沈亞，丁家怡，徐麗，邵駿，金華，陳麗

（江蘇省南通市婦幼保健院生殖中心，江蘇 南通 226006）

基于定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的多囊卵巢綜合征與促卵泡激素的受體基因多態(tài)性的相關(guān)性研究

沈亞，丁家怡，徐麗，邵駿，金華，陳麗

（江蘇省南通市婦幼保健院生殖中心，江蘇 南通 226006）

目的多囊卵巢是造成不孕和子宮內(nèi)膜癌等疾病的重要因素之一，該研究目的是探索多囊卵巢與相關(guān)單核苷酸的多態(tài)性位點(diǎn)相關(guān)性。方法該研究首先提出了一種改良的等位特異的定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)并對(duì)其進(jìn)行了可靠性評(píng)估，隨后對(duì)多囊卵巢患者和對(duì)照樣本進(jìn)行了卵泡刺激素受體基因兩個(gè)單核苷酸的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行了分型鑒定。結(jié)果該研究結(jié)果顯示其提出的改良的定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法進(jìn)行單核苷酸的多態(tài)性位點(diǎn)分型準(zhǔn)確度高，區(qū)分度好，與Sanger測(cè)序法獲得的結(jié)果完全一致，能夠很好的用于單核苷酸的多態(tài)性等多態(tài)性位點(diǎn)的分型鑒定；該實(shí)驗(yàn)對(duì)152例多囊卵巢患者和152例對(duì)照樣本中卵泡刺激素受體基因兩個(gè)單核苷酸的多態(tài)性位點(diǎn)分型檢測(cè)結(jié)果顯示Thr307Ala和Asn680Ser兩個(gè)位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率均呈現(xiàn)了與多囊卵巢之間的顯著相關(guān)性。結(jié)論該研究結(jié)果表明卵泡刺激素受體基因的兩個(gè)單核苷酸的多態(tài)性位點(diǎn)可能與多囊卵巢的發(fā)病密切相關(guān)，為深入探討該疾病和進(jìn)一步研究單核苷酸的多態(tài)性分型奠定了基礎(chǔ)。

單核苷酸的多態(tài)性分型；等位特異聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；多囊卵巢綜合征；卵泡刺激素受體

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是育齡婦女常見(jiàn)的內(nèi)分泌及生殖功能障礙性疾病，育齡期婦女的患病率為4%～12%[1-2]。臨床表現(xiàn)，主要為閉經(jīng)、多毛、肥胖、不孕等，并且伴有明顯的代謝異常，如胰島素血癥、胰島素抵抗等[3]。但是目前，PCOS的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，因此進(jìn)一步探討PCOS密切相關(guān)的基因及其多態(tài)性信息對(duì)于更好的了解并預(yù)防治療該疾病意義重大。

促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）具有調(diào)節(jié)固醇類激素的合成以及促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟的作用。因此，許多學(xué)者和臨床工作者認(rèn)為其與多囊卵巢綜合征的發(fā)病存在重要的關(guān)系[4]。從而圍繞該基因開(kāi)展一些探索研究，而且促卵泡激素的受體（follicle-stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR）也被認(rèn)為是PCOS遺傳的候選致病基因之一[5-6]。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有一些研究針對(duì)FSHR的多核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行研究，但是研究結(jié)論至今并不一致[7-9]。FSHR的基因多態(tài)性到底與PCOS有沒(méi)有相關(guān)性仍需要進(jìn)一步探索研究。

