楊路存 劉何春 周學(xué)麗 徐文華 周國英*

(1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，810008； 2.中國科學(xué)院藏藥研究重點實驗室，西寧 810008； 3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049； 4.青海省鐵卜加草原改良試驗站，西寧 810008)

* 通信作者：E-mail:zhougy@nwipb.cas.cn

羌活(Notopterygiumincisum)nrDNAITS和cpDNArpl20-rps12序列分子進化特點的分析

楊路存1,2劉何春1,3周學(xué)麗4徐文華1,2周國英1,2*

(1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，810008；2.中國科學(xué)院藏藥研究重點實驗室，西寧 810008；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4.青海省鐵卜加草原改良試驗站，西寧 810008)

應(yīng)用PCR產(chǎn)物直接測序法分析了羌活居群間nrDNA(核糖體DNA)ITS序列和cpDNA(葉綠體DNA)rpl20-rps12的堿基差異，從而初步研究兩套植物基因組的變異速率。采用改良的CTAB法從硅膠干燥的羌活葉片中提取總DNA，并對nrDNA ITS和cpDNA rpl20-rps12區(qū)域進行擴增、純化、測序。nrDNAITS序列共有635 bp，有變異位點17處，變異位點百分率為2.68%，(G+C)含量為57.83%。cpDNA rpl20-rps12序列共有767 bp，有變異位點35處，變異位點百分率4.56%，(G+C)含量為33.06%。比較發(fā)現(xiàn)，羌活nrDNAITS區(qū)域較cpDNA rpl20-rps12序列保守，變異速率較慢。通過對ITS和rpl20-rps12序列單倍型(haplotype)進行分析發(fā)現(xiàn)，兩者得出的結(jié)論一致，即現(xiàn)有分布范圍經(jīng)歷了居群近期范圍擴張。因此，羌活nrDNA ITS序列適合該種的譜系地理學(xué)研究。

羌活；ITS序列；rpl20-rps12序列

羌活(Notopterygiumincisum)隸屬于傘形科(Umbelliferae)羌活屬(Notopterygium)，是中國的特有種[1～2]。主要分布在青海、甘肅、四川[3]。生于海拔2 500～3 500 m的高山灌木林、亞高山灌叢、草叢及高山林緣地上。羌活與同屬的寬葉羌活(N.forbesii)同為藥材羌活的基源植物，以根莖及根入藥[4]，是中、藏、羌醫(yī)藥體系中常用藥材，主要含揮發(fā)油和香豆素類成分。具有散寒、祛風、除濕、止痛功效，主治風寒感冒頭痛、風濕痹痛等癥，現(xiàn)代藥理研究表明對心腦血管疾病也有確切療效[5]。目前，用羌活的中(藏)成藥有200余種，用藥需求量非常大，長期僅靠野生采集滿足國內(nèi)外市場需求，以致資源已瀕臨滅絕，1987年即被國務(wù)院《中國野生藥材資源保護管理條例》列為Ⅲ級保護物種，2005年又載入《中國物種紅色名錄》[6]。目前，羌活植物化學(xué)[7～8]、藥理[9]、地理分布[3,10]、分類學(xué)[1～2]、環(huán)境土壤學(xué)[11]和馴化栽培[12～13]等方面的研究比較多，對其nrDNA ITS序列和cpDNA rpl20-rps12序列的研究尚屬首次。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，用于分子系統(tǒng)學(xué)和譜系地理學(xué)研究的分子標記從RFLP、RAPD、SSR和ISSR過渡到核糖體DNA(nrDNA)的18S基因及ITS等非編碼區(qū)，以及葉綠體DNA的編碼基因及非編碼區(qū)序列和部分線粒體DNA(mtDNA)的基因片段。目前應(yīng)用最廣泛的核基因組是nrDNAITS序列，它是核糖體DNA中介于18S和5.8S之間(ITS1)以及5.8S和26S之間(ITS2)的非編碼轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，具有較高的重組率，成為植物譜系地理學(xué)(Phylogeography)研究和探討科內(nèi)屬間及屬下種間關(guān)系中最有效的手段之一[14～15]。葉綠體DNA(cpDNA)多數(shù)具有單親遺傳的特性，在遺傳過程中不易發(fā)生重組，并且沒有基因的重疊、缺失或假基因的現(xiàn)象，擁有獨立的進化路線，不依賴其他數(shù)據(jù)，可以通過自身數(shù)據(jù)構(gòu)建分子系統(tǒng)來推測物種的進化歷史[16～17]。而rpl20-rps12屬于葉綠體非編碼區(qū)域，有較高的突變頻率，且這些突變不受自然選擇等其他因素的影響，屬于中性突變，可以保留經(jīng)長期的變遷的植物的遺傳結(jié)構(gòu)(如過去的遷移路線、建群的原動力等)，經(jīng)過長年累月的變化可以提供豐富的信息，是植物系統(tǒng)地理學(xué)研究的首選分子標記[18]。本文分析了羌活12個居群，116個個體的nrDNAITS和cpDNA rpl20-rps12序列區(qū)域，研究該種nrDNAITS和cpDNA rpl20-rps12序列的分子特點和變異情況，并從這兩個序列初步確定該種形成現(xiàn)有分布范圍的成因。

