杜雄偉，張珂琪，李　焱，唐文彥，耿亞娟，王婭君，王佳碩

（1.大連民族大學(xué)，遼寧大連　116600；2. 四平市職業(yè)技術(shù)教育中心，吉林四平　136000）

大連市零售豬肉中沙門(mén)氏菌的耐藥性檢測(cè)與分析

杜雄偉1，張珂琪2，李焱1，唐文彥1，耿亞娟1，王婭君1，王佳碩1

（1.大連民族大學(xué)，遼寧大連116600；2. 四平市職業(yè)技術(shù)教育中心，吉林四平136000）

［目的］為了解遼寧省大連市生鮮豬肉中沙門(mén)氏菌的污染與耐藥情況。［方法］采集該市生鮮豬肉78份，用選擇性培養(yǎng)基分離沙門(mén)氏菌并劃線(xiàn)純化，通過(guò)invA序列對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，利用紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）檢測(cè)其對(duì)12種抗生素的耐藥性。［結(jié)果］共得到15株沙門(mén)氏菌，檢出率為19.23%。分離的沙門(mén)氏菌對(duì)12種抗生素的耐藥率在0～73.3%之間。其中，對(duì)硫酸慶大霉素的耐藥率最高，為73.3%；對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率依次是鹽酸諾氟沙星（60%）、氟苯尼考和鹽酸環(huán)丙沙星（均為53.3%）、阿莫西林（13.3%）、頭孢噻吩、頭孢噻肟、氨芐西林（均為6.7%），頭孢曲松、頭孢他啶、氨曲南、亞胺培南（均為0）。共產(chǎn)生10種耐藥譜。［結(jié)論］大連市開(kāi)發(fā)區(qū)的超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)沙門(mén)氏菌污染率較高，并且沙門(mén)氏菌對(duì)多種抗生素表現(xiàn)出多重耐藥譜，應(yīng)給予重視。

零售豬肉；沙門(mén)氏菌；耐藥性

在畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中，抗生素不僅用于控制和治療疾病，還常用來(lái)提高動(dòng)物抗病力、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)等［1］。但是由于有些養(yǎng)殖戶(hù)濫用抗菌藥物，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重、耐藥譜越來(lái)越廣。通過(guò)耐藥性試驗(yàn)，調(diào)查沙門(mén)氏菌的耐藥譜，為臨床醫(yī)學(xué)治療中抗生素的合理使用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)食品安全具有重要意義。孫曉林等［2］對(duì)蘭州市肉與肉制品微生物污染狀況進(jìn)行研究，結(jié)果表明肉樣沙門(mén)氏菌檢出率為 14%；楊保偉等［3］檢測(cè)陜西部分地區(qū)食品中沙門(mén)氏菌污染情況，結(jié)果表明沙門(mén)氏菌在豬肉中檢出率為19.4%；洪文展等［4］發(fā)現(xiàn)深圳市售肉品沙門(mén)氏菌污染率為26.2%。本研究通過(guò)對(duì)遼寧省大連市豬源性沙門(mén)氏菌進(jìn)行分離鑒定，對(duì)12種抗生素進(jìn)行藥敏性分析，旨在了解該地區(qū)沙門(mén)氏菌污染和耐藥情況，為確保食品安全奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株。采集遼寧省大連市開(kāi)發(fā)區(qū)各大超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的新鮮豬肉樣品78份。從這些樣品中共分離到15株沙門(mén)氏菌。耐藥性檢測(cè)質(zhì)控菌株為E.coilATCC25922。

1.1.2培養(yǎng)基及試劑。SS瓊脂培養(yǎng)基、水解酪蛋白（mueller-hinton，MH）液、固培養(yǎng)基購(gòu)于北京奧特星生物有限公司；瓊脂糖、Taq DNA 聚合酶、dNTP 及分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000購(gòu)于大連寶生物公司。

1.1.3藥敏紙片。β-內(nèi)酰胺類(lèi)：頭孢曲松（CRO，30 μg/片），頭孢噻吩（KF，30 μg/片），頭孢噻肟（CTX，30 μg/片），頭孢他啶（CAE，30 μg/片），氨芐西林（AMP，10 μg/片），氨曲南（ATM，35 μg/片），亞胺培南（IPM，10 μg/片），阿莫西林（AMO，10 μg/片）。氯霉素類(lèi)：氟苯尼考（FLO，30 μg/片）。氨基糖苷類(lèi)：硫酸慶大霉素（GEN，10 μg/片）。喹諾酮類(lèi)：鹽酸諾氟沙星（NIA，5 μg/片），鹽酸環(huán)丙沙星（CH，5 μg/片）。以上12種藥敏紙片，購(gòu)于杭州濱河微生物試劑有限公司。