盡管基因多態(tài)性的研究技術(shù)已經(jīng)非常成熟，但是隨著生物技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，諸如單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）檢測(cè)這類技術(shù)仍然在不斷地發(fā)展進(jìn)步。近年來(lái)能夠進(jìn)行點(diǎn)突變定量檢測(cè)的擴(kuò)增受阻突變系統(tǒng)（amplification-refractory mutation system，ARMS）技術(shù)逐漸發(fā)展起來(lái)[10-11]，它結(jié)合Taqman熒光探針定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)能夠高效準(zhǔn)確地進(jìn)行突變位點(diǎn)的檢測(cè)和定性及定量分析，但是利用熒光探針的檢測(cè)技術(shù)成本仍然較高，為此筆者借鑒ARMS的等位擴(kuò)增技術(shù)，利用嵌入式熒光染料的定量PCR技術(shù)對(duì)SNP位點(diǎn)的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了改良。并利用該改良的技術(shù)對(duì)FSHR基因的2個(gè)SNP位點(diǎn)Asn680Ser和Thr307Ala進(jìn)行檢測(cè)分析。在漢族人群中對(duì)其與多囊卵巢綜合征之間的相關(guān)性進(jìn)行進(jìn)一步的探索研究，為更加確切的探查該疾病的發(fā)病機(jī)制提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象

選取2014年3月-2015年8月于南通市婦幼保健院就診的PCOS患者共152例。PCOS的納入標(biāo)準(zhǔn)[12]：①具有多囊卵巢綜合征典型的臨床特征：月經(jīng)異常，不同程度的多毛或者肥胖；②B超或腹腔鏡檢測(cè)顯示多囊卵巢及卵巢無(wú)排卵現(xiàn)象（一側(cè)或雙側(cè)卵巢中小于10mm的卵泡數(shù)>10個(gè)）；③近2個(gè)月內(nèi)未使用類固醇類激素，月經(jīng)周期第3天或閉經(jīng)期黃體生成素與FSH的比值>2，同時(shí)睪酮值>2.2 nmol/L。上述標(biāo)準(zhǔn)符合兩項(xiàng)且同時(shí)排除其他內(nèi)分泌疾病者可診斷為PCOS。同時(shí)收集同期在該院就診的對(duì)照樣本152例。年齡與婚姻狀況與PCOS組相匹配。所有研究對(duì)象均簽署了參與本研究的知情同意書，本研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2樣本收集與DNA提取

所有的研究對(duì)象均在就診當(dāng)日抽取外周血2ml，乙二胺四乙酸鹽抗凝?；蚪MDNA的提取采用碘化鈉方法，簡(jiǎn)述如下：取500μl抗凝血，加1 ml無(wú)菌水，輕輕顛倒混勻，10 000 r/min離心3 min，棄上清液，加入6 mol/L碘化鈉NaI 100μl，混旋20 s，加入200μl氯仿異戊醇，混勻12 000 r/min離心5 min；轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管，加入90μl異丙醇，混勻，12 000 r/min離心5min。棄上清液，沉淀用75%的乙醇清洗2次，用50μl無(wú)菌水溶解，NanoDrop紫外分光光度計(jì)和Qubit熒光定量?jī)x進(jìn)行基因組DNA的質(zhì)控分析。置入-20℃冰箱冷凍保存或立刻進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

1.3SNP檢測(cè)方法的建立與驗(yàn)證

1.3.1引物的設(shè)計(jì)根據(jù)兩個(gè)SNP位點(diǎn)及其旁側(cè)序列，設(shè)計(jì)PCR引物和檢測(cè)探針，進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。見(jiàn)表1。

表1　引物序列信息

1.3.2SNP多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)的原理該檢測(cè)方案為等位特異PCR與定量PCR兩種技術(shù)的結(jié)合[13]，定量PCR應(yīng)用嵌入式熒光染料方法進(jìn)行。具體方案為：根據(jù)目標(biāo)SNP的位點(diǎn)設(shè)計(jì)一組擴(kuò)增引物，包括2條正向引物和1條通用的反向引物，正向引物分為野生型和突變型兩種，在正向引物靠近3'-末端的位置引入一個(gè)錯(cuò)配堿基（一般在靠近3'-端的第4個(gè)堿基），這樣可以大大降低非特異性擴(kuò)增，提高野生型和突變型的區(qū)分度。