1 材料與方法

1.1 材料

用于本實驗的12個居群為2014年6～9月份分別采自青海、四川和甘肅3省區(qū)，基本包括了我國羌活主要產(chǎn)區(qū)。采樣時每個居群選取成年植株6～15株，根據(jù)隨機取樣原則，取樣的羌活株距在50 m以上。野外采集新鮮、完整的植物幼嫩葉片，置于盛有硅膠的塑膠袋中干燥保存。采樣編號及地點見表1。

表1 12個羌活居群的采樣表

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測

依據(jù)改良的CTAB法從硅膠干燥的葉片中提取總DNA。通過測定紫外光吸收值來確定DNA濃度和純度。利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA完整性。

1.2.2 PCR擴增與DNA測序

采用通用引物“ITS1”(5′-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′)和“ITS4”(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)；“rpl20”(5′-TTTGTTCTACGTCTCCGAGC-3′)和“rps12”(5′-GTCGAGGAACATGTACTAGG-3′)分別擴增nrDNA ITS序列和cpDNA rpl20-rps12序列。擴增反應(yīng)在Eppendorf Mastercycler Gradient PCR儀上進行，反應(yīng)體系為25 μL，內(nèi)含25 mmol·L-1MgCl22 μL、2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL、10 μmol·L-1引物各0.6 μL、25 ng模板、10×buffer 2.5 μL和1U Taq DNA聚合酶(TaKaRa)。nrDNA ITS擴增程序為：95℃預(yù)變性3 min；35個循環(huán)：95℃變性0.5 min，51℃退火0.5 min，72℃延伸0.5 min；最后72℃延伸10 min。cpDNA rpl20-rps12擴增程序為：95℃預(yù)變性3 min；35個循環(huán)：95℃變性0.5 min，52℃退火0.5 min，72℃延伸0.5 min；最后72℃延伸10 min。

將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測純化后由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

序列對位排列用ClustalX軟件自動完成后[19]，并手工適當校正。用DnaSP軟件統(tǒng)計變異位點[20]，單倍型(haplotype)類型和變異位點百分率，以及核苷酸多樣性，并將nrDNAITS、和cpDNA rpl20-rps12序列進行比較。Tajima’s D和Fu’s Fs兩種無限突變位點模型的中性檢驗方法及歧點分布(Mismatch distribution)分析也在DnaSP程序中完成，來檢驗羌活居群間是否經(jīng)歷了近期居群范圍擴張。用MEGA4.1軟件進行核苷酸組成分析，采用Kitmura-2-Parameter distance雙參數(shù)模型(Kimura,1980)計算遺傳距離，并用鄰接(Neighbour-Joining,NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)樹，通過1 000次重復(fù)獲得的自展檢驗(bootstrap)數(shù)值標記在分支上[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1nrDNAIT和cpDNArpl20-rps12目的片段的擴增

PCR擴增體系對不同居群羌活nrDNAITS和cpDNA rpl20-rps12片段進行擴增，得到單一片段條帶，電泳顯示條帶非常清晰，沒有拖帶和非特異條帶(圖1)。

圖1 nrDNAITS區(qū)域(A)和cpDNA rpl20-rps12區(qū)域(B)PCR擴增電泳結(jié)果Fig.1 The results of PCR amplification on ITS(A) and cpDNA rpl20-rps12(B) region

