趙菲佚 焦成瑾 陳 荃 賈 貞 王太術(shù) 周 輝

(天水師范學院生物工程與技術(shù)學院，天水 741000)

擬南芥AtJ3與PKS5相互作用參與植物ABA響應

趙菲佚 焦成瑾 陳 荃 賈 貞 王太術(shù) 周 輝

(天水師范學院生物工程與技術(shù)學院，天水 741000)

脫落酸(abscisic acid，ABA)在植物生長、發(fā)育及環(huán)境脅迫響應中有著廣泛的作用。前期研究已鑒定了諸多參與植物ABA信號轉(zhuǎn)導的元件。本研究以擬南芥(Arabidopsisthaliana)蛋白激酶PKS5(SOS2-like protein kinase 5)為誘餌蛋白，使用酵母雙雜交篩選到與PKS5相互作用的蛋白分子伴侶AtJ3(Arabidopsis thaliana DnaJ homolog 3)。AtJ3 T-DNA突變體atj3-1與atj3-2表現(xiàn)出萌發(fā)期ABA表型。在外源ABA處理下，atj3-1與atj3-2種子發(fā)芽率降彽、幼苗黃化、生長矮小。atj3-1與PKS5雙突變體atj3-1pks5-1、atj3-1pks5-3和atj3-1pks5-4表現(xiàn)出與AtJ3或PKS5突變體相同的ABA表型。亞細胞定位與轉(zhuǎn)基因研究顯示AtJ3與PKS5有相同的表達模式。免疫共沉淀與體外磷酸化測試確認AtJ3與PKS5存在相互作用并抑制PKS5激酶活性。研究結(jié)果表明：AtJ3與PKS5相互作用，通過抑制PKS5激酶活性共同參與植物ABA信號響應過程。

ABA響應；AtJ3；相互作用；磷酸化活性抑制；PKS5

植物激素脫落酸(abscisic acid，ABA)在植物的整個生活周期中起著關(guān)鍵性的作用。已有研究表明：ABA參與植物胚胎發(fā)育、種子成熟與休眠、根與莖的生長及葉面蒸騰[1～3]。此外，ABA還介導了植物對外界各種脅迫的響應，如干旱或滲透誘導的氣孔關(guān)閉及鹽、低氧、冷、傷害或病理等信號誘導的抗性[4]。對植物ABA響應信號途徑中作用元件的鑒定與作用機理解析已成為植物激素研究的重要內(nèi)容。

PKSes(SOS2-like protein kinases)蛋白激酶屬于擬南芥SnRK3(SNF1-related kinase3)家族[5～6]。該家族中，PKS12在調(diào)節(jié)ABA與冷信號中起作用[7]。在植物萌發(fā)和幼苗期，PKS18參與ABA響應。PKS18T/D(PKS18組成型表達形式)轉(zhuǎn)基因植物顯示出對ABA的超敏感性，而該激酶RNAi轉(zhuǎn)基因植物對ABA不敏感[8]。PKS3(SOS2-like protein kinase 3)與SCaBP5(SOS3-like calcium binding protein 5)存在相互作用。pks3或scabp5在種子萌發(fā)、幼苗生長和氣孔關(guān)閉上表現(xiàn)出對ABA的超敏感性[9]。PKS24不僅在PHYA(phytochrome A)介導的抑制擬南芥遠紅光黃化苗轉(zhuǎn)綠過程中起作用[10]，也在鹽及ABA的脅迫應答中具有功能[11]。

PKS5為PKS家族26個成員之一。PKS5通過磷酸化AHA2(質(zhì)膜ATPase的等位形式之一)第931位絲氨酸而阻止其與14-3-3蛋白相互作用，對AHA2活性進行負向調(diào)控，導致植物對外源高pH具有抗性[12]。近期發(fā)現(xiàn)，PKS5可與SCaBP8(SOS3-like calcium binding protein 8)相互作用，通過磷酸化AHA2參與植物對外界鹽堿的響應過程[13]。此外，PKS5可對植物抗病途徑中一個主要共激活子NPR1(Nonexpressor of Pathogenesis-Related gene 1)的磷酸化介異WRKY38(WRKY DNA-binding protein 38)與WRKY62(WRKY DNA-binding protein 62)的表達，參與植物抗病過程[14]。

植物存在由高溫、高鹽、滲透等脅迫因素誘導產(chǎn)生的含J結(jié)構(gòu)域的DnaJ蛋白[15～17]。大多數(shù)DnaJ蛋白在一級結(jié)構(gòu)上包含1個由70個氨基酸組成的J結(jié)構(gòu)域、相鄰G/F結(jié)構(gòu)域和末端鋅指(CxxCxGxG)結(jié)構(gòu)域[18～19]。在二級結(jié)構(gòu)上，J結(jié)構(gòu)域含有四個螺旋和一個位于第2和第3螺旋間的由His、Pro和Asp三肽組成的高度保守環(huán)形區(qū)[20]。J結(jié)構(gòu)域與熱激蛋白Hsp70(Heat shock protein 70)的結(jié)合可穩(wěn)定Hsp70與底物的相互作用[21]。DnaJ蛋白在進化上具有保守性。除了在細胞蛋白的翻譯、折疊、解折疊、移位及降解過程中作為蛋白分子伴侶起著重要作用外，還可直接結(jié)合于轉(zhuǎn)錄因子對轉(zhuǎn)錄激活進行調(diào)控。此外，DnaJ在核內(nèi)體形成和類胡蘿卜素積累中也具有功能[15～17]。擬南芥中存在89個含J結(jié)構(gòu)域的蛋白[22]，AtJ3分子伴侶為其中之一。擬南芥AtJ3介導開花信號的整合，對植物開化時間進行調(diào)控[23～24]。AtJ3也可作為正向調(diào)節(jié)子對質(zhì)膜上質(zhì)子泵活性進行調(diào)節(jié)，從而參與植物對外源鹽堿脅迫的響應[25]。已發(fā)現(xiàn)部分PKS家族成員參與植物ABA響應，PKS5及與其有相互作用的AtJ3是否也在ABA信號途徑中起作用目前未見報道。

