 ℃、IPTG終濃度為1 mmol·L-1下pGEX-4T-1空載體轉(zhuǎn)化子分別誘導0和8 h的總蛋白；3～6.相同條件下融合表達菌pGEX-4T-1-GrCMS分別誘導0、2、4、6和8 h的總蛋白Fig.7 Effect of different time on the expression of GrCMS protein at 37℃ M. ProteinRuler Ⅱ; 1-2. The expressed product of pGEX-4T-1 transformed bacteria with 1 mmol·L-1 of IPTG induction for 0 and 8 h at 37 ℃; 3-6. The expressed product of pGEX-4T-1-GrCMS transformed bacteria with 1 mmol·L-1 of IPTG induction for 0, 2, 4, 6 and 8 h separately at 37℃

2.4 GrCMS基因的原核表達

將酶切檢測正確的pGEX-4T-1-GrCMS重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)，然后使用IPTG誘導表達。在37℃、終濃度為1 mmol·L-1IPTG下，分別誘導0、2、4、6和8 h后，提取細菌總蛋白進行SDS-PAGE檢測。結果表明，與對照相比，pGEX-4T-1-GrCMS轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導后，在相對分子質(zhì)量60.23 kD(含GST蛋白，約26 kD)左右有1條蛋白條帶，并且其蛋白含量隨誘導時間的增加而逐漸增加，表明pGEX-4T-1-GrCMS重組質(zhì)粒在大腸桿菌Rosetta(DE3)中成功誘導表達出GrCMS蛋白。當溫度為37℃、誘導時間為8 h時，蛋白表達量最大(圖7)，可用于蛋白純化和酶活分析。

2.5 GrCMS基因的組織表達分析

取三年生滇龍膽的根、莖和葉，通過定量RT-PCR分析GrCMS基因在不同組織中的表達情況。結果表明，GrCMS基因在葉中表達量最高，分別是根和莖中的36.01和29.28倍(圖8)。

圖8 GrCMS基因在根莖葉中的相對表達 以根為參照，設定其中的表達量為1。Fig.8 Relative expression of GrCMS gene in root,stem and leaf Root was taken as the reference,and its expression was set as 1.

3 討論

MEP途徑能夠為滇龍膽藥效成分龍膽苦苷的生物合成提供前體物質(zhì)異戊烯基焦磷酸(IPP)。CMS是MEP途徑的第三個催化酶，因此滇龍膽中GrCMS基因的表達情況可直接或間接影響龍膽苦苷的生物合成。從進化角度來看，CMS基因起源于衣原體[26]。CMS基因是核編碼基因，但其編碼蛋白CMS在葉綠體中起作用[27]。在銀杏中，GbCMS蛋白定位于葉綠體，是由其N端88個氨基酸的信號肽所決定[13]。在蘿芙木中，定位于葉綠體的RvCMS蛋白N端包含67氨基酸的葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列[11]。在本研究中，GrCMS蛋白N末端包含一個66氨基酸的轉(zhuǎn)運肽，為GrCMS定位于葉綠體提供證據(jù)。

在不同生物中，CMS蛋白的活性形式不同，大部分是以二聚體形式存在的。在蘿芙木和杜仲中，RvCMS和EuCMS蛋白都是以同源二聚體的形式存在的[11]。在大腸桿菌中，EcCMS蛋白也是以二聚體形式存在的[17]。在本研究中，GrCMS蛋白三維模型預測結果表明，該蛋白的活性形式為二聚體(圖4)，這需要通過非變性SDS-PAGE或酵母雙雜交等實驗進行進一步檢測。

在CMS蛋白保守序列中，存在兩個賴氨酸保守位點，它們參與Mg2+和CTP與CMS蛋白的結合[11,13]。比對結果表明，在GrCMS蛋白中這兩個位點分別為第103和第289位的賴氨酸氨基酸殘基。將GrCMS蛋白與土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)TfCMS蛋白(GenBANK登錄號CAJ79964.1)進行比對分析，結果表明GrCMS蛋白的第220位的絲氨酸是潛在的磷酸化位點[8]，在CMS蛋白活性中起著重要作用，土拉弗朗西斯菌TfCMS蛋白141位絲氨酸的突變(T141D和T141E)將導致該酶失活[8]。