2.2羌活各居群間nrDNAITS和cpDNArpl20-rps12序列及分析

對羌活116個個體nrDNA ITS區(qū)域進行測序，并用ClustalX進行對位排列。經(jīng)對位排列，獲得我國主要羌活產(chǎn)地12個居群的ITS序列，堿基長度均為635 bp。合并相同的序列共得到15個單倍型(haplotype,H)，其中H1是分布最廣的單倍型(分布于Q1，Q2，G1，G2，G3，G4，S2，S4居群中)，其次是H3(分布于Q3，Q4，S1，S2，S3，S4居群中)，H13和H14分別為Q9，S3，S5居群和S5，S8居群所共享，H8為Q9，S3居群所共享，其它特有的單倍型(H2，H4，H5，H7，H8，H9，H10，H11，H12，H15)分布到各自相應(yīng)的居群中。羌活的cpDNA rpl20-rps12序列，堿基長度767 bp。合并相同的序列共得到12個單倍型，其中單倍型H1是分布最廣的單倍型，它分布于全部12個居群中，其次是單倍型H6和H9，分別被5個和4個居群所共享，其它特有的單倍型(H2，H3，H4，H5，H7，H8，H10，H11，H12)分布到各自相應(yīng)的居群中。

羌活nrDNA ITS序列的(G+C)含量為57.83%，變異位點百分率為2.68%。在635 bp的堿基序列中，有17處變異位點，其中1處為插入/缺失(位于26 bp位點處，表2)，16處為堿基置換。羌活nrDNA ITS序列(G+C)含量(57.83%)明顯高于rpl20-rps12序列的(G+C)含量(33.06%)。cpDNA rpl20-rps12序列變異位點百分率為4.56%，而nrDNA ITS序列變異位點百分率是2.68%，cpDNA rpl20-rps12序列變異位點百分率遠大于nrDNA ITS序列的變異位點百分率(表3)。

cpDNA rpl20-rps12的核苷酸多樣性也遠大于nrDNA ITS序列的核苷酸多樣性。

表2羌活I(lǐng)TS片段15種單倍型進行序列比對的變異位點

Table2Variablesitesofthealignedsequencesamong15haplotypesoftheITSfragmentofN.incisum

單倍型HaplotypeVariablesites126112555555566663660900225669112289723467873889H1GGGGGTAAAGGTACGCGH2····A············H3······G··A·······H4······G··········H5······G···T·····TH6····A·G··········H7····A·GG·········H8··AA·············H9A·A··············H10······GG·········H11······G·T··CTTTTTH12·—A··············H13··A··············H14··A··A···········H15······G··········

表3 羌活cpDNA rpl20-rps12片段12種單倍型進行序列比對的變異位點

運用MEGA軟件對羌活nrDNAITS序列和cpDNA rpl20-rps12所得單倍型進行系統(tǒng)發(fā)育樹重建。由圖2可知，由nrDNAITS序列構(gòu)建的NJ樹分為四支，H2、H3、H4、H5、H15聚為一支，H1、H6、H7、H8、H11、H12、H13、H14、H15聚為一支，H10為一支，H9為另一支。由圖3可知，cpDNA rpl20-rps12序列構(gòu)建的NJ樹分為兩支，H1、H2、H3、H4、H5、H9聚為一支，H6、H7、H8、H10、H11、H12聚為一支。

采用nrDNA ITS和cpDNA rpl20-rps12序列對羌活的野生種群進行種群歷史變動分析，釆用單倍型錯配分布、無限突變位點模型的中性檢驗值Tajima’s D和Fu’s Fs等方法同時調(diào)查羌活的種群歷史變動錯配分布。分析結(jié)果顯示，羌活種群單倍型和堿基差異呈明顯的單峰分布(圖4)，較為保守的Tajima’s D(nrDNA ITS:-1.447 04,P<0.05;cpDNA rpl20-rps12:-2.102 63,P<0.05)顯著偏離中性平衡，F(xiàn)u and Li’s D*(nrDNA ITS:-4.260 68,P<0.02;cpDNA rpl20-rps12:-3.518 20,P<0.02)和 Fu and Li’s F*(nrDNA ITS:-3.84182,P<0.02;cpDNA rpl20-rps12:-3.567 84,P<0.02)均為顯著的負值，支持羌活種群經(jīng)歷了種群選擇或擴張事件。

圖2 基于ITS序列的15種單倍型的NJ樹Fig.2 NJ tree based on the 15 haplotypes of ITS sequences

圖3 基于cpDNA rpl20-rps12序列的12種單倍型的NJ樹Fig.3 NJ tree based on the 12 haplotypes of cpDNA rpl20-rps12 sequences

Table4ComparisonsbetweennrDNAITSandcpDNArpl20-rps12sequencesforN.incisum

序列名稱Nameofsequence長度Length(bp)變異位點百分率Percentageofvariablesites(%)(G+C)含量(G+C)content(%)nrDNAITS6352.6857.83cpDNArpl20-rps127674.5633.06

