王艷龍陳軍輝*，高莉媛王　帥，鄭曉玲孫承君王小如(國家海洋局第一海洋研究所，海洋生態(tài)研究中心，青島6606)(青島海洋科學與技術(shù)國家實驗室，海洋生態(tài)與環(huán)境科學功能實驗室，青島6607)

研究報告

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定海水懸浮顆粒物中的8種典型脂溶性藻毒素

王艷龍1陳軍輝*1，2高莉媛1王帥1，2鄭曉玲1孫承君1王小如1
1(國家海洋局第一海洋研究所，海洋生態(tài)研究中心，青島266061)2(青島海洋科學與技術(shù)國家實驗室，海洋生態(tài)與環(huán)境科學功能實驗室，青島266071)

海水懸浮顆粒物對海洋環(huán)境中污染物的遷移轉(zhuǎn)化有著重要的影響，在海水懸浮顆粒物上富集的脂溶性藻毒素會嚴重的毒害海洋濾食性生物。本研究建立了海水懸浮顆粒物中8種典型脂溶性藻毒素同步測定的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)分析方法。海水懸浮顆粒物樣品經(jīng)甲醇超聲輔助提取后，以5 mmol/L乙酸銨水溶液和乙腈為流動相，經(jīng)1．7微米C18色譜柱分離，采用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS/MS)多反應監(jiān)測(MRM)模式檢測，外標法定量。結(jié)果表明，在最佳實驗條件下，8種目標物在5min內(nèi)分離良好，加標回收率在83．8%～110．4%之間，方法具有良好的精密度(相對標準偏差(RSD)≤14．1%)和靈敏度(檢出限介于2．9～103 pg/g之間)，在線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0．996，能滿足海水懸浮顆粒物中8種典型脂溶性藻毒素同步檢測的要求。采用本方法初步分析了青島沿岸海域海水懸浮顆粒物中的脂溶性藻毒素，其中PTX2被檢出，含量最高可達790 pg/g(干重)。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;脂溶性藻毒素;海水;懸浮顆粒物;扇貝毒素

1　引言

海洋藻類產(chǎn)生的生物毒素是目前已知的最毒的一類天然有機化合物之一，迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的海洋藻類生物毒素及其衍生物約有200多種［1］，按溶解性質(zhì)可分為水溶性毒素和脂溶性毒素，其中脂溶性毒素約占90%，由于脂溶性毒素種類繁多，在全球范圍內(nèi)分布廣泛，對海洋生態(tài)環(huán)境、海產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及海產(chǎn)品安全影響巨大。近年來，隨著人們對海產(chǎn)品中脂溶性藻毒素的高度關(guān)注，對海洋環(huán)境中脂溶性藻毒素的研究也越來越深入，多名學者分別從美國、智利、澳大利亞、愛爾蘭、中國等海域海水中發(fā)現(xiàn)多種脂溶性毒素(主要包括大田軟海綿酸(OA)、鰭藻毒素(DTX)、扇貝毒素(PTX)、蝦夷扇貝毒素(YTX)、原多甲藻酸(AZA)、羅環(huán)內(nèi)酯毒素(SPX)等系列脂溶性藻毒素)［2～10］，而關(guān)于海水懸浮顆粒物中脂溶性藻毒素的研究卻鮮有報道，也沒有針對海水懸浮顆粒物中脂溶性藻毒素的有效檢測方法。