CMS基因的表達具有組織和時空特異性，并與萜類的生物合成相關聯(lián)。在丹參中，SmCMS基因參與丹參酮的生物合成和累積，其在根、莖、葉和花中均表達，但主要在葉中表達；因該基因受茉莉酸甲酯的誘導不明顯，推測它是一個組成型表達基因[21,28～30]，這導致它在大多數(shù)植物中不被關注。然而，有研究表明CMS可能是一個限速酶，因為：(1)當?shù)孜颩EP大量增加時，它并不能迅速完全將其代謝[31]；(2)在長春花中，當冷處理導致萜類吲哚堿(TIA)供應不足時，CrCMS基因呈下調(diào)表達[31]。在毛果楊(Populustrichocarpa)中，PtCMS基因的轉(zhuǎn)錄水平與異戊二烯萜類的散發(fā)相關聯(lián)[32]。在杜仲中，MEP途徑基因如EuDXR、EuCMS、EuCMK(4-(5′-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶)、EuMDS、EuHDS和EuHDR等主要在葉片中表達[33]，這與葉片中杜仲膠的合成相一致。在1月齡的銀杏胚胎培養(yǎng)小苗中，可能參與銀杏苦內(nèi)酯生物合成的GbCMS基因在根和葉中的表達量相當[13]。在曼地亞紅豆杉中，可能參與紫杉醇生物合成的TmMCT基因主要在根、莖、葉和樹皮中表達，在毛根中表達量最高，其次是莖[34]。有趣的是，在羅漢果(Siraitiagrosvenorii)羅漢果苷V生物合成和累積過程(開花后50～70 d)中，MEP途徑基因SgDXS、SgDXR和SgCMS均呈上調(diào)表達趨勢，SgMCS和SgIDS均呈下調(diào)表達趨勢，而SgCMK和SgHDS的表達幾乎檢測不到[35]。組織表達特異性檢測結果表明，本研究中的GrCMS基因在葉中的表達量遠遠高于根和莖(圖7)，這表明滇龍膽MEP途徑主要存在于葉片，這與滇龍膽根和葉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結果相一致。事實上，滇龍膽用藥部位為根，因為根中龍膽苦苷含量最高[36]，因此作者推測MEP途徑對龍膽苦苷生物合成的貢獻是通過首先在葉片中合成龍膽苦苷，然后在轉(zhuǎn)運到根中的液泡進行累積。

本研究為滇龍膽GrCMS基因功能的解析及龍膽苦苷生物合成途徑的闡明奠定基礎。

1.金航,張霽,張金渝,等.滇龍膽[M].昆明:云南科技出版社,2013:1-5.

2.Zhang X,Allan A C,Li C,et al.De novo assembly and characterization of the transcriptome of the Chinese medicinal herb,Gentianarigescens[J].International Journal of Molecular Sciences,2015,16(5):11550-11573.

3.Tasheva K,Kosturkova G.Role of biotechnology for protection of endangered medicinal plants,in Environmental biotechnology-New approaches and prospective applications[M].Croatia:InTech,2013:235-238.

4.Hua W,Zheng P,He Y,et al.An insight into the genes involved in secoiridoid biosynthesis inGentianamacrophyllaby RNA-seq[J].Molecular Biology Reports,2014,41(7):4817-4825.

5.Vranova E,Coman D,Gruissem W.Network analysis of the MVA and MEP pathways for isoprenoid synthesis[J].Annual Review of Plant Biology,2013,64:665-700.

6.Hojo M,Tasaka M,Shikanai T.Physiological requirements of the nonmevalonate pathway for photo-acclimation inArabidopsis[J].Plant Biotechnology Journal,2005,22(1):39-45.

7.Hsieh M H,Chang C Y,Hsu S J,et al.Chloroplast localization of methylerythritol 4-phosphate pathway enzymes and regulation of mitochondrial genes inispDandispEalbino mutants inArabidopsis[J].Plant Molecular Biology,2008,66(6):663-673.