1.3.3反應(yīng)體系總體積為20μl，包含DNA模板（20 ng/μl）1μl，2×SYBRRFast qPCR Mix 10μl，正向引物和反向引物各1μ（l10 umol），用雙蒸水補(bǔ)足至20μl。熱循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性5 min，93℃變性15s，62℃退火50s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析。最后根據(jù)在ABI 7500熒光定量PCR儀上讀取Ct值和溶解曲線信息，分析確定每個(gè)樣本的基因分型結(jié)果。

1.3.4檢測(cè)結(jié)果的驗(yàn)證在SNP位點(diǎn)旁側(cè)序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，使產(chǎn)物中間部位涵蓋目標(biāo)SNP位點(diǎn)。普通PCR擴(kuò)增后進(jìn)行Sanger測(cè)序分析，以此驗(yàn)證利用改良方法檢測(cè)該SNP位點(diǎn)的準(zhǔn)確性。

1.3.5PCOS患者樣本FSHR基因多態(tài)性的檢測(cè)利用前期改良優(yōu)化的檢測(cè)技術(shù)分析收集到的152例PCOS患者樣本和對(duì)照樣本的SNP位點(diǎn)分析情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果中等位基因及基因型頻率用百分比表示。根據(jù)Hardy-Weinberg平衡定律計(jì)算各基因型個(gè)體數(shù)的期望值[14]，組間基因型頻率及等位基因頻率的差異比較行χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1樣本DNA的提取與質(zhì)控

所有樣本獲得的基因組DNA都進(jìn)行濃度測(cè)定和完整性質(zhì)控。檢測(cè)結(jié)果表明絕大多數(shù)樣本提取的基因組都較完整，基本無(wú)降解拖帶現(xiàn)象，DNA濃度均在80～120 ng/μl之間，完全符合后續(xù)基因多態(tài)性檢測(cè)的要求。典型的樣本基因組DNA的Nano Drop檢測(cè)結(jié)果如下圖所示，OD260與OD280的比值在1.8左右，OD260與OD230的比值都>1.5，純度和濃度完全符合后續(xù)試驗(yàn)的要求。見(jiàn)圖1。

圖1　基因組DNA的Nano Drop檢測(cè)結(jié)果

圖2　定量PCR檢測(cè)曲線和對(duì)應(yīng)的Sanger測(cè)序結(jié)果

2.2SNP多態(tài)性檢測(cè)方法的驗(yàn)證

如圖2所示，首先利用Sanger法測(cè)序分析獲得一個(gè)野生型樣本，一個(gè)突變型樣本和一個(gè)雜合型樣本的確切結(jié)果。然后將已經(jīng)明確分型結(jié)果的3個(gè)樣本用改良的等位特異的定量PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，并且對(duì)兩種方法獲得的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果兩者檢測(cè)技術(shù)獲得結(jié)果完全一致，從而表明本實(shí)驗(yàn)中改良的SNP檢測(cè)技術(shù)具有很好的SNP位點(diǎn)的區(qū)分能力，可以準(zhǔn)確的區(qū)分野生型、雜合型與突變型樣本。對(duì)于野生型樣本，當(dāng)用野生型正向引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，其Ct值在15左右；而用突變型引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，其Ct值在35左右，相當(dāng)于本底擴(kuò)增水平，溶解曲線呈現(xiàn)典型的單一的尖峰。對(duì)于突變型和雜合型樣本，該定量PCR檢測(cè)結(jié)果同樣呈現(xiàn)出了良好的鑒別能力，與Sanger測(cè)序獲得的結(jié)果完全一致。

