王明明，李安寧，趙志東，張亞冉，段美艷，王亞寧，李世軍，昝林森，2

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 國家肉牛改良中心，陜西 楊凌 712100)

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牛MYOZ1基因啟動子活性分析

王明明1，李安寧1，趙志東1，張亞冉1，段美艷1，王亞寧1，李世軍1，昝林森1，2

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 國家肉牛改良中心，陜西 楊凌 712100)

【目的】 鑒定牛MYOZ1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，確定牛MYOZ1基因核心啟動子區(qū)域，為進(jìn)一步研究牛MYOZ1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?以秦川牛肌肉5′ RACE準(zhǔn)備cDNA為模板，設(shè)計(jì)5′ RACE擴(kuò)增試驗(yàn)，確定牛MYOZ1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。以秦川牛外周血基因組DNA為模板，通過PCR克隆獲得牛MYOZ1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)-1 628/+61目的片段。通過生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測可能包含的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)逐段缺失引物，獲得7個亞克隆，將其分別與pGL3-Basic載體連接，得到牛MYOZ1基因啟動子雙熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞系，檢測7個重組質(zhì)粒的熒光素酶活性，分析啟動子活性?！窘Y(jié)果】 確定了牛MYOZ1基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，成功克隆獲得7個系列缺失的牛MYOZ1基因啟動子雙熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒：pMYOZ1-1 628/+61、pMYOZ1-1 430/+61、pMYOZ1-1 179/+61、pMYOZ1-932/+61、pMYOZ1-676/+61、pMYOZ1-437/+61和pMYOZ1-116/+61，其中重組質(zhì)粒pMYOZ1-116/+61啟動子活性極顯著高于pGL3-Basic，推測牛MYOZ1基因-116/+61區(qū)域可能包含核心啟動子；重組質(zhì)粒pMYOZ1-1 628/+61啟動子活性極顯著高于pMYOZ1-1 430/+61片段活性 (P<0.01) ，表明牛MYOZ1基因啟動子區(qū)域-1 628/-1 430片段可能包含啟動子活性增強(qiáng)元件。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，牛MYOZ1基因啟動子-116/+61片段可能包含SP1、GC Box、CAAT等多個重要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；-1 628/-1 430片段可能包含SP1、MyoD等多個重要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)?！窘Y(jié)論】 成功構(gòu)建了7個系列缺失的牛MYOZ1基因啟動子雙熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒，且初步確定了牛MYOZ1基因的核心啟動子區(qū)域位于-116/+61。

牛；MYOZ1；5′ RACE；啟動子；雙熒光素酶報(bào)告載體

嫩度是評價(jià)肉品質(zhì)的重要指標(biāo)。肌肉嫩度主要受肌纖維類型影響，與肌肉中氧化型慢肌纖維含量呈正相關(guān)[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，肌原調(diào)節(jié)蛋白1(Myozenin1，MYOZ1)基因可以促進(jìn)快肌纖維向慢肌纖維的轉(zhuǎn)化[3]。

MYOZ1蛋白參與肌纖維Z線形成以及快肌纖維相關(guān)生理過程[4]，而肌纖維Z線在肌小節(jié)組裝和不同類型肌纖維形成等過程中起著廣泛的調(diào)控作用[5]。當(dāng)小鼠的MYOZ1基因被敲除后，肌小節(jié)Z線上無MYOZ1蛋白結(jié)合，編碼慢肌纖維的基因開始轉(zhuǎn)錄和翻譯，導(dǎo)致肌肉中慢肌纖維的比例增加[6]。另外，MYOZ1基因的表達(dá)可能與動物初生體質(zhì)量相關(guān)。研究表明，綿羊胚胎發(fā)育后期，MYOZ1基因的表達(dá)可能與胎羊初生體質(zhì)量呈正相關(guān)[7]。目前，豬MYOZ1基因核心啟動子已經(jīng)開始被應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因技術(shù)。過氧化物酶體增殖物激活受體γ2(Peroxisome proliferator-activated receptor γ2，PPAR-γ2)是調(diào)控脂肪細(xì)胞分化及其攝取和貯存脂肪酸的關(guān)鍵因子。在轉(zhuǎn)豬PPAR-γ2基因小鼠體內(nèi)，可以通過在豬PPAR-γ2基因調(diào)控區(qū)插入豬MYOZ1基因核心啟動子來上調(diào)PPAR-γ2基因在RNA和蛋白水平上的表達(dá)[8]。這表明可以通過轉(zhuǎn)基因方法利用豬MYOZ1基因核心啟動子改善豬肉品質(zhì)。