8.Tsang A,Seidle H,Jawaid S,et al.Francisellatularensis2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferase:kinetic characterization and phosphoregulation[J].PloS One,2011,6(6):e20884.

9.Okada K,Kawaide H,Kuzuyama T,et al.Antisense and chemical suppression of the nonmevalonate pathway affects ent-kaurene biosynthesis inArabidopsis[J].Planta,2002,215(2):339-344.

10.Rohdich F,Wungsintaweekul J,Eisenreich W,et al.Biosynthesis of terpenoids:4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol synthase ofArabidopsisthaliana[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2000,97(12):6451-6456.

11.Lan X.Molecular cloning and characterization of the gene encoding 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidyltransferase from hairy roots ofRauvolfiaverticillata[J].Biologia,2013,68(1):91-98.

12.劉萬宏.紫杉醇前體合成途徑兩個關鍵酶基因克隆和分析[D].重慶:西南大學,2008.

13.Kim S M,Kuzuyama T,Chang Y J,et al.Cloning and functional characterization of 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidyltransferase(GbMECT) gene fromGinkgobiloba[J].Phytochemistry,2006,67(14):1435-1441.

14.Sando T,Takeno S,Watanabe N,et al.Cloning and characterization of the 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate(MEP) pathway genes of a natural-rubber producing plant,Heveabrasiliensis[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry,2008,72(11):2903-2917.

15.Yu J,Wang J,Lin W,et al.The genomes of Oryza sativa:a history of duplications[J].PLoS Biology,2005,3(2):e38.

16.劉攀峰.杜仲MEP途徑系列基因全長cDNA分離鑒定及序列特征研究[D].北京:中國林業(yè)科學研究院,2012.

17.Kemp L E,Bond C S,Hunter W N.Structure of a tetragonal crystal form ofE.coli2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferase[J].Acta Crystallographica.Section D:Biological Crystallography,2003,59:607-610.

18.鄭月.蘿芙木MCT,HDS,SGD基因的克隆與遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[D].重慶:西南大學,2011.

19.馬麗利,秦白富,常凱,等.蘿芙木阿瑪堿生物合成基因?qū)σ阴Ｋ畻钏岬捻憫猍J].西南大學學報,2013,35(4):1-6.

20.Mannen K,Matsumoto T,Takahashi S,et al.Coordinated transcriptional regulation of isopentenyl diphosphate biosynthetic pathway enzymes in plastids by phytochrome-interacting factor 5[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2014,443(2):768-774.

21.Gao W,Sun H X,Xiao H,et al.Combining metabolomics and transcriptomics to characterize tanshinone biosynthesis inSalviamiltiorrhiza[J].BMC Genomics,2014,15:73.

22.Chang K,Chen M,Zeng L,et al.Abscisic acid enhanced ajmalicine biosynthesis in hairy roots ofRauvolfiaverticillataby upregulating expression of the MEP pathway genes[J].Russian Journal of Plant Physiology,2014,61(1):136-140.

23.馬麗利,秦白富,常凱,等.蘿芙木阿瑪堿生物合成基因?qū)σ阴Ｋ畻钏岬捻憫猍J].西南大學學報:自然科學版,2013,35(4):1-6.

24.He Y M,Zhu S,Ge Y W,et al.The anti-inflammatory secoiridoid glycosides from Gentianae Scabrae Radix:the root and rhizome ofGentianascabra[J].Journal of Natural Medicines,2015,69(3):303-312.

25.Zhao Y,Zhang J,Jin H,et al.Discrimination ofGentianarigescensfrom different origins by fourier transform infrared spectroscopy combined with chemometric methods[J].Journal of AOAC International,2015,98(1):22-26.

26.Lange B M,Rujan T,Martin W,et al.Isoprenoid biosynthesis:the evolution of two ancient and distinct pathways across genomes[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2000,97(24):13172-13177.