為了進(jìn)一步確定該定量PCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)SNP位點(diǎn)的區(qū)分準(zhǔn)確度。筆者隨機(jī)選擇80例對(duì)照樣本進(jìn)行SNP位點(diǎn)的檢測(cè)分析，其中部分樣本還進(jìn)行Sanger測(cè)序分析，驗(yàn)證結(jié)果均呈現(xiàn)一致性。綜合分析結(jié)果顯示，本研究中等位特異的定量PCR的SNP分型結(jié)果具有很高的區(qū)分度，可以進(jìn)行準(zhǔn)確的多態(tài)性分型。3種SNP分型結(jié)果分別集中在圖中的3個(gè)區(qū)域，相互之間存在明確的界限。野生型和突變型之間的擴(kuò)增產(chǎn)物的Ct值最小差異均>8，而雜合型樣本中2個(gè)產(chǎn)物的Ct值差異很小，其最大差異<5，相關(guān)樣本的SNP分型結(jié)果均可以準(zhǔn)確判讀。見(jiàn)圖3。

圖3　利用定量PCR進(jìn)行SNP分型的結(jié)果

2.3多囊卵巢綜合征FSHR基因兩個(gè)SNP位點(diǎn)的檢測(cè)分析

利用上述改良的等位特異的定量PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)帶有錯(cuò)配堿基的擴(kuò)增引物對(duì)152例多囊卵巢綜合征樣本和相應(yīng)的對(duì)照樣本進(jìn)行2個(gè)SNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)。其中除有1例多囊卵巢樣本因DNA濃度等問(wèn)題沒(méi)有獲得理想的擴(kuò)增曲線外，其余樣本均獲得了明確的分型結(jié)果。見(jiàn)表2。

表2　PCOS組與對(duì)照組FSHR基因Asn680Ser多態(tài)性位點(diǎn)等位基因頻率及各基因型頻率的分布情況例（%）

經(jīng)χ2檢驗(yàn)，F(xiàn)SHR基因Asn680Ser多態(tài)性位點(diǎn)符合Hardy-Weinburg平衡。所有的303個(gè)研究對(duì)象等位基因型分布為GG（12.5%），GA（46.5%），AA（41%），PCOS組與對(duì)照組間等位基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009），等位基因頻率在PCOS組和對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004）。

經(jīng)χ2檢驗(yàn)，Thr307Ala位點(diǎn)符合Hardy-Weinburg平衡。如上表所示，所有303個(gè)研究對(duì)象等位基因型分布為GG（12.5%）GA（37.6%）AA（49.9%），PCOS組和對(duì)照組間等位基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003），等位基因頻率在PCOS組和對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。見(jiàn)表3。

表3　PCOS組與對(duì)照組FSHR基因Thr307Ala多態(tài)性位點(diǎn)等位基因頻率及各基因型頻率的分布情況例（%）

3 討論

本研究中筆者采用一種改良的等位基因定量PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行SNP的檢測(cè)。應(yīng)用嵌入式熒光染料方式進(jìn)行定量PCR的信號(hào)檢測(cè)，通用性好，操作簡(jiǎn)單，成本低廉，而且能夠通過(guò)溶解曲線對(duì)特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體進(jìn)行區(qū)分，通過(guò)在引物序列中引入錯(cuò)配能夠很好的獲得多態(tài)性位點(diǎn)的分型結(jié)果。在等位基因特異性擴(kuò)增中，靠近正向引物的3'-端附近區(qū)域引入1個(gè)或2個(gè)錯(cuò)配堿基，會(huì)在一定程度上降低擴(kuò)增效率，但該引物設(shè)計(jì)可以更好的區(qū)分3'-末端的堿基差異，使純合子樣本中兩種引物的擴(kuò)增曲線很好的分開(kāi)，能夠?qū)崿F(xiàn)準(zhǔn)確的SNP分型。在本實(shí)驗(yàn)中靠近3'-端第4個(gè)堿基位置引入錯(cuò)配，達(dá)到了準(zhǔn)確區(qū)分SNP不同分型的目的。為疾病相關(guān)SNP位點(diǎn)的分型鑒定打下了良好的基礎(chǔ)。