本研究使用AtJ3與PKS5突變體，對兩者在外源ABA處理下的表型進行了考察，并對兩者在ABA響應中可能的作用機理進行了探討。研究結(jié)果為ABA信號途徑鑒定了新的參與元件，并為AtJ3與PKS5調(diào)控ABA信號機理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

擬南芥野生型(Col-0)、T-DNA突變體pks5-1(SALK_108074)、atj3-1(SALK_131923)和atj3-2(SALK_141625)訂購自SALK。pks5-3與pks5-4為TILLING點突變體(http://tilling.fhcrc.org:9366)，訂購自ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)。大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)及研究中所用質(zhì)粒載體均為本實驗室保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設(shè)計

本研究中除用于植物點突變鑒定引物外，其余引物使用Primer Premier 5.0軟件進行設(shè)計，在上海生物工程公司合成(表1)。

1.2.2 植物突變純合體鑒定

atj3-1、atj3-2與pks5-1突變純合體鑒定正向引物分別為A31TF、A32TF及P5TF,反向引物使用T-DNA左邊界引物Lba1與LBb1。pks5-3與pks5-4點突變純合體鑒定使用衍生型酶切擴增多態(tài)性序列(Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequence，dCAPS)分子標記技術(shù)。點突變鑒定引物使用dCAPS Finder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)設(shè)計。pks5-3使用P53CF與P53CR引物對，PCR擴增263 bp片段，AvaⅠ內(nèi)切酶切野生型擴增產(chǎn)物。pks5-4使用P54CF與P54CR引物對，PCR擴增236 bp片段，MluⅠ內(nèi)切酶切野生型。雙突變純合體atj3-1atj3-2、atj3-1pks5-1、atj3-1pks5-3、atj3-1pks5-4和pks5-3pks5-4分別使用各單突變純合體進行雜交，并經(jīng)PCR與測序鑒定獲得。

1.2.3 植物培養(yǎng)條件及ABA表型觀察

試驗種子用消毒液(20%次氯酸鈉+0.1% Triton X-100)在EP管中滅菌10 min，滅菌ddH2O洗5次后點種于MS或含0.3 μmol·L-1ABA的處理MS固體平板上。處理MS平板在4℃下春化2 d后置于16 h光(22℃)/8 h暗(20℃)光周期條件下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)一定時間(9或12 d)后，對平板上種子萌發(fā)率進行統(tǒng)計，并觀察幼苗ABA表型。

表1 引物序列

注：序列中下劃線為限制性酶作用位點堿基。

Note:The underlines in the primer sequences indicate the base pairs of the restriction endonucleases.

1.2.4 RNA分離及RT-PCR分析

擬南芥野生型(Col-0)；atj3-1、atj3-2、pks5-1突變體總RNA提取使用柱式植物總RNA抽提純化試劑盒(上海生物工程公司，SK8661)進行。提取總RNA使用Promega公司M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega，M1705)在42℃下進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA第一鏈。植物總RNA提取及cDNA第一鏈合成操作按各自試劑盒推薦方法進行。為確認atj3-1及atj3-2中AtJ3的表達，以Col-0、atj3-1、atj3-2、pks5-1的cDNA第一鏈為模板，使用AtJ3的CDS全長引物A3F與A3R進行RT-PCR，同時以ACTIN2為內(nèi)參，Act2F與Act2R為內(nèi)參引物，PCR為25個循環(huán)。

1.2.5AtJ3及PKS5點突變序列克隆與蛋白原核表達

PKS5序列克隆以野生型(Col-0)及pks5-3、pks5-4各點突變體基因組DNA為模板，以P5H與P5R為引物對，PCR擴增得到野生型及點突變PKS5編碼序列。BamHⅠ與EcoRⅠ酶切PCR擴增產(chǎn)物與pET28a(Novagen，69864-3)原核表達載體，膠回收純化后使用連接酶(NEB，M0202S)進行連接。AtJ3編碼序列使用引物A3F和A3R，以AtJ3 cDNA為模板。PCR擴增產(chǎn)物與pET28a使用BamHⅠ與SalⅠ酶切，膠回收純化后使用連接酶(NEB，M0202S)進行連接。構(gòu)建載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。陽性候選克隆送上海生物工程公司測序驗證。原核表達載體經(jīng)測序驗證后從DH5α提取質(zhì)粒以電擊轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入BL21(DE3)表達菌株，再次經(jīng)PCR篩選得到陽性克隆后保存?zhèn)溆谩?/p>