27.Ganjewala D,Kumar S,Luthra R.An account of cloned genes of Methyl-erythritol-4-phosphate pathway of isoprenoid biosynthesis in plants[J].Current Issues in Molecular Biology,2009,11(s1):35-45.

28.Ma Y,Yuan L,Wu B,et al.Genome-wide identification and characterization of novel genes involved in terpenoid biosynthesis inSalviamiltiorrhiza[J].Journal of Experimental Botany,2012,63(7):2809-2823.

29.Yang L,Ding G,Lin H,et al.Transcriptome analysis of medicinal plantSalviamiltiorrhizaand identification of genes related to tanshinone biosynthesis[J].PloS One,2013,8(11):e80464.

30.Luo H,Zhu Y,Song J,et al.Transcriptional data mining ofSalviamiltiorrhizain response to methyl jasmonate to examine the mechanism of bioactive compound biosynthesis and regulation[J].Physiologia Plantarum,2014,152(2):241-255.

31.Dutta A,Sen J,Deswal R.Downregulation of terpenoid indole alkaloid biosynthetic pathway by low temperature and cloning of a AP2 type C-repeat binding factor(CBF) fromCatharanthusroseus(L).G.Don[J].Plant Cell Reports,2007,26(10):1869-1878.

32.Wiberley A E,Donohue A R,Westphal M M,et al.Regulation of isoprene emission from poplar leaves throughout a day[J].Plant Cell and Environment,2009,32(7):939-947.

33.劉慧敏,王淋,許靖詩,等.杜仲MEP途徑系列基因表達差異的研究[J].中南林業(yè)科技大學學報,2014,34(2):26-33.

34.王偉,任肅霞,劉萬宏,等.曼地亞紅豆杉MEP途徑上MECT基因的克隆和分析[A].中國遺傳學會第八次代表大會暨學術討論會論文摘要匯編,2008.

35.Tang Q,Ma X,Mo C,et al.An efficient approach to findingSiraitiagrosvenoriitriterpene biosynthetic genes by RNA-seq and digital gene expression analysis[J].BMC Genomics,2011,12(1):343.

36.楊美權,張金渝,沈濤,等.不同栽培模式對滇龍膽中龍膽苦苷含量的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2011(1):287-289.

CloningandexpressionanalysisofGrCMSgeneinGentianarigescens

ZHANG Xiao-Dong1LI Cai-Xia1WANG Yuan-Zhong2*

(1.College of Resources and Environment,Yuxi Normal University,Yuxi 653100；2.Institute of Medicinal Plants,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Kunming 650223)

2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphatecytidyltransferase(CMS, EC 2.7.7.60) is the third enzyme in methylerythritol phosphate(MEP) pathway. The Open Reading Frame(ORF) ofGrCMSgene was cloned by RT-PCR technology from young leaves ofGentianarigescensbased on the transcriptome ofG.rigescensand its prokaryotic and the tissue specific expression analysis were performed. The ORF ofGrCMSgene(accession number: KJ917164) was 933 bp long coding for a protein of 310 amino acids, and the predicted relative molecular weight of GrCMS was 34.23 kD with its theoretical pI of 7.68. The results of GrCMS protein analysis showed that GrCMS which possessed the conserved domains of CMS proteins and may localize in chloroplast was a hydrophilic stable protein without signal peptide, and it was composed of mainly α-helix(26.45%) and random coils(54.84%). By phylogenetic analysis, GrCMS was close to CrCMS ofCatharanthusroseus. By prokaryotic analysis, the recombinant protein ofGrCMSgene inE.coliwas approximately 60.23 kD(containing GST tag protein 26 kD), which was consistent with the anticipated size. By real-time PCR analysis,GrCMSgene was primarily expressed in leaf. Our results will provide reference for further functional researches ofGrCMSgene and the biosynthetic pathway of gentiopicroside.

Gentianarigescens;2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphatecytidyltransferase;gene cloning;expression analysis

國家自然科學基金(81260608)；云南省教育廳重點項目(2015Z171)；科技部“十二五”國家科技支撐計劃項目

張曉東(1980—)，男，博士，主要從事植物代謝基因工程研究。

2015-09-10

Q786

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.02.015