綜上所述，MYOZ1基因在骨骼肌生長發(fā)育、肌纖維類型調(diào)控以及動物的形體和肉質(zhì)研究方面均具有重要價(jià)值?；虻谋磉_(dá)受啟動子調(diào)控，目前對于MYOZ1基因啟動子的研究主要集中在豬[9]和小鼠[10]上，在牛上尚未見相關(guān)研究報(bào)道，而牛MYOZ1基因與小鼠和豬的MYOZ1基因差異較大，因此對牛MYOZ1基因啟動子的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本試驗(yàn)以秦川肉牛為研究對象，對其MYOZ1基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和啟動子核心區(qū)進(jìn)行了研究，以期為進(jìn)一步探討牛MYOZ1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

雙熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-Basic(內(nèi)含螢火蟲熒光素酶基因)、pGL3-Control及其內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK(含海腎熒光素酶基因)、DNA膠快速回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，均購自Promega公司；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，購自北京全式金生物公司；PMD19-T(simple)載體、BglⅡ、HindⅢ限制性內(nèi)切酶，購自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶，購自Neb公司；SMARTTMRACE Kit試劑盒，購自Clonetech公司；PBS、DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清，購自Hyclone公司；LipofectamineTMReagent 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒，購自Invitrogen公司；無血清OPTI-MEM培養(yǎng)基，購自GIBCO公司。秦川牛外周血基因組DNA及其肌肉組織 5′ RACE 準(zhǔn)備cDNA、小鼠成肌細(xì)胞系(C2C12細(xì)胞系)，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)國家肉牛改良中心保存。

1.2MYOZ1系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

在NCBI上搜索牛(登錄號：AAI22690.1)、人(登錄號：NP_067068.1)、小鼠(登錄號：NP_067483.1)、豬(登錄號：NP_001020393.1)、綿羊(登錄號：XP_004021522.1)、山羊(登錄號：XP_005699272.1)的MYOZ1氨基酸序列，應(yīng)用SECentral軟件比對不同物種間MYOZ1氨基酸序列的相似性，用MEAG 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3牛MYOZ1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的確定

以秦川牛肌肉組織5′RACE準(zhǔn)備cDNA為模板，采用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)5′ RACE特異引物MYOZ1-GSP1和MYOZ1-GSP2，交由南京金斯瑞公司合成，其相關(guān)信息見表1。用特異引物MYOZ1-GSP1、MYOZ1-GSP2及SMARTTMRACE Kit試劑盒提供的通用引物Universal Primer A Mix (UPM)，根據(jù)試劑盒提供的方法，進(jìn)行5′ RACE PCR擴(kuò)增。降落PCR第1輪擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30個循環(huán)。將第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物用ddH2O稀釋20倍，以之為模板進(jìn)行第2輪擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 130 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。將第2輪PCR產(chǎn)物連接PMD19-T(simple)載體，挑取10個單克隆送南京金斯瑞公司測序，分析確定牛MYOZ1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。

表 1　試驗(yàn)所用的PCR引物Table 1　PCR primers used in the experiment

注：MYOZ1-F1～MYOZ1-F7序列中斜體部分為BglⅡ酶切位點(diǎn)，MYOZ1-R序列中斜體部分為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。

Note:Italicized letters in MYOZ1-F1-MYOZ1-F7 presentedBglⅡ binding sites,in MYOZ1-R presentedHind Ⅲ binding sites.

