曹　丹，張愛梅，韓雪英，伏笑融

（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅　蘭州　730070）

鮮橘皮霉變部位主要微生物的檢測研究

曹丹，張愛梅*，韓雪英，伏笑融

（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

以新鮮橘子為材料，探究鮮橘皮霉變部位存在的主要微生物類型。通過形態(tài)學(xué)鑒定和生理生化檢驗等試驗方法，初步判定鮮橘皮霉變部位存在的主要優(yōu)勢微生物包括3種細菌和3種霉菌。3種細菌分別是：枯草芽孢桿菌，短小芽孢桿菌和環(huán)狀芽孢桿菌；3種霉菌分別是：橘青霉、煙曲霉和炭黑曲霉。

鮮橘皮；細菌；真菌；分離；鑒定

橘子，俗稱桔，是起源古老的多年生蕓香科植物，華夏大地是其主要發(fā)源地之一。在中國，很久以前人們就開始食用橘子，并對其進行了人工栽培［1］。橘子酸甜可口，營養(yǎng)豐富，渾身是寶，尤其是橘皮，作用甚多。

橘皮，又名陳皮，新鮮橘皮含有大量的維生素C和香油精，具有理氣化痰，健脾和胃的功能。利用橘子皮泡茶，味道清新還能通氣提神；鮮橘皮還可以用來治療咳嗽、便秘、睡覺磨牙、口臭、消化不良及胰腺炎等；另外，食品加工業(yè)利用鮮橘皮制橘皮粥、橘皮茶、橘皮酒、橘皮菜及橘皮果醬等，為其帶來不少經(jīng)濟效益［2-3］。

近年來，對鮮橘皮的研究主要側(cè)重于其藥用價值，生物活性及化學(xué)反應(yīng)等方面［4-6］，對鮮橘皮表面微生物的檢測較少，而本研究側(cè)重于鮮橘皮霉變部位主要優(yōu)勢微生物的分離純化和鑒定。通過形態(tài)學(xué)鑒定和生化鑒定相結(jié)合的手段，對鮮橘皮霉變部位與正常部位的微生物進行比較，找出鮮橘皮霉變部位存在的主要優(yōu)勢微生物，并對以后橘皮表面微生物的研究提供一定的參考和依據(jù)。

一、材料與方法

（一）材料

原料：試驗原料購自蘭州市安寧區(qū)果蔬市場，為市售的同一品種的新鮮橘子。

（二）試劑、儀器與用具

1.試劑。草酸銨結(jié)晶紫、蕃紅、碘液、95%乙醇、香柏油、二甲苯、孔雀綠、甲基紅試劑、溴百里酚藍、格里斯氏試劑、二苯胺試劑、吲哚試劑、對二甲基氨基苯甲醛、檸檬酸鐵、檸檬酸鈉、a-萘酚、氫氧化鉀、乙醇、乙醚、二甲基氨基苯甲醛、1 mol/L鹽酸、1 mol/LNaOH、過氧化氫等。

2.儀器。恒溫水浴鍋（KW-4）：上海必爾得儀器實業(yè)有限公司；智能型電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9080B）：上?，槴t實驗設(shè)備有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌鍋（DSX-280B）：上海申安醫(yī)療器械廠；封閉式調(diào)溫加熱器（MB-1-1）：北京科偉永興儀器有限公司；超凈工作臺（DZ47LE-32 C32）：天津市拉貝爾實驗室設(shè)備有限公司；顯微成像系統(tǒng)（YYP一210）：日本NIKON公司；電子天平CP114（GB/T26497）：奧豪斯儀器（上海）有限公司制造；冰箱（BC-92）：廣東奧馬電器股份有限公司。

3.用具。刀片，接種環(huán)，載玻片，鑷子，濾紙，牙簽，酒精燈，玻璃棒，移液槍等。

（三）培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：用于細菌分離；察氏培養(yǎng)基：用于霉菌分離；生化鑒定采用休和利夫森二氏培養(yǎng)基、V_P實驗培養(yǎng)基、硝酸鹽還原實驗培養(yǎng)基、丙酸鹽培養(yǎng)基、檸檬酸鹽實驗培養(yǎng)基、吲哚實驗培養(yǎng)基、葡萄糖氧化發(fā)酵培養(yǎng)基、明膠水解培養(yǎng)基、淀粉水解培養(yǎng)基等，按照《微生物學(xué)實驗手冊》［7］和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［8］配置。