1.2方法

1.2.1采樣。每個(gè)采集點(diǎn)采集少量新鮮豬肉，無(wú)菌封好后放置于保鮮袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，在無(wú)菌條件下，用經(jīng)酒精燈消毒的鑷子和手術(shù)刀按編號(hào)取少量樣本，剪碎后移入裝有營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管內(nèi)，置于搖床中37 ℃培養(yǎng)18～24 h。

1.2.2選擇性培養(yǎng)與增菌。經(jīng)過(guò)液體培養(yǎng)后的樣品前增菌液經(jīng)過(guò)平板劃線(xiàn)接種于SS瓊脂培養(yǎng)基，置于（36±1） ℃下倒置培養(yǎng)18～24 h［5］。根據(jù)菌落形態(tài)，挑取沙門(mén)氏菌可疑菌落。將實(shí)驗(yàn)待檢測(cè)菌株與陽(yáng)性菌株劃線(xiàn)接種于SS斜面培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h；再?gòu)呐囵B(yǎng)基上用滅菌的接種環(huán)挑取一環(huán)菌落在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上進(jìn)行劃線(xiàn)，37 ℃恒溫條件培養(yǎng)24 h，以分離單菌落。

1.2.3PCR方法。將純化的單菌落接種于裝有滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯的1 mL EP管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，12 000 r/min離心培養(yǎng)好的菌液3 min收集菌體，用移液槍吸取200 μL無(wú)菌水于EP管內(nèi)，清洗兩次，再加入200 μL的無(wú)菌水。在水浴鍋內(nèi)煮10 min，然后在冰塊里冷卻5 min，最后在10 000 r/min條件下離心5 min。取上清液于1 mL EP管中。擴(kuò)增基因?yàn)閕nvA基因，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為284 bp。PCR擴(kuò)增體系25 μL， ExTaq酶（5 U/μL）0.25 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，dNTPMixture（各2.5 mM）2 μL，模板DNA溶液2.5 μL，ddH2O加至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)完成后，進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。

1.2.4藥敏試驗(yàn)。采用紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B法），從平板上挑取單個(gè)菌落接種于3 mL MHB［7］，35 ℃培養(yǎng)6～8 h，用生理鹽水（0.89% NaCl）校正濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷幔脽o(wú)菌拭子蘸取菌液，涂布MHA平板，平板在室溫下干燥5 min，用無(wú)菌鑷子將含藥紙片緊貼瓊脂表面，35 ℃培養(yǎng)16～18 h，量取抑菌圈直徑。大腸埃希氏菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株，參照M100-S20標(biāo)準(zhǔn)［8］判斷敏感（S）、中介（I）和耐藥（R），根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分析病原菌的耐藥譜。

2　結(jié)果與分析

2.1鮮豬肉樣品沙門(mén)氏菌的分離鑒定結(jié)果

由表1可知，所采集的鮮豬肉樣品共分離出15株沙門(mén)氏菌，可見(jiàn)大連市開(kāi)發(fā)區(qū)的超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)沙門(mén)氏菌污染率較高，為19.23%。

表1　不同來(lái)源樣品中中沙門(mén)氏菌的分離情況

2.2 豬源沙門(mén)氏菌的耐藥性

由表2可知，15株沙門(mén)氏菌對(duì)各種抗生素的耐藥率為0～73.3%。其中對(duì)GEN的耐藥率最高，為73.3%；對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率大小依次是NIA（60%）＞PLO、CH（同為53.3%）＞AMO（13.3%）＞KF、CTX、AMP（同為6.7%）；對(duì)KF、CTX、AMP的耐藥率均為6.7%，敏感性達(dá)到70%以上；對(duì)CRO、CAE、ATM、IPM的耐藥性均為0，敏感性達(dá)到90%以上。這些藥物對(duì)沙門(mén)氏菌都有極強(qiáng)的抗菌作用。從抗生素大類(lèi)來(lái)看，耐藥率依次是：氨基糖苷類(lèi)（73.3%）＞喹諾酮類(lèi)（53.3%～60%）＞氯霉素類(lèi)（53.3%）＞β-內(nèi)酰胺類(lèi)（0～13.3%）。

表2　豬源沙門(mén)氏菌耐藥率

2.3豬源沙門(mén)氏菌多重耐藥譜

分離得到的15株沙門(mén)氏菌的耐藥性情況如表3所示，15株沙門(mén)氏菌產(chǎn)生了10種耐藥譜，15株沙門(mén)氏菌中14株具有耐藥性，其中11株至少耐受2種抗生素，8株至少耐受3種抗生素。個(gè)別菌株可耐受4種以上抗生素。