1.4牛MYOZ1基因啟動子及其7個逐段缺失片段的PCR擴(kuò)增

1.4.1啟動子5′側(cè)翼區(qū)-1 628/+61序列克隆根據(jù)GenBank中牛MYOZ1基因上游啟動區(qū)約2 kb DNA序列(GenBank登錄號為：281939)，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)1對用于擴(kuò)增牛MYOZ1基因啟動子區(qū)-1 628/+61的引物M1qdzF和M1qdzR，其信息見表1，引物由南京金斯瑞公司合成。

以牛外周血基因組DNA為模板，用引物M1qdzF和M1qdzR PCR擴(kuò)增牛MYOZ1基因啟動子5′側(cè)翼區(qū)-1 628/+61序列，反應(yīng)體系：10×buffer 2 μL，dNTP 2 μL，MgSO41 μL，引物M1qdzF 0.6 μL，引物M1qdzR 0.6 μL，模板DNA 1.2 μL，ddH2O 12.2 μL，KOD 0.4 μL，共20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 130 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收純化后，與PMD19-T(simple) 于16 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑選陽性單克隆菌落，搖菌12 h，進(jìn)行菌液PCR檢測后，送南京金斯瑞公司測序。

1.4.2啟動子7個逐段缺失片段的PCR擴(kuò)增通過GenBank檢索并下載牛MYOZ1基因上游啟動區(qū)2 kb DNA序列，應(yīng)用在線軟件Genomatix(http://www.genomatix.de/cgibin//matinspector)、TFSEARCH(http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)預(yù)測牛MYOZ1基因啟動子區(qū)域可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)軟件預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)7條逐段缺失啟動子序列的5′端包含BglⅡ酶切位點(diǎn)(AGATCT)的上游引物MYOZ1-F1、MYOZ1-F2、MYOZ1-F3、MYOZ1-F4、MYOZ1-F5、MYOZ1-F6、MYOZ1-F7和1條5′端包含Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)(AAGCTT)的下游引物MYOZ1-R，引物相關(guān)信息見表1，由南京金斯瑞公司合成。

以已轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物的感受態(tài)細(xì)胞DH5α菌液為模板，分別用上游引物MYOZ1-F1、MYOZ1-F2、MYOZ1-F3、MYOZ1-F4、MYOZ1-F5、MYOZ1-F6、MYOZ1-F7和下游引物MYOZ1-R進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：10×buffer 2 μL，dNTP 2 μL，MgSO41.2 μL，上游引物 0.6 μL，下游引物 0.6 μL，模板DNA 1.2 μL，ddH2O 12 μL，KOD 0.4 μL，共20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 130 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測，膠回收后，送南京金斯瑞公司測序。

1.5雙熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建

將純化的7個牛MYOZ1基因逐段缺失啟動子目的片段和pGL3-Basic載體，分別用HindⅢ和BglⅡ于37 ℃雙酶切3 h，瓊脂糖凝膠電泳檢測，并切膠回收目的片段。將回收的7個牛MYOZ1基因逐段缺失片段分別與pGL3-Basic載體用T4 DNA連接酶連接，16 ℃恒溫儀上孵育2 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基(氨芐質(zhì)量濃度為100 mg/mL)上，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑選陽性單克隆菌落，37 ℃下200 r/min搖菌培養(yǎng)20 h。取菌液提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行HindⅢ和BglⅡ雙酶切鑒定(同時設(shè)pGL3-Basic雙酶切對照)，送南京金斯瑞公司測序。

1.6C2C12細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

用含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)C2C12細(xì)胞系，在轉(zhuǎn)染前一天將生長狀態(tài)良好的C2C12細(xì)胞系按每孔1×105個細(xì)胞的量接種至24孔板，每孔加入500 μL不含抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基，設(shè)3個復(fù)孔，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞單層長至70%～80%融合時進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。

為研究牛MYOZ1基因啟動子不同區(qū)域的啟動活性，將1.5節(jié)構(gòu)建好的7個重組質(zhì)粒各800 ng分別轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，同時轉(zhuǎn)入內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK 10 ng，按照LipofectamineTMReagent 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明進(jìn)行試驗(yàn)操作。以轉(zhuǎn)染pGL3-Basic質(zhì)粒的C2C12細(xì)胞為陰性對照，以轉(zhuǎn)染pGL3-Control質(zhì)粒的C2C12細(xì)胞為陽性對照，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7啟動子相對活性的測定