（四）試驗方法

1.鮮橘的處理。從市售鮮橘中挑選表面含有小霉點的橘子作為試驗材料，將其置于恒溫培養(yǎng)箱中，28℃的條件下放置36 h，待橘子表面霉變部位長大，呈現(xiàn)青灰色時即可進行后續(xù)步驟。

2.微生物的初步分離。無菌條件下，用滅菌剪刀在鮮橘皮霉變部位剪出1.5 cm×1.5 cm大小的面積，將剪下的橘皮用滅菌鑷子夾至盛有50 mL無菌水的三角瓶中，封好瓶口并不斷搖勻震蕩，充分震蕩20 min后，在三角瓶中取勻液1 mL，稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4的4個濃度梯度，用移液槍吸取1 mL稀釋液到培養(yǎng)皿中，每一個稀釋度上做出2組平行，及時將45℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基傾倒在平皿中，平板凝固后進行培養(yǎng)，28℃條件下培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長狀況。在鮮橘皮正常部位采用同樣的方法進行微生物的初步分離［9-10］。對正常部位與霉變部位微生物的生長狀況進行對比。

3.微生物的純化。培養(yǎng)48 h后，對于細菌：挑取形態(tài)不同的菌落于新的培養(yǎng)基中進行平板劃線，當(dāng)所生長的菌落大小、形態(tài)特征一致時，進行顯微鏡觀察和革蘭氏染色實驗，確定微生物是否純化。若未純化，則繼續(xù)挑取菌落，進行平板劃線直至純化。對于霉菌，用接種針挑取菌落邊緣的菌絲，點種于培養(yǎng)基上并且記錄菌落形態(tài)。若第一次純化后培養(yǎng)物不純，則進行第二次接種，直至菌落純化好為止。

4.微生物的觀察與鑒定

細菌：參考《微生物學(xué)實驗手冊》［7］《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［8］、《伯杰細菌鑒定手冊》［11］采取菌落觀察、革蘭氏染色、芽孢染色等方法初步鑒定；再通過接觸酶、氧化酶、葡萄糖、糖醇發(fā)酵實驗、V_P實驗、吲哚實驗、明膠水解、淀粉水解、檸檬酸鹽實驗、丙酸鹽實驗、硝酸鹽還原、耐熱性等進行生化鑒定。

霉菌：參考《微生物學(xué)實驗手冊》［7］《真菌的形態(tài)和分類》［12］首先進行形態(tài)觀察和描述，其次用棉藍染色鏡檢：在顯微鏡下觀察霉菌的菌絲或孢子的形態(tài)和特征，孢子的排列等，并記錄拍照。根據(jù)菌溶形態(tài)及鏡檢結(jié)果，確定菌種類型。

二、結(jié)果和分析

（一）鮮橘皮霉變部位與正常部位微生物生長狀況比較

將霉變部位與正常部位分離到的微生物分別接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，待微生物生長出來后，比較其生長狀況，結(jié)果如表1所示。

表1　霉變部位與正常部位微生物生長狀況

觀察并比較牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基上的微生物生長狀況發(fā)現(xiàn)：鮮橘皮霉變部位存在較多細菌和真菌，而正常部位幾乎沒有真菌，細菌較少。

（二）鮮橘皮霉變部位典型細菌的鑒定

觀察細菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的生長狀況可發(fā)現(xiàn)，有些細菌大量存在于鮮橘皮霉變部位，而在橘皮正常部位幾乎沒有或很少。選取這些大量出現(xiàn)在霉變部位的典型細菌進行培養(yǎng)。通過觀察，挑選出9株不同形態(tài)的菌株，反復(fù)劃線分離，進行純培養(yǎng)，并標(biāo)記為：A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3。據(jù)初步鑒定，9株菌株可分為3類，A1、B2、C3為一類，記作NO1；A2、B1、C2為一類，記作NO2；A3、B3、C1為一類，記作NO3。NO1代表：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），NO2代表：短小芽孢桿菌（Bacilluspumilus），NO3代表：環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillusbacillus）其菌落形態(tài)，革蘭氏染色特征分別見圖1和圖2。