含目標蛋白表達載體的BL21(DE3)菌株按1∶1 000的比例接入含30 μg·L-1氯霉素和50 μg·L-1的卡那霉素的60 mL液體LB培養(yǎng)基中，并于37℃過夜小量培養(yǎng)。次日將10 mL過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入1 L含50 μg·mL-1Kan的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，當菌液OD600達0.7時收菌，離心后沉淀加入30 mL裂解液(50 mmol·L-1NaH2PO4，300 mmol·L-1NaCl,10 mmol·L-1imidazole,pH 8.0)重懸，在超聲破碎儀(VCX130,SONICS)上破碎(250 W,超聲3 s,間隔3 s,1 min循環(huán),共5 min)后離心，上清液中加入100 μL Ni-NTA樹脂(Qiagen，No.30210)進行蛋白結(jié)合，最后使用洗脫緩沖液(50 mmol·L-1NaH2PO4，300 mmol·L-1NaCl,250 mmol·L-1imidazole,pH 8.0)洗脫得到目標蛋白。后續(xù)融合蛋白純化方法按Qiagen公司的樹脂提取方法進行。結(jié)合于樹脂上的重組蛋白保存于4℃冰箱中備用。

1.2.6 PKS5點突變重組蛋白體外激酶活性測試

激酶體外磷酸化試驗按照以下方法進行。冰浴EP管中混合激酶與底物蛋白MBP(Myelin Basic Protein)，反應體積為20 μL，計算激酶反應緩沖液(20 mmol·L-1Tris-HCl,pH7.2， 5 mmol·L-1MgCl2,0.5 mmol·L-1CaCl2,10 μmol·L-1ATP,2 mmol·L-1DTT)的用量，每個反應使用2 μCi(γ-32P)ATP。將反應所需體積的重組蛋白加入激酶反應緩沖液中，30℃水浴中反應30 min后加入6×SDS蛋白上樣緩沖液，并在干浴器(SBH130D/3,Stuart)上95℃加熱5 min。離心后于12%的SDS蛋白膠上進行變性電泳，考馬斯亮藍染色后在脫色液中脫色，凝膠成像儀上(GelDoc-It2 310，UVP)照相后使用保鮮膜包好蛋白凝膠，壓于磷屏上，次日于磷屏成像儀(STORM 860，Amersham Biosciences)上進行成像。

1.2.7AtJ3與PKS5熒光融合蛋白在原生質(zhì)體與轉(zhuǎn)基因植物中的亞細胞定位觀察

使用引物AGF與AGR，以野生型(Col-0)cDNA為模板進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物克隆至pCAMBIA1205-GFP植物轉(zhuǎn)化載體上，構(gòu)建植物GFP-AtJ3綠色熒光融合蛋白表達載體。使用引物PYF與PYR，以野生型(Col-0)基因組為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物克隆至pTA7002植物表達載體上，構(gòu)建植物PKS5-YFP黃色熒光融合蛋白表達載體。測序正確的植物熒光表達載體經(jīng)質(zhì)粒純化試劑盒Maxprep Kit(Vigorous Biotechnololgy)純化后，分別轉(zhuǎn)化擬南芥野生型(Col-0)原生質(zhì)體與植物中。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化使用Jen方法進行[26]。pCAMBIA1205-GFP-AtJ3轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體及生長5 d的T2代轉(zhuǎn)基因植物用于AtJ3亞細胞定位。PTA7002-PKS5-YFP轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體及生長5 d的T2代轉(zhuǎn)基因植物使用10 mmol·L-1DEX(dexamethasone)處理24 h后在confocal顯微鏡(Zeiss 510 META)下進行GFP-AtJ3與PKS5-YFP熒光觀察。

1.2.8 酵母轉(zhuǎn)化及雙雜交試驗

以P5YF和P5YR為引物對，擬南芥野生型(Col-0)基因組為模板，PCR擴增PKS5蛋白編碼序列并克隆至酵母載體pGBT9上作為誘餌蛋白，對定購自ABRC的50 μg酵母質(zhì)粒獵物庫進行篩選。為驗證AtJ3與PKS5相互作用，使用引物A3YF和A3YR；T1YF和T1YR；S1YF和S1YR，以擬南芥野生型(Col-0)cDNA為模板，分別擴增AtJ3、TTG1(TRANSPARENTTESTAGLABRA1)與SCaBP1(SOS3-likecalciumbindingprotein5)蛋白編碼序列并克隆至酵母表達載體pGAD10上。酵母表達載體以試驗組合共轉(zhuǎn)化至酵母菌株P(guān)J69-4A中。酶母轉(zhuǎn)化、篩庫操作與相互作用試驗按Clontech公司酵母操作手冊進行。

1.2.9蛋白原生質(zhì)體表達與免疫共沉淀(Coimmunoprecipitation,Co-IP)試驗

使用引物P5PF和P5PR；A3PF和A3PR；S1PF和S1PR，以擬南芥野生型(Col-0)基因組或cDNA為模板，PCR分別擴增PKS5、TTG1、AtJ3與SCaBP1蛋白編碼序列并克隆至pCAMBIA1307-3xFLAG植物轉(zhuǎn)化載體上與FLAG標簽N端轉(zhuǎn)譯融合。使用BamHⅠ與SalⅠ雙酶切從pET28a-PKS5或pET28a-AtJ3切下PKS5或AtJ3蛋白編碼序列，亞克隆至pCAMBIA1307-6xMyc植物轉(zhuǎn)化載體上與Myc標簽C端轉(zhuǎn)譯融合。構(gòu)建載體以不同組合轉(zhuǎn)化擬南芥野生型(Col-0)原生質(zhì)體中進行蛋白表達。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化使用Jen方法進行[26]。Co-IP按Quan的方法進行[27]。