按照Promega公司雙熒光檢測試劑盒說明書，用酶標(biāo)儀檢測螢火蟲熒光素酶活性(F值)與海腎熒光素酶活性(R值)，計(jì)算其比值來反映不同啟動子片段的相對活性。每次轉(zhuǎn)染均設(shè)pGL3-Basic陰性對照組。應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，確定影響啟動子活性變化的片段區(qū)域，設(shè)定顯著性水平為P=0.05，極顯著水平為P=0.01。

2　結(jié)果與分析

2.1不同物種MYOZ1氨基酸序列的比對

牛和綿羊的MYOZ1包含306個氨基酸，山羊、人、小鼠、豬分別包含302，299，296和298個氨基酸。用SECentral軟件比對上述物種間MYOZ1基因編碼的氨基酸序列，結(jié)果顯示，牛MYOZ1基因編碼的氨基酸序列與山羊、綿羊的相似性都高達(dá)96%，與豬的相似性為91%，與人的相似性為89%，與小鼠的相似性為85%。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果(圖1)表明，牛與山羊、綿羊的親緣關(guān)系較近，與豬、人、小鼠的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖 1不同物種MYOZ1蛋白氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

Fig.1Amino acid phylogram tree of MYOZ1 in different species

2.2牛MYOZ1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的確定

以秦川肉牛肌肉組織5′ RACE cDNA為模板，用5′ RACE準(zhǔn)備特異引物MYOZ1-GSP1與通用引物UPM進(jìn)行第1輪5′ RACE降落PCR擴(kuò)增，通過1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果(圖2)顯示條帶并不單一。將第1輪PCR產(chǎn)物用ddH2O稀釋20倍后作模板，用引物MYOZ1-GSP2與通用引物UPM進(jìn)行第2輪5′ RACE PCR擴(kuò)增，結(jié)果獲得一條長度約250 bp的DNA片段(圖2)。將目的片段MYOZ1連接PMD19-T(simple)載體，測序證實(shí)目的片段實(shí)際大小為274 bp;經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)，牛MYOZ1基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為堿基C(圖3)。

圖 2牛MYOZ1基因5′ RACE的擴(kuò)增

M.DL2000 DNA Marker；1.5′ RACE第1輪PCR產(chǎn)物；

2.5′ RACE第2輪PCR產(chǎn)物

Fig.2Amplification of 5′ RACE for bovineMYOZ1 gene

M.DL2000 DNA Marker;1.The first 5′ RACE PCR result;

2.The second 5′ RACE PCR result

圖 3牛MYOZ1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)

下劃線表示5′ RACE試驗(yàn)確定的牛MYOZ1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；大寫字母代表外顯子;小寫字母代表啟動子和內(nèi)含子；方框表示翻譯起始位點(diǎn)

Fig.3Identification of bovineMYOZ1 transcription initiation sites by 5′ RACE Letters underline indicate transcription start site of cattleMYOZ1 gene by 5′ RACE.

Capital letters stand for exons.Lowercase letters stand for introns and promoter.Letters in box present translation initiation site

2.3牛MYOZ1基因啟動子及其逐段缺失片段的PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增牛MYOZ1基因5′側(cè)翼區(qū)-1 628/+61片段，結(jié)果(圖4)獲得了長度為1 689 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果一致，測序結(jié)果證實(shí)克隆得到了目的片段(圖5)。

以牛MYOZ1基因5′側(cè)翼區(qū)-1 628/+61片段為基礎(chǔ)，用逐段缺失5′調(diào)控區(qū)引物分別進(jìn)行PCR亞克隆，結(jié)果得到177，498，737，993，1 240，1 491和 1 689 bp共7個逐段缺失的5′調(diào)控區(qū)片段(圖6)，測序結(jié)果證實(shí)得到了-116/+61，-437/+61，-676/+61，-932/+61，-1 179/+61，-1 430/+61，-1 628/+61共7個亞克隆片段。