海水中懸浮顆粒物是海洋水體的重要組成部分，對水體中的污染物有很強的吸附能力，從而影響水體中污染物的遷移轉(zhuǎn)化和循環(huán)歸宿［11，12］。脂溶性污染物由于其疏水性強、在水中的溶解度低，使得它們易于在懸浮顆粒物上富集［13］。文獻［14］指出，海水中顆粒有機物是濾食性貝類的主要餌料之一，直接影響到濾食性貝類的攝食行為和生理活動;文獻［15］指出，懸浮顆粒物上富集的污染物更容易被水生生物體利用。因此，建立用于海水懸浮顆粒物中多種典型脂溶性藻毒素的檢測方法，對闡明海洋水體中脂溶性藻毒素在懸浮顆粒物中的賦存狀態(tài)，揭示脂溶性藻毒素的環(huán)境行為具有重要意義。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)由于具有靈敏度高、選擇性好、可提供待測物的結(jié)構(gòu)信息，以及在一個分析中可以同時測量多種化合物等優(yōu)點，目前已成為海產(chǎn)品［16～18］、海洋微藻［19～22］及海水［23］中多種脂溶性藻毒素測定的常用方法。本課題組在前期研究中采用HPLC-MS/MS實現(xiàn)了海水中3種脂溶性藻毒素的檢測，在此基礎(chǔ)上，本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(UPLC-MS/MS)，通過對樣品前處理實驗方法及UPLC-MS/MS分析條件的優(yōu)化，建立適用于海水懸浮顆粒物中8種典型脂溶性藻毒素(OA、米氏裸甲藻毒素(GYM)，DTX1，SPX1，YTX，AZA1，AZA2和PTX2)同步檢測的新方法，并用于青島近岸海域海水懸浮顆粒中脂溶性藻毒素的檢測。

2　實驗部分

2．1儀器與試劑

Acquity UPLC超高效液相色譜系統(tǒng)(美國Waters公司)，Thermo TSQ Endura三重四級桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧(ESI)離子源(美國Thermo Fisher公司);KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司);R201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司);BSA224S-CW型電子天平(德國Sartorius公司);Milli-Q超純水處理系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

乙腈、甲醇(色譜純，美國TEDIA公司);乙酸銨(優(yōu)級純，瑞士Fluka公司);水為自制Milli-Q超純水(18．2 MΩ);OA，GYM，DTX1，SPX1，YTX，AZA1，AZA2和PTX2毒素標準品(加拿大國家海洋研究中心)。

2．2標準溶液制備

取8種脂溶性海洋藻毒素(OA，GYM，DTX1，SPX1，YTX，AZA1，AZA2和PTX2)標準品各0．5 mL，分別用甲醇稀釋并定容至5 mL，得到8種典型脂溶性海洋藻毒素標準儲備液(單標)。按照一定的比例分別吸取相應的毒素的單標儲備液，用甲醇稀釋并定容至10 mL，得8種典型毒素的混合標準儲備液，其中OA，GYM，DTX1，SPX1，YTX，AZA1，AZA2和PTX2濃度分別為6．843，5．003，25．77，56．42，26．30，123．7，25．66和3．436μg/L，混合標準溶液置于-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

2．3樣品采集及前處理

2015年7月23日在青島沿岸海域選取了4個具有代表性的采樣站點(見圖1)，分別為中苑碼頭、第三海水浴場、麥島和石老人海水浴場，現(xiàn)場取表層海水1．5 L，保存于棕色玻璃瓶中，運回實驗室后，使用烘干至恒重的玻璃纖維濾膜(直徑為47 mm，孔徑為0．45μm)進行過濾，收集固體懸浮顆粒物;將濾膜置于40℃烘箱中烘至恒重，通過十萬分之一的電子天平稱量和計算，得到懸浮顆粒物的質(zhì)量。隨后，將帶有懸浮顆粒物的濾膜放入100 mL燒杯中，并加入10 mL甲醇，保證濾膜全部浸入甲醇溶液中。將燒杯放入超聲波儀中進行超聲輔助提取，超聲波儀參數(shù)設(shè)置為:溫度為室溫(20±2℃)、超聲時間為30 min、超聲功率為100%。超聲輔助提取后將提取液移至旋蒸瓶中，在42℃條件下蒸干，然后加入1 mL甲醇進行復溶(渦旋振蕩1min);甲醇復溶液經(jīng)0．22μm濾膜過濾，轉(zhuǎn)移至進樣瓶中，在-20℃條件下避光保存，待測。

2．4色譜-質(zhì)譜條件

2．4．1色譜條件Acquity UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2．1 mm，1．7"m，美國Waters公司);流動相:A為5mmol/L乙酸銨溶液，B為純乙腈;二元淋洗梯度: 0～4min，10%～70%B;4～6min，70%～90%B;6～7 min，90%～10%B;7～10min，10%B。流速:0．3 mL/ min;進樣體積:5μL;柱溫:室溫(20±2℃)。