表3　沙門(mén)氏菌的耐藥譜

3　討論

采集鮮豬肉樣品共78份，獲得沙門(mén)氏菌15株，檢出率為19.23%。研究結(jié)果表明，大連地區(qū)鮮豬肉污染較為嚴(yán)重，沙門(mén)氏菌檢出率較高，應(yīng)對(duì)市場(chǎng)流通的鮮肉產(chǎn)品引起足夠的重視，加強(qiáng)豬肉屠宰、運(yùn)輸、加工、貯存及銷(xiāo)售等環(huán)節(jié)的管理，防止病原菌污染。

豬源沙門(mén)氏菌表現(xiàn)出一定的耐藥性，對(duì)各種抗生素的耐藥率在0～73.3%，其中對(duì)GEN、NIA、PLO、CH、AMO耐藥率最高，依次是73.3%、60%、53.3%、53.3%、13.3%。本項(xiàng)研究分離的15株沙門(mén)氏菌共產(chǎn)生10種耐藥譜，3耐以上菌株占53.3%。狄文婷等［9］對(duì)12株豬源沙門(mén)氏菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，結(jié)果有11株（83.3%）至少可以耐受1種抗菌藥物，其中9株（75%）至少耐受4種抗生素。馬孟根等［10］對(duì)30 株豬源致病性沙門(mén)氏菌進(jìn)行了藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果有28 株菌（93.3%）至少對(duì)1種藥物有耐藥性。李郁［11］對(duì)合肥市屠宰生豬沙門(mén)氏菌耐藥性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)74.3%的沙門(mén)氏菌對(duì)至少1種抗生素產(chǎn)生耐藥性，64.7%的菌株為多重耐藥。以上結(jié)果表明，多重耐藥豬肉源沙門(mén)氏菌的出現(xiàn)已經(jīng)成為普遍現(xiàn)象［12-13］，應(yīng)引起足夠重視，注意在肉類(lèi)食品流通環(huán)節(jié)中的消毒衛(wèi)生，以降低此類(lèi)菌感染人的風(fēng)險(xiǎn)，保證人類(lèi)的健康。四大類(lèi)抗生素中，沙門(mén)氏菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)具有很高的敏感性，說(shuō)明這些藥物對(duì)沙門(mén)氏菌都有極強(qiáng)的抗菌作用，可作為臨床治療中抗生素的選擇依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：杜憲）

Antimicrobial Susceptibility Testing of Salmonella in Retail Pork in Dalian City

Du Xiongwei1，Zhang Keqi2，Li Yan1，Tang Wenyan1，Geng Yajuan1，Wang Yajun1，Wang Jiashuo1
（1. Dalian Nationalities University，Dalian，Liaoning 116600；2. Siping Vocational Education Center，Siping，Jilin 136000）

［Objective］To investigate and understand the contamination situation of Salmonella existed in fresh retail pork in Dalian city，as well as the drug resistance status. ［Methods］78 fresh pork samples in supermarkets were collected，then Salmonellas were isolated and purified by selective medium. After being identified by invA sequence analysis，the drug resistance of these Salmonella isolates to 12 kinds of antibiotics was detected by the disc agar diffusion method（K-B）. ［Results］The results showed that 15 Salmonella isolates were obtained with the detection rate of 19.23%. The resistance rate to antibiotics was in a range from 0 to 73.3%. 73.3% of the isolates were resistant to Gentamycin sulfate，and the resistance rate of other antibiotics decreased in the following order：norfl oxacin hydrochloride（60%）＞Florfenicol、Ciprofl oxacin Monohydrochloride（53.3%）＞Amoxicillin（13.3%）＞Cephalothin、 Cefotaxime、Ampicillin（6.7%）＞Ceftriaxone，Ceftazidime，Aztreonam，Imipenem（0），altogether 10 drug-resistance profiles were found. ［Conclusion］The Salmonella contamination was severe in the supermarkets and farmer's markets in the development zone of Dalian city，which also showed multi-resistant pattern. The results indicated suffi cient attention should be paid attention to the control of Salmonella.

retail pork；Salmonella；drug resistance

S852.61

B

1005-944X（2016）10-0023-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.10.006

大連金州新區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（KJCX-ZTPY-2014-0013）；大連市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014B11NC094）；中央高校自主基金項(xiàng)目（DC2015010020401）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD38B05）