SNP是人類可遺傳的變異中最常見(jiàn)的一種，數(shù)量多、分布廣、密度大、突變率低，對(duì)于疾病在基因中的定位具有重要的意義。本研究中筆者分析了300多例相關(guān)人群在FSHR基因上2個(gè)SNP位點(diǎn)的分型情況，結(jié)果顯示這兩個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率與多囊卵巢綜合征之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），從而提示FSHR基因多態(tài)性的差異與PCOS的發(fā)病可能存在相關(guān)性，這為PCOS的進(jìn)一步深入研究和控制提供了基因水平重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

作為腺垂體分泌的一種糖蛋白激素，F(xiàn)SH在人類生殖中具有重要作用。FSH在靶細(xì)胞增殖和分化方面有不可替代的作用，間接影響卵子成熟。FSHR基因突變會(huì)造成明顯的卵泡成熟障礙。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR基因存在常見(jiàn)的SNPs，而且可能影響受體活性，進(jìn)而導(dǎo)致卵巢功能的異常。其中FSHR基因啟動(dòng)子區(qū)和第10外顯子的SNPs研究較多，特別是第10外顯子307密碼子的A～G多態(tài)以及680密碼子的G-A多態(tài)[15-16]。多數(shù)研究證實(shí)，該基因外顯子SNP位點(diǎn)的多態(tài)性與卵巢的功能存在密切相關(guān)性[17]。盡管多數(shù)報(bào)道的樣本數(shù)量都在300以下，而且有關(guān)其與多囊卵巢綜合征相關(guān)性的結(jié)論也不統(tǒng)一，但是畢竟確定結(jié)論是FSHR基因多態(tài)性與卵巢的儲(chǔ)備，卵巢的反應(yīng)性以及卵巢腫瘤等都存在相關(guān)性[18-19]，是導(dǎo)致卵巢功能異常疾病的一個(gè)重要因素。該觀點(diǎn)在本研究中的2個(gè)SNP位點(diǎn)分析結(jié)果與多囊卵巢綜合征間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義得到進(jìn)一步的證實(shí)。

總之，有關(guān)FSHR基因多態(tài)性與卵巢功能的相關(guān)性的研究還需要進(jìn)一步探索，明確其與多囊卵巢綜合征及其他卵巢功能異常發(fā)生的確切關(guān)聯(lián)性，對(duì)于個(gè)性化治療卵巢功能異常相關(guān)的疾病，預(yù)防并發(fā)癥，減少治療費(fèi)用，具有重要的臨床意義。

研究提出并驗(yàn)證一種快速、低成本、準(zhǔn)確的基于定量PCR技術(shù)的SNP分析方法；對(duì)多囊卵巢綜合征患者FSHR基因的分型檢測(cè)結(jié)果表明，研究涉及的2個(gè)SNP位點(diǎn)與疾病的發(fā)生差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

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（張蕾編輯）

Association analysis of follicle-stimulating hormone receptor gene polymorphisms with polycystic ovarian syndrome

Ya Shen，Jia-yi Ding，Li Xu，Jun Shao，Hua Jin，Li Chen
（Department of Reproductive Center，Nantong Maternal and Child Health Hospital，Nantong，Jiangsu 226006，China）

Objective To investigate the relationship between polycystic ovary syndrome（PCOS）and Folliclestimulating hormone receptor.Methods Improved qPCR based SNP detection method was developed and used in genotyping of FSHR in PCOS.Validation was performed by Sanger sequencing.Results Results showed that it could be well genotyped by this qPCR based method，and all the results were consistent with Sanger sequencing.The distribution of the allele frequency and genotype frequency were significant differences between FSHR and PCOS，which indicated that the site of Thr307Ala and Asn680Ser might be closely related with PCOS.Conclusions It proves a novel method for SNP genotyping and the results denoted important foundation for SNP detection and PCOS investigation.

single nucleotide polymorphism genotype；allele specific polymerase chain reaction；quantitative polymerase chain reaction；polycystic ovarian syndrome；follicle-stimulating hormone receptor

R 588.6

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.20.005

1005-8982（2016）20-0021-06

2016-01-06

丁家怡，E-mail：djy916@126.com；Tel：13806295506