2 結(jié)果與討論

2.1 AtJ3、PKS5基因與蛋白結(jié)構(gòu)及突變位置

AtJ3定位于擬南芥基因組第三條染色體上(At3g44110)，基因全長1.95 kB，包含6個外顯子和5個內(nèi)含子(圖1:A)，從SALK訂購得到AtJ3的兩個等位突變體，被命名為atj3-1(SALK_132923)和atj3-2(SALK_141625)，T-DNA分別插入第4與第6個外顯子上。AtJ3的CDS長度為1 263 bp，編碼含420個氨基酸的蛋白質(zhì)，預測大小為46.31 kD，蛋白含J(14-72)、G/F(82-107)、Zn(135-221)及C(234-358)4個結(jié)構(gòu)域(圖1:B)。

PKS5定位于擬南芥第二條染色體上(At2g30360)，其CDS共有1 308個堿基，不含內(nèi)含子。編碼蛋白含有435個氨基酸，為一絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。整個蛋白由位于N端的激酶結(jié)構(gòu)域和C端的激酶調(diào)控域[28]組成。激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有一個推測的激活環(huán)(KDAL)，調(diào)控結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有兩個子結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)ISL基序和PPI結(jié)構(gòu)域。FISL結(jié)構(gòu)域是PKS家族中保守的結(jié)構(gòu)域，是與SCaBP(SOS3-like calcium binding protein)相互作用所必須的結(jié)構(gòu)域[8]。在激酶結(jié)構(gòu)域和FISL基序之間由連接結(jié)構(gòu)域(JK)進行連接[29]。從SALK與ABRC獲得PKS5不同類型突變體。pks5-1為T-DNA插入突變體，pks5-3發(fā)生了c-t的轉(zhuǎn)換，蛋白第168位氨基酸由丙氨酸變?yōu)槔i氨酸(A168V)；pks5-3突變位于已知的激酶激活環(huán)內(nèi)，pks5-4發(fā)生了c-t的突變，第317位氨基酸由絲氨酸變?yōu)榱涟彼?S317L)；pks5-4的突變位于FISL基序內(nèi)(圖1:C)。

圖1 AtJ3、PKS5基因與蛋白結(jié)構(gòu) A. AtJ3基因結(jié)構(gòu)(方框表示外顯子；黑色棒表示內(nèi)含子；三角形指示AtJ3 T-DNA插入位置)；B. AtJ3蛋白結(jié)構(gòu)(方框表示不同結(jié)構(gòu)域；J. J結(jié)構(gòu)域；G/F. 結(jié)構(gòu)域；Zn. 鋅指結(jié)構(gòu)域；C. C末端結(jié)構(gòu)域；數(shù)字表示從轉(zhuǎn)譯起始點計各結(jié)構(gòu)域氨基酸位置)；C. PKS5蛋白結(jié)構(gòu)與突變位置(KDAL. 激酶催化結(jié)構(gòu)域激活環(huán)；JK. 連接區(qū)；FISL. FISL基序；PPI. 與PP2C蛋白磷酸酶作用結(jié)構(gòu)域；箭頭指示各點突變位置；三角形指示PKS5 T-DNA插入位置)Fig.1 Schematic diagrams of genes and proteins of AtJ3 and PKS5 A. Structure of the gene AtJ3(Boxes show extrons; solid bars signify introns; Triangles show the T-DNA insertion sties in atj3-1(SALK_132923 and atj3-2(SALK_141625); B. Diagram of the protein AtJ3(Boxes show various domains of AtJ3; J, G/F, Zn and C show the domain of J,G/F,CXXCXGXG zinc finger and C-terminus, respectively); C. Structure and mutant sites of the protein PKS5(KDAL. KDAL activation loop; JK. Conjunction domain; FISL. FISL motif; PPI. Domain interacted with the PP2C phosphorase; The solid black arrows indicate the point mutant positions of PKS5 and the T-DNA insertion site is marked with the triangle)

圖2 PKS5點突變磷酸化活性比較 A. PKS5-3和PKS5-4較PKS5有較高的磷酸化活性(MBP.麥芽糖結(jié)合蛋白；CBB.考馬斯亮藍染色；AUD.放射自顯影)；B. PKS5,PKS5-3和PKS5-4相對磷酸化活性Fig.2 Comparison of phosphorylation activity of PKS5 point mutant proteins A. PKS5-3 and PKS5-4 had higher kinase activity compared with PKS5(MBP. Myelin Basic Protein; CBB. Coomassie blue stain; AUD. Autoradiograph); B. Relative phosphorylation activity of PKS5,PKS5-3 and PKS5-4

2.2 PKS5不同結(jié)構(gòu)域點突變體外激酶活性測試

為考察PKS5不同結(jié)構(gòu)域發(fā)生點突變后各突變激酶活性變化，對PKS5不同的點突變CDS進行克隆并在原核中表達。不同PKS5點突變重組蛋白的激酶活性比較如圖2A所示。結(jié)果顯示，不同的PKS5點突變激酶活性發(fā)生改變，與PKS5對照相比較，PKS5-3與PKS5-4活性增高，其中PKS5-3活性最高。PKS5點突變激酶底物磷酸化(MBP)活性與自磷酸化活性變化一致(圖2:B)。此結(jié)果說明：PKS5不同結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變對PKS5激酶活性的影響不同。PKS5-3突變發(fā)生于激酶激活環(huán)內(nèi)(KDAL)，PKS5-4突變發(fā)生于FISL基序內(nèi)。KDAL突變對激酶活性影響要大于FISL內(nèi)突變。從PKS5點突變激酶活性可得知，與PKS5野生型相比較，擬南芥PKS5突變體pks5-3與pks5-4為功能獲得性突變體。