圖 4牛MYOZ1基因5′側(cè)翼區(qū)PCR擴(kuò)增

M.DL2000 DNA Marker；1.5′側(cè)翼區(qū)-1 628/+61片段

Fig.4PCR result of 5′ flank region in bovineMYOZ1

M.DL2000 DNA Marker;1.5′ flank area

圖 5牛MYOZ1基因5′側(cè)翼區(qū)-1 628/+61序列

下劃線表示設(shè)計(jì)的逐段缺失引物的結(jié)合位點(diǎn)，大寫字母表示5′ UTR區(qū)堿基序列

Fig.5Sequence of bovineMYOZ1 promoter

Letters underline present the sub-clones primer binding sites.Capital letters present 5′ UTR region sequence

圖 67個牛MYOZ1基因啟動子逐段缺失片段的PCR擴(kuò)增

M.DL2000 DNA Marker；1～7.牛MYOZ1基因啟動子

逐段缺失片段，分別為 -116/+61，-437/+61，-676/+61，932/+61，-1 179/+61，-1 430/+61，-1 628/+61

Fig.67 sub-clones of bovineMYOZ1 promoter

M.DL2000 DNA Marker;1-7.The 7 sub-clones of bovine

MYOZ1 promoter are -116/+61，-437/+61，-676/+61，-932/+61，-1 179/+61，-1 430/+61，and -1 628/+61,respectively

2.4MYOZ1雙熒光素酶報(bào)告基因載體的鑒定

將7個牛MYOZ1基因啟動子逐段缺失片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接pGL3-Basic載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，按照擴(kuò)增片段在牛MYOZ1基因中的位置, 將重組質(zhì)粒分別命名為pMYOZ1-1 628/+61、pMYOZ1-1 430/+61、pMYOZ1-1 179/+61、pMYOZ1-932/+61、pMYOZ1-676/+61、pMYOZ1-437/+61和pMYOZ1-116/+61，其經(jīng)Hind Ⅲ和BglⅡ雙酶切分別得到1 689，1 491，1 240，993，737，498和177 bp片段(圖7)。測序結(jié)果證實(shí)，牛MYOZ1基因啟動子雙熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建成功。

圖 7牛MYOZ1雙熒光素酶報(bào)告基因載體的

HindⅢ和BglⅡ雙酶切鑒定

M.DL2000 DNA Marker；P.pGL3-Basic雙酶切對照；1～7.分別為

重組質(zhì)粒pMYOZ1-1 628/+61、pMYOZ1-1 430/+61、pMYOZ1-1 179/+61、pMYOZ1-932/+61、pMYOZ1-676/+61、pMYOZ1-437/+61、pMYOZ1-116/+61的雙酶切鑒定結(jié)果

Fig.7Hind Ⅲ andBglⅡ enzyme identification of dual-luciferase reporter gene vectors

M.DL2000 DNA Marker;P.pGL3-Basic digested byHindⅢ and

BglⅡ;1-7.The recombinant plasmid pMYOZ1-1 628/+61,pMYOZ1-1 430/+61,pMYOZ1-1 179/+61,pMYOZ1-932/+61,pMYOZ1-676/+61,pMYOZ1-437/+61,pMYOZ1-116/+61 digested byHindⅢ andBglⅡ

2.5牛MYOZ1啟動子的活性分析

牛MYOZ1基因7個逐段缺失片段重組質(zhì)粒pMYOZ1-1 628/+61、pMYOZ1-1 430/+61、pMYOZ1-1 179/+61、pMYOZ1-932/+61、pMYOZ1-676/+61、pMYOZ1-437/+61和pMYOZ1-116/+61啟動子活性測定結(jié)果見圖8。圖8顯示，7個重組質(zhì)粒的啟動子活性均極顯著高于pGL3-Basic陰性對照(P<0.01)，均極顯著低于pGL3-Control陽性對照(熒光素酶相對活性極高，圖8中未顯示)。重組質(zhì)粒pMYOZ1-116/+61的啟動子活性極顯著高于pGL3-Basic陰性對照(P<0.01)，說明該片段上游序列的缺失并沒有引起啟動子活性的顯著變化，推測牛MYOZ1基因-116/+61區(qū)域很可能包含核心啟動子。重組質(zhì)粒pMYOZ1-1 628/+61啟動子活性極顯著高于pMYOZ1-1 430/+61 片段活性(P<0.01)，表明牛MYOZ1基因啟動子區(qū)域-1 628/-1 430片段可能包含啟動子活性增強(qiáng)元件。