3 討論

一般而言，在大多數(shù)的被子植物中由于葉綠體DNA是母性遺傳、非重組的并且由于進化速度比較慢[22]，因此常被用來研究群體遺傳學(xué)和系統(tǒng)地理學(xué)中的遺傳瓶頸和奠基者效應(yīng)，并且用于測量遺傳漂變[16]。而核DNA(nDNA)的進化較快，可用于解決屬下不同種和種內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育和分類問題，并且可解決由于葉綠體變異的水平太低而不能闡明居群的關(guān)系的問題[23]。因此，在植物譜系地理學(xué)的研究中采用葉綠體和核基因組聯(lián)合分析來徹底的闡明調(diào)查物種的遺傳結(jié)構(gòu)。

本研究中，應(yīng)用PCR產(chǎn)物直接測序法分析了羌活居群間nrDNA(核糖體DNA)ITS序列和cpDNA(葉綠體DNA) rpl20-rps12的堿基差異，初步確定了兩套植物基因組的變異速率，即羌活nrDNA ITS序列較cpDNA rpl20-rps12 序列保守，變異速率較慢，這與上面的研究結(jié)果不一致，但與段義忠等[24]對窄葉鮮卑花的研究結(jié)果一致。

nrDNA ITS序列共發(fā)現(xiàn)15個單倍型，其中H1是分布最廣的單倍型，分布于12個居群中的8個居群中，且青藏高原東南部邊緣的居群遺傳多樣性較高。這與葉綠體rpl20-rps12序列單倍型所得出的結(jié)果較相近。nrDNA ITS和cpDNA rpl20-rps12序列所得到的兩種中性檢驗值均為負值(nrDNA ITS:-1.447 04,P<0.05;cpDNA rpl20-rps12:-2.102 63,P<0.05)，羌活nrDNA ITS和cpDNA rpl20-rps12基因區(qū)間序列數(shù)據(jù)的歧點分布(mismatch distribution)分析結(jié)果表明，觀測值與期望值之間比較，得到了一個明顯的單峰分布曲線圖，表明羌活居群可能經(jīng)歷過居群近期范圍擴張。雖然nrDNA ITS序列變異位點較少，但其反應(yīng)的居群間的進化關(guān)系與葉綠體基因組一致，nrDNA ITS序列可以推測出羌活居群擴張的大致時間，因此nrDNAITS序列適合羌活以居群進化歷史為主要目的的譜系地理學(xué)研究。

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CharacteristicofMolecularEvolutionofNotopterygiumincisumBasedonnrDNAITSandcpDNArpl20-rps12SequenceAnalysis

YANG Lu-Cun1,2LIU He-Chun1,3ZHOU Xue-Li4XU Wen-Hua1,2ZHOU Guo-Ying1,2*

(1.Northwest Institute of Plateau Biology,Chinese Academy of Sciences,Xining 810008；2.Key Laboratory of Tibetan Medicine Research,Chinese Academy of Sciences,Xining 810008；3.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049；4.Tiebujia Grassland Improvement Experiment Station,Xining 810008)

We analyzed the differences between the nrDNAITS and cpDNA rpl20-rps12 sequences inNotopterygiumincisumby PCR direct sequencing. Total DNA was extracted from silica-dried leaves ofN.incisumusing modified CTAB method. With the extracted DNA as template, nrDNA ITS and cpDNA rpl20-rps12 regions were amplified, then purified and sequenced. The length of nrDNA ITS sequence ofN.incisumwas 635 bp, of which 17 were variable sites with a percentage of 2.68%, the(G+C) content was 57.83%. The length of cpDNA rpl20-rps12 sequence ofN.incisumwas 767 bp, of which 35 was variable site with a percentage of 4.56%, the(G+C) content was 33.06%. The nrDNAITS region ofN.incisumwas more conserved and evolved more slowly than the cpDNA rpl20-rps12sequence. The present distribution range ofN.incisumexperienced range expansion by the haplotype analysis of this species, which consisted with the conclusion resulting from cpDNA genome. Therefore, the nrDNA ITS sequence of rpl20-rps12 was fit to the phylogeographic study of this species.

Notopterygiumincisum;ITSsequence;rpl20-rps12 sequence

青海省青年基金項目(珍稀瀕危藥用植物羌活的瀕危機制研究[2013-Z-942Q])

楊路存(1981—)，女，博士，助理研究員，主要從事藥用植物分子生態(tài)學(xué)研究工作。

2015-06-30

Q949.763.3

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.02.019