圖3 pks5點突變體ABA表型 A. pks5點突變體pks5-3與pks5-4生長12 d的ABA敏感表型；B. pks5-3與pks5-4雜交一代生長9 d表現(xiàn)出與親代相似的ABA敏感表型；C.不同ABA濃度下pks5點突變體萌發(fā)率曲線Fig.3 ABA phenotypes of pks5 point mutants A. pks5 point mutants display ABA sensitive phenotypes after 12d growth; B. F1 generation of cross of pks5-3 and pks5-4 has similar ABA phenotypes as the parents after 9 d growth; C. The germination curve of pks5 point mutants under gradient ABA

圖4 AtJ3與PKS5存在相互作用 A. AtJ3與PKS5在酵母中相互作用驗證(SC-LW.缺乏亮氨酸與色氨酸的合成完全培養(yǎng)基；SC-LWH+3-AT.缺乏亮氨酸、色氨酸和組氨酸并含20 mmol·L-13-氨基-1，2，4-三唑的合成完全培養(yǎng)基；X-Gal. SC-LWH+3-AT平板上酵母β-半乳糖苷酶活性試驗；SCaBP1,TTG1.正負對照；X10,X100.酵母培養(yǎng)液稀釋倍數(shù))； B.體內(nèi)AtJ3與PKS5存在相互作用(Myc. Myc標簽；FLAG. FLAG標簽；TTG1.對照)； C. AtJ3-GFP在原生質(zhì)體(上部)與轉(zhuǎn)基因植株(下部)中的定位；D. YFP-PKS5在原生質(zhì)體(上部)與轉(zhuǎn)基因植株(下部)中定位Fig.4 AtJ3 physically interacted with PKS5 A. Verification of interaction of AtJ3 and PKS5 in yeast(SC-LW. Synthetic complete medium without Leu and Trp; SC-LWH+3-AT. Synthetic complete medium without Leu,Trp and His and with 20 mmol·L-1 3-amino-1,2,4-triazole；X-Gal. β-galactosidase assay for yeast cells grown in the SC-LWH+3-AT plate；SCaBP1,TTG1. Indicate the positive and negative control,respectively; X10,X100. Show the serial diluted culture of yeast cells); B. Co-IP assay of AtJ3 and PKS5 in vivo(Myc. Myc tag；FLAG. FLAG tag；TTG1. Control); C. Localization of AtJ3-GFP in protoplasts(top panel) and transgenic lines(bottom panel); D. Localization of YFP-PKS5 in protoplasts(top panel) and transgenic lines(bottom panel)

2.3 pks5-3與pks5-4萌發(fā)期ABA表型

為考察PKS5突變體是否具有ABA表型，對PKS5點突變體pks5-3、pks5-4和PKS5的T-DNA突變體pks5-1的ABA表型進行測試(圖3)。結(jié)果顯示：pks5-3和pks5-4在含0.3 μmol·L-1ABA的MS平板上表現(xiàn)出ABA敏感表型，萌發(fā)率與野生型相比較降低，幼苗生長矮小，黃化(圖3:A)。而pks5-1在此條件下與野生型比較不顯示ABA敏感表型。將pks5-3與pks5-4進行雜交，F(xiàn)1子代在含0.3 μmol·L-1ABA的MS平板上表現(xiàn)出與親代相似的ABA敏感表型，但其對ABA的敏感性增加(圖3:B)。pks5-3與pks5-4在不同ABA濃度下萌發(fā)率曲線表明：pks5-3與pks5-4在不同ABA濃度下的萌發(fā)率隨著ABA濃度的升高而降低，在0.15～0.75 μmol·L-1ABA濃度區(qū)間內(nèi)，pks5-4較pks5-3具有較高的萌發(fā)率(圖3:C)。pks5功能獲得性點突變體ABA表型說明：PKS5參與ABA響應途徑，為ABA信號轉(zhuǎn)導的元件之一。

2.4 AtJ3與PKS5的相互作用

為獲得與PKS5相互作用元件，將PKS5的CDS克隆至pGBT9酵母表達載體上，以PKS5為誘餌蛋白篩選擬南芥cDNA文庫。篩選到編碼DnaJ類似熱激蛋白AtJ3。為確認PKS5與AtJ3間的相互作用，將AtJ3的CDS克隆至pGAD10酵母載體上，與PKS5酵母載體共轉(zhuǎn)入酵母菌株P(guān)J69-4A中，在篩選培養(yǎng)基上驗證PKS5與AtJ3間的相互作用。圖4A結(jié)果表明PKS5與AtJ3在酵母中的確存在相互作用。為進一步確認PKS5與AtJ3在植物體內(nèi)的相互作用，構(gòu)建PKS5與AtJ3不同標簽蛋白植物表達載體，共轉(zhuǎn)入擬南芥野生型(Col-0)原生質(zhì)體中。Co-IP試驗表明：在植物體內(nèi)，PKS5與AtJ3也存在相互作用(圖4:B)。在原生質(zhì)體與植物中表達AtJ3綠色熒光與PKS5黃色熒光融合蛋白，使用Confocal觀察兩者的亞細胞定位，圖4C表明AtJ3與PKS5在細胞膜、細胞質(zhì)與細胞核中均有表達。PKS5與AtJ3表達在細胞中有重疊。此支持AtJ3與PKS5在酵母與原生質(zhì)體中相互作用結(jié)果。上述結(jié)果說明體內(nèi)PKS5與AtJ3存在相互作用，共同參與特定的信號過程。