圖 8牛MYOZ1 5′調(diào)控序列缺失片段在C2C12細(xì)胞中的啟動子活性

圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

Fig.8Promoter activities of bovineMYOZ1 5′ deleted regulatory regions in C2C12 cells

Different lowercase letters mean significant difference (P<0.05) and different uppercase letters mean extremely significant difference (P<0.01)

2.6牛MYOZ1基因啟動子序列的生物信息學(xué)分析

經(jīng)Genomatix、TFSEARCH軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，牛MYOZ1基因啟動子區(qū)-116/+61片段可能包含SP1、GC Box、CAAT等多個重要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(圖9)；牛MYOZ1基因啟動子區(qū)-1 628/-1 430片段可能包含SRF、MyoD等多個重要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(圖10)。

3　討　論

通過SECentral軟件比對不同物種間MYOZ1基因編碼的氨基酸序列，結(jié)果顯示，牛MYOZ1基因編碼的氨基酸序列與山羊、綿羊的相似性為96%，與豬、人和小鼠的相似性相對較低。通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出，牛與山羊和綿羊的親緣關(guān)系較近，與人、豬和小鼠的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。筆者推測，MYOZ1基因可能在反芻動物中相對保守，與單胃動物差異較大。

圖 9牛MYOZ1基因啟動子區(qū)-116/+61片段轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測

下劃線表示引物結(jié)合位點(diǎn)，斜體字母表示GC Box區(qū)，陰影區(qū)域表示CAAT區(qū)，方框表示轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；下圖同

Fig.9Prediction of transcription factor binding sites in the -116/+61 region of bovineMYOZ1 gene promoter

Letters underline present primer binding sites.Italicized letters present GC Box.Letters in grey areas present CAAT district.Letters in box present transcription factor binding sites.The same below

圖 10牛MYOZ1基因啟動子區(qū)-1 628/-1 430片段轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測

Fig.10Prediction of transcription factor binding sites in the -1 628/-1 430 region of bovineMYOZ1 gene promoter

本研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的7個報(bào)告基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組較pGL3-Basic轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著提高，且差異極顯著(P<0.01)，說明克隆得到的各片段均包含轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。其中，牛MYOZ1基因片段-116/+61的啟動子活性是pGL3-Basic的42倍，說明牛MYOZ1基因啟動子區(qū)-116/+61可能包含某些重要的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，牛MYOZ1基因啟動子區(qū)片段-116/+61可能包含SP1、GC Box、CAAT等多個重要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),其中SP1具有多種生理活性[11-17]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，pMYOZ1-1 628/+61的熒光素酶活性與pMYOZ1-1 430/+61相比極顯著提高(P<0.01)，表明牛MYOZ1基因片段-1 628/-1 430可能包含啟動子活性增強(qiáng)元件。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該片段可能包含SRF、MyoD等多個重要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中MyoD具有多種生理活性[18-20]。

本研究顯示，牛MYOZ1基因片段-116/+61的啟動子活性是pGL3-Basic的42倍。而尚楊楊[9]研究表明,豬MYOZ1基因缺失片段活性與pGL3-Basic相差不大。除活性外，由于不同物種間基因保守性的不同，MYOZ1基因的核心啟動子區(qū)域可能也存在差異。如王恒[10]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠MYOZ1基因-561/-185片段為核心啟動子區(qū)域，用TESS預(yù)測，在MYOZ1基因啟動子區(qū)域-561/-185存在有NF-κB因子的結(jié)合位點(diǎn)。而本研究結(jié)果表明，MYOZ1基因核心啟動子區(qū)域-116/+61可能包含SP1、GC Box、CAAT等多個重要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。據(jù)此，筆者推測牛MYOZ1啟動子的活性很可能受轉(zhuǎn)錄因子SP1的調(diào)節(jié)。為了探究本試驗(yàn)所預(yù)測到的秦川牛MYOZ1基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子對MYOZ1及其下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，還需要通過定點(diǎn)突變、EMSA、ChIP等試驗(yàn)進(jìn)行深入研究。

本研究初步確定了與牛MYOZ1轉(zhuǎn)錄相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子可能位于-116/+61之間。此結(jié)果有助于進(jìn)一步分析并確定發(fā)揮重要作用的順式作用元件及其所在位置，為牛MYOZ1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

[1]劉居鵬,單安山,彭濟(jì)昌.豬肌纖維發(fā)育及其與肉質(zhì)的關(guān)系 [J].中國飼料,2006,4(16):11-14.