2．4．2質(zhì)譜條件電噴霧電離源;GYM，SPX1，AZA1，AZA2和PTX2采用正離子模式(ESI+)檢測，OA，DTX1，YTX采用負離子模式(ESI-)檢測;電噴霧電壓:3500 V;毛細管溫度:350℃;輔助氣: 5 arb;鞘氣:35 arb;干燥氣溫度:350℃;掃描寬度(m/z):0．01;掃描時間:0．5 s。根據(jù)各組分的色譜保留時間和一級、二級質(zhì)譜特征優(yōu)化參數(shù)，按時間分段以多反應離子監(jiān)測(MRM)模式對各組分進行質(zhì)譜檢測。8種典型脂溶性藻毒素的保留時間、MRM選擇的母離子以及各化合物定性定量子離子、碰撞能量等參數(shù)見表1。

表1　8種脂溶性藻毒素串聯(lián)質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1　Parameters of MS/MS in MRM mode for eight lipophilic algae toxins

3　結(jié)果與討論

3．1色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化

在采用LC-MS/MS分析環(huán)境樣品的過程中，色譜對復雜基質(zhì)中目標化合物的充分分離對提高MS/MS檢測靈敏度和降低信號抑制起到了重要作用。乙腈-水是脂溶性海洋藻毒素LC分離時常用流動相［24，25］，而LC分離酸堿性物質(zhì)時，由于吸附作用(次級保留)會造成色譜峰拖尾，加入改良劑乙酸銨可以減少次級保留，大大改善峰形;因此，以含有5 mmol/L乙酸銨溶液和乙腈作為流動相，通過優(yōu)化梯度洗脫程序，在5 min內(nèi)實現(xiàn)了8種脂溶性海洋藻毒素的分離，各組分保留時間見表1;添加脂溶性藻毒素標準品的空白懸浮顆粒物樣品中8種脂溶性藻毒素分離色譜圖見圖2，可以看出，在優(yōu)化的條件下，各化合物分離良好。本課題組在前期研究中采用普通HPLC C18柱分離海水中的3種脂溶性海洋藻毒素，完成一個樣品的分析時間為50 min［23］，而本實驗采用UPLC分離8種脂溶性海洋藻毒素的時間僅為5 min，分離效率提升了10倍。

圖2 加標懸浮顆粒物樣品UPLC-MS/MS分析MRM色譜圖Fig．2　MRM chromatograms of the suspended particles spiked with eight lipophilic algae toxin standards for UPLC-MS/MSanalysis

質(zhì)譜條件的優(yōu)化是通過在流動注射模式下，以 10μL/min的流速分別將 OA，GYM，DTX1，SPX1，YTX，AZA1，AZA2和PTX2的標準溶液注入串聯(lián)質(zhì)譜的離子源中進行優(yōu)化。分別在ESI+和ESI-模式下對各目標化合物進行一級質(zhì)譜全掃描分析，為了使8種目標組分均獲得較高的靈敏度，綜合考慮，最后確定GYM，SPX1，AZA1，AZA2和PTX2在ESI+模式下進行檢測，GYM，SPX1，AZA1，SPX1和AZA2的二級質(zhì)譜分析母離子均為［M+H］+，而PTX2選擇信號最強的［M+NH4］+作為母離子;OA，DTX1，YTX在ESI-模式下進行檢測，OA和DTX1二級質(zhì)譜分析的母離子為［M－H］-，YTX選擇信號最強的［M－2H］2-作為母離子。此外，在MS/MS+MS模式下進行子離子掃描，從中選取豐度最強的碎片離子作為各自的定量離子，以次強的碎片離子作為定性離子，并優(yōu)化碰撞能量，優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

3．2前處理方法優(yōu)化

超聲波輔助提取具有快速、廉價、高效的優(yōu)勢，已被廣泛用于環(huán)境介質(zhì)中有機物的萃?。?6］，因而本研究采用超聲波輔助提取法提取海水懸浮顆粒物中脂溶性藻毒素。在樣品提取過程中，選擇合適的提取溶劑既能促進目標化合物的提取，又能消除一些不必要的基質(zhì)干擾。綜合考慮8種脂溶性藻毒素的化學性質(zhì)，分別以甲醇、異丙醇和丙酮為提取劑，對添加8種脂溶性藻毒素標準品的懸浮顆粒物進行提取，結(jié)果見圖3，甲醇對毒素OA，DTX1，YTX，AZA1和AZA2的提取率明顯高于丙酮和異丙醇，然而對毒素GYM和PTX2的提取率卻低于異丙醇，這可能與懸浮顆粒介質(zhì)的組成(如其中粘土礦物的種類和含量等)有關(guān)，具體原因尚需進一步研究?？紤]到8種脂溶性藻毒素的總體提取效果，最后選擇甲醇作為提取劑。