2.5 atj3-1與atj3-2萌發(fā)期ABA表型

AtJ3與PKS5體內(nèi)存在相互作用。pks5-3和pks5-4表現(xiàn)對ABA的敏感表型。為測試AtJ3是否也參與了植物ABA響應過程，使用atj3-1與atj3-2功能缺失突變體(圖5:A)對其ABA表型進行考察。結(jié)果表明：atj3-1與atj3-2在含0.3 μmol·L-1ABA的MS平板上也顯示對ABA的敏感表型(圖5:B～C)。在0.3 μmol·L-1ABA處理下，與野生型相比較，atj3-1與atj3-2的萌發(fā)率降低(圖5:B)。萌發(fā)后9 d，atj3-1與atj3-2的幼苗生長矮小，黃化程度增加(圖5:C)，呈現(xiàn)與pks5-3和pks5-4在相同濃度ABA下的相似表型。atj3-1與atj3-2雜交F1子代與其親代ABA表型相同，表明AtJ3的確參與了ABA響應過程。atj3-1與atj3-2在不同ABA濃度下的萌發(fā)率曲線表明，atj3-1與atj3-2的萌發(fā)率隨ABA濃度的增加而下降(圖5:D)，在0.15～0.75 μmol·L-1ABA濃度區(qū)間內(nèi)，atj3-1與atj3-2在相同ABA濃度下的萌發(fā)率無顯著差異(P<0.05)。

2.6 AtJ3與PKS5雙突變體ABA表型

為確認AtJ3是否在遺傳上與PKS5相互作用，共同參與植物ABA響應過程。將atj3-1與PKS5不同類型突變體進行雜交，構(gòu)建atj3-1pks5-1、atj3-1pks5-3和atj3-1pks5-4雙突變體，并對其ABA表型進行考察，表型測試結(jié)果如圖6所示。

在含0.3 μmol·L-1ABA的MS平板上，atj3-1pks5-3和atj3-1pks5-4雙突變體對ABA處理的表型一致，均表現(xiàn)為對ABA的敏感表型。生長12 d的幼苗出現(xiàn)生長矮小，atj3-1pks5-3出現(xiàn)嚴重黃化。雙突變體與雜交親本ABA的表型相比較，atj3-1pks5-3和atj3-1pks5-4對ABA的反應比各自的親本更加強烈(圖6:B-C)。而atj3-1pks5-1雙突變體對ABA表型與atj3-1pks5-3和atj3-1pks5-4不同。atj3-1pks5-1與其單突變體對ABA的敏感性較atj3-1pks5-3和atj3-1pks5-4對各自單突變體的ABA降低(圖6:A)。體外激酶活性測試表明，PKS5-3與PKS5-4較野生型PKS5有著更高的磷酸化活性(圖2)。pks5-3和pks5-4為功能獲得性突變體，pks5-1則為功能缺失突變體。此表明對于PKS5而言，其不同的突變形式對ABA的響應存在差異。不同類型PKS5突變體對ABA的響應與其體內(nèi)激酶活性的差異相關(guān)。atj3-1與不同形式PKS5雙突變體ABA表型與相應的PKS5突變體相似，表明AtJ3在遺傳上處于PKS5的上游起作用。AtJ3與PKS5雙突變體ABA表型分析也進一步說明，AtJ3與PKS5存在遺傳上的相互作用，AtJ3處于PKS5的上游，在ABA同一信號途徑起作用。

圖5 atj3功能缺失突變體ABA表型 A. AtJ3功能缺失突變體鑒定；B. atj3-1與atj3-2功能缺失突變體在含0.3 μmol·L-1 ABA的MS平板上生長9 d后表現(xiàn)出ABA敏感表型；C. atj3-1與atj3-2雜交一代生長9 d后表現(xiàn)與親代相似的ABA表型；D.不同ABA濃度下AtJ3突變體萌發(fā)率曲線Fig.5 atj3 knockout mutants were sensitive ABA A. Identification of two atj3 knockout mutants; B. atj3-1 and atj3-2 mutants showed ABA sensitive phenotype after 9 d growth on MS supplemented with 0.3 μmol·L-1 ABA; C. F1 generation of cross of atj3-1 and atj3-2 showed similar phenotype after 9 d growth as the parents; D. The germination curve of atj3 mutants under gradient ABA

圖6 atj3-1pks5-1,atj3-1pks5-3與atj3-1pks5-4雙突變體ABA表型 A.atj3-1pks5-1雙突變體生長12 d的ABA表型；B.atj3-1pks5-3雙突變體生長12 d的ABA的表型；C.atj3-1pks5-4雙突變體生長12 d的ABA表型Fig.6 ABA phenotype of double mutants of atj3-1pks5-1, atj3-1pks5-3 and atj3-1pks5-4 A. ABA phenotype of double mutant of atj3-1pks5-1 after 12 d growth; B. ABA phenotype of double mutant of atj3-1pks5-3 after 12 d growth; C. ABA phenotype of double mutant of atj3-1pks5-4 after 12 d growth