Liu J P,Shan A S,Peng J C.Development of pig muscle fiber and the relationship with the meat quality [J].China Feed,2006,4(16):11-14.

[2]陳代文,張克英,胡祖禹. 豬肉品質(zhì)特征的形成原理 [J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,15(1):60-66.

Chen D W,Zhang K Y,Hu Z Y.The forming principle of pork quality traits [J].Journal of Sichuan Agricultural University,2002,15(1):60-66.

[3]Frey N,Frank D,Lippl S,et al.Calsarcin-2 deficiency increases exercise capacity in mice through calcineurin/NFAT activation [J].J Clin Invest,2008,118(11):3598-3608.

[4]von Nandelstadh P,Ismail M,Gardin C,et al.A class Ⅲ PDZ binding motif in the myotilin and FATZ families binds enigma family proteins:a common link for Z-disc myopathies [J].Mol Cell Biol,2009,29(3):822-834.

[5]Luther P K.The vertebrate muscle Z-disc:sarcomere anchor for structure and signalling [J].J Muscle Res Cell Motil,2009,30(5/6):171-185.

[6]Frey N,Frank D,Lippl S,et al.Calsarcin-2 deficiency increases exercise capacity in mice through calcineurin/NFAT activation [J].J Clin Invest,2008,118(11):3598-3608.

[7]Xu L,Zhao F,Ren H,et al.Co-expression analysis of fetal weight-related genes in ovine skeletal muscle during mid and late fetal development stages [J].Int J Biol Sci,2014,10(9):1039-1050.

[8]Ma J,Chai J,Shang Y,et al.Swine PPAR-gamma2 expression upregulated in skeletal muscle of transgenic mice via the swine Myozenin-1 gene promoter [J].Transgenic Res,2014,24(3):409-420.

[9]尚楊楊.豬骨骼肌特異性表達(dá)基因myoz1/tnnc2啟動子的克隆及功能驗(yàn)證 [D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

Shang Y Y.Cloning and function analysis of porcine skeletal muscle-specific gene myoz1/tnnc2 promoter [D].Wuhan:Huazhong Agricultural University,2013.

[10]王恒.肌肉中calsarcin基因的差異表達(dá)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究 [D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

Wang H.Characterization and transcriptional regulation analysis of calsarcin gene in muscle [D].Wuhan:Huazhong Agricultural University,2006.

[11]Bessereau J L,Mendelzon D,Lepoupon C,et al.Muscle-specific expression of the acetylcholine receptor alpha-subunit gene requires both positive and negative interactions between myogenic factors,Sp1 and GBF factors [J].EMBO J,1993,12(2):443-449.

[12]Sartorelli V,Webster K A,Kedes L.Muscle-specific expression of the cardiac alpha-actin gene requires MyoD1,CArG-box binding factor,and Sp1 [J].Genes Dev,1990,4(10):1811-1822.

[13]Lin H,Yutzey K E,Konieczny S F.Muscle-specific expression of the troponin Ⅰ gene requires interactions between helix-loop-helix muscle regulatory factors and ubiquitous transcription factors [J].Mol Cell Biol,1991,11(1):267-280.

[14]Zhang L,Jin M,Margariti A,et al.Sp1-dependent activation of HDAC7 is required for platelet-derived growth factor-BB-induced smooth muscle cell differentiation from stem cells [J].J Biol Chem,2010,285(49):38463-38472.

[15]Sorianello E,Soriano F X,Fernandez-Pascual S,et al.The pr-omoter activity of human Mfn2 depends on Sp1 in vascular smooth muscle cells [J].Cardiovasc Res,2012,94(1):38-47.