圖3　使用不同提取劑時8種脂溶性藻毒素的提取率Fig．3　Extraction ratio of eight lipophilic algae toxins using different extraction solvents

通過濾膜過濾海水獲得懸浮顆粒物之后，需要對懸浮顆粒物進行干燥處理，采用合適的干燥方法將有利于降低目標化合物的損失，本研究將8種脂溶性藻毒素標準品加入懸浮顆粒樣品中，分別采用40℃熱烘干法和冷凍干燥法進行處理。測量結(jié)果(圖4)表明，8種脂溶性藻毒素采用兩種干燥方法得到的提取率基本相似，并且均具有較好的提取率(各化合物提取率均高于75．0%)，說明8種脂溶性藻毒素在40℃熱烘干和冷凍干燥處理過程中均保持著良好的穩(wěn)定性。考慮到熱烘干法相對更便捷，最終選擇烘干法處理懸浮顆粒物樣品。

圖4　不同干燥條件下8種脂溶性藻毒素的提取率Fig．4　Extraction ratio of eight lipophilic algae toxins using different dryingmethods

3．3方法學考察

3．3．1基質(zhì)效應眾所周知，采用ESI作為離子源檢測環(huán)境樣品時，基質(zhì)效應(離子抑制或離子增強)可以導致測試目標化合物濃度過低或過高，因此，基質(zhì)效應對目標化合物的分析是一個重要的影響因素。為了評價粗提液中基質(zhì)對目標化合物質(zhì)譜分析的影響，采用空白懸浮顆粒物樣品的粗提液配制8種脂溶性藻毒素混合標準溶液，以甲醇配制的同一濃度水平的混合標準溶液作為對比，通過MS/MS分析測得各目標化合物的峰面積?；|(zhì)效應(ME)按式(1)計算:

式中，Ax為空白提取液配制毒素混標中目標化合物的峰面積;As表示相同濃度水平標準樣品中毒素的峰面積。實驗結(jié)果表明(表2)，懸浮顆粒物提取液中的基質(zhì)組分對各目標化合物有不同程度的抑制作用，抑制率在-12．9%～8．7%范圍內(nèi)。

3．3．2方法的線性范圍和檢出限由于存在基質(zhì)效應，標準品在甲醇溶液中的質(zhì)譜響應與其在實際樣品基質(zhì)中的響應不同，所以本研究采用基質(zhì)標準曲線外標法對目標化合物進行定量分析，以降低基質(zhì)效應對測定結(jié)果準確度的影響。取配制的8種毒素混合標準溶液使用空白懸浮顆粒物提取液對其進行梯度稀釋，稀釋倍數(shù)分別為1，2，5，10，20，50和100，按2．4節(jié)的分析條件進行測定。以被測組分的峰面積y為縱坐標，所測毒素的質(zhì)量濃度x為橫坐標，繪制定量標準曲線。將信噪比為3對應的質(zhì)量濃度作為方法的檢出限(LOD)，信噪比為10對應的質(zhì)量濃度作為方法的定量限(LOQ)。在MRM模式下選擇定量離子計算目標化合物EIC峰面積，代入線性曲線計算樣品濃度，以實現(xiàn)對實際樣品中的毒素定量，試樣溶液中待測物的響應值均應在本方法線性范圍內(nèi)。8種脂溶性藻毒素LC-MS/MS分析的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、和定量限見表2。

表2　線性范圍、靈敏度和基質(zhì)效應實驗結(jié)果Table 2　Results of linear range，sensitivity and matrix effects