2.7 AtJ3對PKS5激酶活性的影響

AtJ3與PKS5存在相互作用，共同參與擬南芥ABA響應，且AtJ3在遺傳上處于PKS5上游起作用。為考察AtJ3與PKS5兩者間在植物ABA響應中的分子作用機理，對AtJ3是否影響PKS5的激酶活性進行了測試。在體外PKS5激酶活性測試中加入重組AtJ3，測試PKS5激酶對通用底物MBP的磷酸化程度變化。圖7A顯示：當PKS5激酶活性測試體系加入AtJ3重組蛋白后，PKS5對MBP的磷酸化程度降低，表明AtJ3可抑制PKS5的激酶活性。隨著體系中AtJ3含量的增加，PKS5的激酶活性下降。PKS5-3與PKS5-4的激酶活性較PKS5高，AtJ3對PKS5及其兩種突變形式的激酶活性呈現(xiàn)相同的抑制模式，而AtJ3不能對與PKS5同源的SOS2激酶活性進行抑制，進一步說明AtJ3可對PKS5激酶活性以特異的抑制方式起作用。

圖7 AtJ3抑制PKS5激酶活性 A.重組AtJ3體外抑制PKS5、PKS5-3和PKS5-4激酶活性(PKS5、PKS5-3與PKS5-4活性測定使用MBP為激酶作用底物；SOS2.對照，以P3為激酶作用底物；數(shù)字表示加入的不同量AtJ3蛋白；CBB.考馬斯亮藍染色；AUD.放射自顯影；AUTO.PKS5蛋白激酶自磷酸化活性)；B.瞬時表達AtJ3的IP產(chǎn)物抑制PKS5激酶自磷酸化活性(RLS. Rubisco大亞基；supernatant.原生質(zhì)體裂解上清液；Eluted fusion protein.洗脫的不同標簽融合蛋白；Elution buffer.洗脫緩沖液；SCABP1.表達的SCABP1蛋白，作為陰性對照；CBB.考馬斯亮藍染色；AUTO.PKS5蛋白激酶自磷酸化活性)Fig.7 AtJ3 repressed PKS5 kinase activity A. Recombinant AtJ3 repressed the kinase activity of PKS5, PKS5-3 and PKS5-4 in vitro(Phosphorylation of PKS5,PKS5-3 and PKS5-4 were measured using MBP as substrate and SOS2 using P3 as substrate; SOS2 was used as control; Numbers indicate the amount of AtJ3 proteins added in assays; CBB. Coomassie blue stain；AUD. Autoradiograph；AUTO. PKS5 atuophosphorylation); B. IP product of transient expressed AtJ3 repressed PKS5 kinase attophosphorylation activity(RLS. Rubisco large subunit；supernatant. Protoplasts lysate superantant；Eluted fusion protein. Eluted FLAG-tagged fusion protein；SCABP1. SCABP1 protein used as negative control；CBB. Coomassie blue stain; AUD. Autoradiograph; AUTO. Aotopholpyorylation

為確認體內(nèi)AtJ3對PKS5激酶活性的抑制作用，構(gòu)建AtJ3及SCABP1的FLAG標簽融合植物表達載體，轉(zhuǎn)化擬南芥野生型(Col-0)原生質(zhì)體進行FLAG融合蛋白表達。使用IP方法從原生質(zhì)體中純化植物表達AtJ3與SCABP1蛋白(圖7：B上部)，將其加入體外PKS5激酶活性測試體系中進行PKS5激酶活性測試。結(jié)果表明：植物表達AtJ3對PKS5激酶活性同樣具有抑制作用(圖7：B下部)，與重組AtJ3對PKS5活性抑制作用相同。植物表達陰性對照SCABP1不能抑制PKS5激酶活性，說明植物表達AtJ3同樣對PKS5活性抑制作用具有特異性。重組與植物表達AtJ3均對PKS5激酶活性具有抑制作用，表明在植物對ABA響應中，AtJ3通過對PKS5激酶活性的抑制方式參與ABA信號途徑。

3 討論

ABA參與植物發(fā)育過程及對外界各種環(huán)境脅迫，現(xiàn)已鑒定了多種參與ABA信號途徑的元件。其中之一為蛋白激酶。PKSes屬于CDPK-SnRK超家族中SnRK3亞家族。已發(fā)現(xiàn)PKS家族PKS3、PKS12、PKS18及PKS24為植物ABA信號途徑中的成員，參與ABA響應過程。猜測PKS5也可能參與ABA響應過程。