圖1 細菌菌落形態(tài)

圖2 革蘭氏染色結(jié)果

由圖1可知，NO1菌落形態(tài)呈圓形，0.7～0.8 μm×2.0～3.0 μm，邊緣齒狀，表面隆起黏稠，乳白色，不透明；NO2存在半透明型和不透明型兩種不同的菌落形態(tài)，圖中所示為不透明菌落，經(jīng)過三次純化后半透明型菌落逐漸消失。NO2菌落形狀不規(guī)則，0.6～0.7 μm×2.0～3.0 μm，邊緣不整齊，表面粗糙，乳白色，不透明。NO3菌落呈圓形，1.0～1.5 μm×2.0～7.0 μm，邊緣整齊，表面無皺褶，隆起，乳白色，不透明。

圖2是在40×的顯微鏡下觀察到的。由圖2可知，菌株均是革蘭氏陽性菌，NO1呈桿狀，鏈狀，產(chǎn)芽孢，中生或偏端生，橢圓或柱形，孢囊不膨大；NO2呈桿狀，鏈狀，產(chǎn)芽孢，偏端生，橢圓形或柱形，孢囊不顯著膨大；NO3呈桿狀，鏈狀，產(chǎn)芽孢，中生或極生，孢囊稍膨大。

由圖1與圖2的結(jié)論初步進行判斷：NO1、NO2、NO3都屬于芽孢桿菌屬。為進一步進行菌種鑒定，做細菌的生理生化檢驗，結(jié)果如表2所示：

表2　生理生化鑒定結(jié)果

菌株NO1能利用D-葡萄糖、D-甘露醇、麥芽糖等。吲哚實驗為陰性，接觸酶試驗、硝酸鹽還原實驗、檸檬酸鹽實驗、淀粉水解及明膠水解均為陽性，V-P測定為陽性，丙酸鹽利用為陰性，5℃、55℃條件下不生長，在7%、10%的高鹽環(huán)境中生長良好，因此可以判斷：以菌株NO1為代表的一類細菌為枯草芽孢桿菌。

菌株NO2能利用D-葡萄糖、D-甘露醇、麥芽糖等，但不能利用乳糖。接觸酶試驗、檸檬酸鹽實驗、明膠水解均為陽性，硝酸鹽還原實驗、淀粉水解及丙酸鹽利用為陰性，V-P測定為陽性，5℃、55℃條件下不能生長，在7%鹽環(huán)境中生長良好，因此可以判斷：以菌株NO2為代表的一類細菌為短小芽孢桿菌。

菌株NO3能利用D-葡萄糖、D-甘露醇、麥芽糖等，但不能利用乳糖。接觸酶試驗、硝酸鹽還原實驗、檸檬酸鹽實驗、明膠水解、淀粉水解均為陽性，V-P測定為陰性，5℃、55℃條件下不能生長，在7%鹽環(huán)境中生長良好，10%鹽環(huán)境中不能生長，因此可以判斷：以菌株NO2為代表的一類細菌為環(huán)狀芽孢桿菌。

（三）鮮橘皮霉變部位幾種主要真菌的鑒定

對鮮橘皮霉變部位分離到的真菌進行純化培養(yǎng)，觀察真菌在察氏培養(yǎng)基上的生長狀況，發(fā)現(xiàn)主要有3類真菌大量出現(xiàn)，對它們依次標(biāo)號為：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。其菌落形態(tài)特征如圖3所示，與菌落相應(yīng)的顯微形態(tài)特征如圖4所示。