3．3．3回收率和精密度為了考察方法的準確性和可靠性，取8種毒素的混合標準品溶液采用標準加入法，將30，100和200μL的8種毒素標準品混合溶液分別加入懸浮顆粒樣品中，每個添加水平重復6次，按照2．3和2．4節(jié)所述步驟進行樣品處理和測定，各化合物回收率和相對標準偏差(RSD)測定結(jié)果如表3所示。懸浮顆粒物中添加的8種脂溶性藻毒素的回收率為83．8%～110．4%，相對標準偏差(RSD)均低于14．1%，表明本方法的回收率和精密度良好，能滿足實際懸浮顆粒物樣品中各種脂溶性藻毒素的準確測量的要求。

表3　加標回收率和精密度實驗結(jié)果Table 3　Results of recovery and precision

3．4青島近岸海水懸浮顆粒物中毒素的測定

采用已建立的UPLC-MS/MS方法，對青島近岸海域4個站點海水中的懸浮顆粒物樣品進行了8種典型脂溶性藻毒素的檢測。通過比較懸浮顆粒物樣品與毒素標準溶液的提取離子色譜(EIC)峰的保留時間及二級質(zhì)譜圖的特征定性離子和定量離子對目標化合物進行定性，定量檢測結(jié)果表明，中苑碼頭和麥島的海水懸浮顆粒物樣品中8種脂溶性毒素的含量均低于本方法的檢出限，而石老人和第三海水浴場的海水懸浮顆粒物樣品中檢測出了毒素PTX2，其含量分別為717和790 pg/g。

4　結(jié)論

本研究建立了適用于海水懸浮顆粒物中脂溶性藻毒素測定的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。本方法簡單快捷、靈敏度和精密度高，回收率良好，能夠滿足海水懸浮顆粒物樣品中8種典型脂溶性藻毒素同時測定的要求。此外，對采自青島近岸海域4個站點海水懸浮顆粒物樣品進行了檢測，在兩個樣品中檢測出了毒素PTX2，說明青島近岸海水懸浮顆粒物中存在一定程度的脂溶性毒素污染。

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Determination of Eight Typical Lipophilic Algae Toxins in Particles Suspended in Seawater by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WANG Yan-Long1，CHEN Jun-Hui*1，2，GAO Li-Yuan1，WANG Shuai1，2，ZHENG Xiao-Ling1，SUN Cheng-Jun1，WANG Xiao-Ru1
1(Research Center for Marine Ecology，The First Institute of Oceanography，State Oceanic Administration，Qingdao 266061，China)2(Laboratory of Marine Ecology and Environmental Science，Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology，Qingdao 266071，China)

The particles suspended in seawater have great influence on pollutantmigration and transformation in marine environment，while the lipophilic algae toxins enriched by the particles suspended in seawater will lead more serious toxicity to marine filter feeders．In this study，a new method was developed for the simultaneous determination of eight lipophilic algae toxins in suspended particles by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)．After extracted with methanol by ultrasonicassisted extraction，the sample was separated on an Acquity UPLC BEH C18 column(50 mm×2．1 mm，1．7μm)using gradient elution of acetonitrile and water containing 5 mmol/L ammonium acetate as eluent modifiers．The qualitative and quantitative analyseswere carried out by electrospray ionization(ESI)tandem mass spectrometry in multiple reaction monitoring(MRM)mode．Under the optimal conditions，satisfactory precision(relative standard deviations(RSD≤14．1%)，recoveries(83．8%－110．4%)and detection limits (2．9－103 pg/g)of themethod were achieved．Good linearity(R2≥0．99)was also obtained for all studied analytes．Then，the method was applied to determine the amounts of the eight lipophilic marine toxins in authentic suspended particle samples collected from Qingdao near-shore area．Pectenotoxin 2(PTX2)was detected in the samples from Shilaoren beach and No．3 bathing beach with concentration ranges of 717 and 790 pg/g，respectively．

Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry;Lipophilic algae toxins; Seawater;Suspended particles;Pectenotoxin 2

9 September 2015;accepted 20 December 2015)

10．11895/j．issn．0253-3820．150714

2015-09-09收稿;2015-12-20接受

本文系國家基金委-山東省聯(lián)合基金項目(No．U1406403)、中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項(No．2014T05)、山東省自然科學基金(No．ZR2015PD003)和2012泰山學者海外人才項目資助

*E-mail:jhchen@fio．org．cn