為驗證PKS5是否也參與ABA的響應過程，本研究使用PKS5不同類型突變體測試其在萌發(fā)期ABA處理下的表型。結(jié)果顯示：在0.3 μmol·L-1ABA處理下，PKS5功能獲得性突變體pks5-3與pks5-4在萌發(fā)期生長表現(xiàn)出對ABA的敏感表型。突變體萌發(fā)率下降，萌發(fā)后幼苗生長矮小，表現(xiàn)黃化現(xiàn)象。此說明PKS5在植物萌發(fā)與幼苗期參與植物的ABA響應過程。為獲得與PKS5可能相互作用并參與ABA信號途徑的元件，使用酵母雙雜交技術(shù)，從擬南芥表達庫中篩選到編碼類似DnaJ熱激蛋白的分子伴侶AtJ3，并對其兩個功能缺失突變體atj3-1與atj3-2在萌發(fā)與幼苗期ABA表型進行了測試。atj3-1與atj3-2在萌發(fā)與幼苗期的ABA表型與PKS5突變體相似，也具有對ABA的敏感表型。對PKS5與AtJ3的雜交子代純合雙突變體的ABA表型測試表明：PKS5與AtJ3存在遺傳上的相互作用，AtJ3處于PKS5上游起作用，共同參與對外源ABA處理的響應過程。結(jié)合體外PKS5與AtJ3相互作用證據(jù)，可確認PKS5與AtJ3在植物體內(nèi)的確存在相互作用，二者共同參與ABA響應過程。重組與植物表達AtJ3均對PKS5的激酶活性具有抑制作用，表明在植物體內(nèi)AtJ3以對PKS5激酶活性抑制的方式參與對PKS5的調(diào)節(jié)，響應外界ABA信號。本研究結(jié)果為ABA信號轉(zhuǎn)導途徑鑒定了新的參與元件，并提供了元件間的相互作用證據(jù)與分子作用機理。

在PKS5不同類型突變體對ABA處理的表型測試中，功能缺失突變體pks5-1與pks5-1atj3-1雙突變體對ABA處理的敏感性低于其它類型的突變體。pks5-3、pks5-4及atj3-1pks5-3、atj3-1pks5-4則表現(xiàn)出萌發(fā)與幼苗期的ABA超敏感表型，其中pks5-3較pks5-4的ABA表型更為明顯。pks5-3與pks5-4為功能獲得性突變體，而pks5-1為功能缺失突變體，推測植物體內(nèi)還存在處于PKS5下游的其它參與ABA基因調(diào)節(jié)的元件，當PKS5蛋白缺失時，未知對下游ABA元件的調(diào)節(jié)作用互補了PKS5的功能，只有當PKS5蛋白存在且其激酶活性發(fā)生變化時，PKS5對下游ABA元件的調(diào)節(jié)功能主要由PKS5承擔，參與ABA的響應過程。

已有研究表明：PKS3與SCaBP5相互作用并在擬南芥ABA響應中起作用[30]。SCaBP1具有感應細胞內(nèi)鈣離子水平功能，作為鈣的感應器可與PKS家族成員相互作用，激活與招募PKS家族成員至質(zhì)膜上，最終激活目標調(diào)節(jié)子[31～34]。本研究確認AtJ3與PKS5相互作用并參與ABA信號過程，推測也同樣存在SCaBP家族成員與PKS5相互作用共同參與ABA的響應過程。此外，已有報道表明：AtJ3與PKS5可對質(zhì)膜質(zhì)子泵進行調(diào)節(jié)，參與植物對外界高鹽與pH響應過程[25]。由此，保持細胞內(nèi)pH內(nèi)平衡是否與ABA響應過程相關(guān)，AtJ3與PKS5是否在不同信號途徑中具有交叉作用是本研究的進一步工作。

4 結(jié)論

研究使用擬南芥PKS5不同類型突變體確認PKS5蛋白激酶參與植物ABA響應，其為植物ABA信號轉(zhuǎn)導途徑中作用元件之一。此外，以PKS5為誘餌蛋白，通過酵母雙雜交技術(shù)篩選到與PKS5相互作用的蛋白分子伴侶AtJ3。對2個擬南芥AtJ3功能缺失突變體的研究表明：AtJ3也參與植物ABA響應過程。對AtJ3與PKS5的遺傳與生化測試表明：AtJ3與PKS5在體內(nèi)存在著相互作用，AtJ3通過對PKS5蛋白激酶活性的抑制作用方式共同參與植物ABA響應過程。

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AtJ3isInvolvedinABAResponsethroughInteractionwiththePKS5KinaseinArabidopsis

ZHAO Fei-Yi JIAO Cheng-Jin CHEN Quan JIA Zhen WANG Tai-Shu ZHOU Hui

(School of Bioengineering & Biotechnology,Tianshui Normal University,Tianshui 741000)

The phytohormone abscisic acid(ABA) has a wide range of important roles in plant growth and development as well as abiotic stress response. Previous studies identified the enormous components involved in ABA responses in plants. We identified a chaperon AtJ3(Arabidopsis thaliana DnaJ homolog 3; heat shock protein 40-like) using yeast two-hybrid assays in which PKS5 was used as bait. TheAtJ3 T-DNA mutantsatj3-1 andatj3-2 displayed ABA phenotypes. Seed germinations ofatj3-1 andatj3-2 decreased, and the seedlings of them showed stunted growth and leaf chlorotic symptoms under ABA. Double mutants ofatj3-1pks5-1,atj3-1pks5-3 andatj3-1pks5-4 had similar ABA phenotypes as mutants ofAtJ3 orPKS5. Moreover, the assays of subcellular location and transgenic plants showed that AtJ3 has overlapping expression pattern with PKS5. By co-immunoprecipitation andinvitrophosphorylation, AtJ3 physically interacts with PKS5 and represses the PKS5 kinase activity. Therefore, AtJ3 interacts with PKS5 in response to ABA by repressing the PKS5 kinase activity.

ABA response；AtJ3；interaction；phosphorylation repress； PKS5

國家自然科學基金(31260568和31160060)

趙菲佚(1972—)，男，副教授，博士，主要從事植物分子生物學研究。

2015-07-17

Q789

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.01.015