[16]Yuan J,Tang Z,Yang S,et al.CRABP2 promotes myoblast di-fferentiation and is modulated by the transcription factors MyoD and Sp1 in C2C12 cells [J].PLoS One,2013,8(1):e55479.

[17]Parakati R,Dimario J X.Repression of myoblast proliferation and fibroblast growth factor receptor 1 promoter activity by KLF10 protein [J].J Biol Chem,2013,288(19):13876-13884.

[18]Weintraub H,Tapscott S J,Davis R L,et al.Activation of mu-scle-specific genes in pigment,nerve,fat,liver,and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD [J].Proc Natl Acad Sci USA,1989,86(14):5434-5438.

[19]Kocaefe Y C,Israeli D,Ozguc M,et al.Myogenic program induction in mature fat tissue (with MyoD expression) [J].Exp Cell Res,2005,308(2):300-308.

[20]Zhang X,Chai J,Azhar G,et al.Early postnatal cardiac changes and premature death in transgenic mice overexpressing a mutant form of serum response factor [J].J Biol Chem,2001,276(43):40033-40040.

Activity of bovineMYOZ1 gene promoter

WANG Mingming1,LI Anning1,ZHAO Zhidong1,ZHANG Yaran1,DUAN Meiyan1,WANG Yaning1,LI Shijun1,ZAN Linsen1,2

(1CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2NationalBeefCattleImprovementCenterinChina,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 The research determined the transcription initiation site and core promoter region of bovineMYOZ1 gene by detecting the activities ofMYOZ1 promoter constructs in C2C12 cell lines to lay foundation for further research on transcriptional regulation of bovineMYOZ1 gene.【Method】 The 5′ Rapid amplification of cDNA ends (5′ RACE) was used to determine the transcription initiation site ofMYOZ1 gene,and the 5′ flanking region (-1 628/+61) of bovineMYOZ1 gene was obtained by PCR.By bioinformatics prediction of transcription factor binding sites of bovineMYOZ1 gene promoter,7 sub-clones were amplified by PCR before being inserted into pGL3-Basic vectors.The recombinant plasmids were transfected into the C2C12 cells,and the relative transcriptional activities were measured using Dual-Luciferase Reporter Assay System. 【Result】 The translational start site was determined,and seven recombinant plasmids were constructed successfully by restriction enzyme digestion and sequence analysis including pMYOZ1-1 628/+61,pMYOZ1-1 430/+61,pMYOZ1-1 179/+61,pMYOZ1-932/+61,pMYOZ1-676/+61,pMYOZ1-437/+61,and pMYOZ1-116/+61.Luciferase activity assay indicated that luciferase reporter plasmid pMYOZ1-116/+61 had significantly higher luciferase activity than negative control pGL3-Basic,indicating that it may contain core promoter region of bovineMYOZ1 gene.Luciferase activity of pMYOZ1-1 628/+61 was significantly higher than its downstream plasmid pMYOZ1-1 430/+61 (P<0.01),indicating that the -1 628/-1 430 region upstream ofMYOZ1 gene promoter might contain transcriptional enhancer factors. Bioinformatics analysis found that pMYOZ1-116/+61 might contain transcriptional combining sites such as SP1,GC Box and CAAT,and pMYOZ1-1 628/-1 430 might contain SP1 and MyoD.【Conclusion】 The luciferase report gene vectors of bovineMYOZ1 gene promoter were successfully constructed and the core promoter of bovineMYOZ1 gene was determined within -116/+61 region.

bovine;MYOZ1 gene;5′ RACE;promoter;dual-luciferase reporter

時間:2016-08-0909:40DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.09.001

2015-02-11

“十二五”國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2013AA102505，2011AA100307-02)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-38)；“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD28B04-03)

王明明(1989-)，男，山東魚臺人，在讀碩士，主要從事肉牛基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究。E-mail：785336874@qq.com

昝林森(1963-)，男，陜西扶風(fēng)人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事肉牛奶牛遺傳改良與健康養(yǎng)殖研究。

E-mail：zanlinsen@163.com

S823

A

1671-9387(2016)09-0001-09

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