圖3 真菌菌落形態(tài)圖

圖4 真菌顯微形態(tài)圖（40×）

通過觀察可以初步判斷：真菌Ⅰ菌絲淡色，有橫隔，分生孢子梗頂端有掃帚狀分支，分支為多極的分生孢子梗，分生孢子呈球形，屬于青霉屬。真菌Ⅱ、Ⅲ匍匐于基質(zhì)上的菌絲向空中伸出球形或橢圓形頂囊的分生孢子梗，在其頂端的小?；蜻M一步分枝的次級小梗上生出鏈狀的分生孢子，屬于曲霉屬。

真菌在培養(yǎng)基上繼續(xù)生長，由幼態(tài)逐漸走向成熟，觀察它們的變化趨勢并對其進行進一步判斷。

真菌Ⅰ菌落具有放射狀皺紋，有同心環(huán)，質(zhì)地通常絨狀；反面為橙黃色，可溶性色素為黃色；菌絲體白色，有大量淡黃色滲出液，分生孢子梗生于基質(zhì)；帚狀枝雙輪生，或三輪生，同輪中長短不一，分生孢子呈球形或近球形；總體來看，該菌株很可能為：青霉屬中的橘青霉。

真菌Ⅱ菌落在培養(yǎng)基上生長迅速，中心稍凸，質(zhì)地絲絨狀兼有少量絮狀；分生孢子結(jié)構(gòu)較少，淺灰綠色，老后顏色加深，反面黃褐色；滲出液無色；分生孢子頭呈短柱狀；分生孢子梗生于基質(zhì)；頂囊燒瓶形，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)單層；分生孢子近球形，壁粗糙。該菌株應(yīng)該為：曲霉屬中的煙曲霉群。

真菌Ⅲ菌落在培養(yǎng)基上生長迅速，菌落平坦，質(zhì)地絲絨狀；分生孢子結(jié)構(gòu)大量，孢子頭黑色，反面淡黃色且中部呈現(xiàn)黑褐色；無滲出液；分生孢子頭幼時球形，老后分裂成柱狀結(jié)構(gòu)；分生孢子梗生于基質(zhì)；頂囊球形，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層；分生孢子球形，壁粗糙。該菌株應(yīng)該為：曲霉屬中的炭黑曲霉。

三、結(jié)論

本試驗對鮮橘皮表面的微生物進行分離純化，比較鮮橘皮霉變部位和正常部位微生物的生長狀況，通過形態(tài)學(xué)鑒定和生理生化檢驗相結(jié)合的方式，發(fā)現(xiàn)了存在于鮮橘皮霉變部位的幾種主要的優(yōu)勢微生物。其中有9株典型的細菌最終鑒定為3類：以NO1為代表的枯草芽孢桿菌，以NO2為代表的短小芽孢桿菌，以NO3為代表的環(huán)狀芽孢桿菌；另外還檢測到了來自于青霉屬和曲霉屬的3種真菌，分別是：橘青霉、煙曲霉及炭黑曲霉。

本試驗的結(jié)論，對于鮮橘皮霉變部位微生物的檢測提供了一定的參考依據(jù)，如果對于霉變部位的優(yōu)勢微生物進行針對性的殺菌抑制，或許可以對鮮橘皮的霉變起到一定的阻礙作用。隨著社會的發(fā)展，消費者對健康的要求越來越高，因此，在橘皮食品加工方面很有必要考慮使用干凈無霉變的新鮮橘皮作為加工原料，滿足廣大消費者的需要，從而獲取更好的經(jīng)濟效益。

［1］傅維康.橘子史話［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2008，（11）：69-70.

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［9］中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/f4789.22010食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

［10］中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/r4789.152010食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗霉菌和酵母菌計數(shù)［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

［11］布坎南，吉本斯.伯杰細菌鑒定手冊［M］.北京：科學(xué)出版社，1984.

［12］戴芳瀾.真菌的形態(tài)和分類［M］.北京：科學(xué)出版社，1987.

（編輯：張瓊瓊）

S379.5

B

1673-9019（2016）17-0029-03

2016-05-26

曹丹（1994-），女，甘肅會寧人，主要從事微生物研究。

張愛梅（1973-），女，甘肅武威人，副教授，主要從事微生物生態(tài)學(xué)的研究。