牛成明，姚　靜，楊靈芝，楊　琴，馬景霞，朱　杰

（1. 山東濱州沃華生物工程有限公司，山東濱州　256606；2. 山東省動(dòng)物病原微生物工程實(shí)驗(yàn)室，山東濱州　256606；3. 濱州出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濱州　256603；4. 山東濱州市畜牧獸醫(yī)局，山東濱州　256600）

豬瘟兔化弱毒間接免疫熒光鑒定方法的建立

牛成明1，2，姚靜3，楊靈芝1，2，楊琴1，2，馬景霞4，朱杰

（1. 山東濱州沃華生物工程有限公司，山東濱州256606；2. 山東省動(dòng)物病原微生物工程實(shí)驗(yàn)室，山東濱州256606；3. 濱州出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濱州256603；4. 山東濱州市畜牧獸醫(yī)局，山東濱州256600）

為快速有效測(cè)定豬瘟疫苗病毒含量，建立了豬瘟兔化弱毒（HCLV）間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）方法，并與兔體定型熱試驗(yàn)方法進(jìn)行了初步比較。試驗(yàn)結(jié)果表明，以冷甲醇固定ST細(xì)胞，將所選豬瘟活疫苗檢驗(yàn)用陽性血清1∶40倍稀釋、熒光二抗1∶32倍稀釋時(shí)，IFA檢測(cè)HCLV感染的ST細(xì)胞清晰、特異，檢測(cè)豬偽狂犬病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒感染細(xì)胞陰性。對(duì)不同豬瘟疫苗半成品的檢測(cè)結(jié)果顯示，IFA測(cè)定半數(shù)組織感染量（TCID50）與兔體定型熱試驗(yàn)測(cè)定兔體感染量（RID）具有較好的相關(guān)性，其擬合曲線為RID/mL=2.783TCID50/mL +110107.213。

豬瘟兔化弱毒（HCLV）；間接免疫熒光試驗(yàn)；兔體感染量

豬瘟是由豬瘟病毒（Classical Swi ne Fever Virus，CSFV）引起的一種急性、高度接觸性、致死性疾病，在世界許多國家、地區(qū)均有發(fā)生，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失［1-2］。目前，控制和預(yù) 防豬瘟的主要手段仍然是疫苗免疫。我國的豬瘟兔化弱毒活疫苗（HCLV）是世界公認(rèn)的、最好的豬瘟疫苗，對(duì)世界豬瘟的預(yù)防和控制起到了巨大作用［3］。許多國家和地區(qū)利用該疫苗消滅了豬瘟。豬瘟疫苗的質(zhì)量是決定免疫效果，乃至豬瘟防控成效的關(guān)鍵因素。而疫苗中有效病毒含量，是決定疫苗質(zhì)量的重要指標(biāo)。傳統(tǒng)的豬瘟疫苗病毒含量的測(cè)定方法為兔體定型熱試驗(yàn)方法［4］。該法檢測(cè)成本高、結(jié)果可重復(fù)性差、檢驗(yàn)周期長，易受動(dòng)物因素制約，且費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，存在一定的局限性。因此，建立一種合理有效、快速準(zhǔn)確的豬瘟疫苗檢測(cè)方法，對(duì)于提高疫苗的檢驗(yàn)水平，保證疫苗的質(zhì)量尤為必要。針對(duì)上述問題，本研究建立了豬瘟兔化弱毒的間接免疫熒光試驗(yàn)方法（Indirect immunofl uorescence assay，IFA），用于豬瘟疫苗病毒含量的快速測(cè)定。

1　材料與方法

1.1材料

豬瘟兔化弱毒細(xì)胞毒：本實(shí)驗(yàn)室制備，PCR檢測(cè)無外源病毒污染，-70 ℃保存；豬偽狂犬病毒（PRV Bathar-K61）、豬傳染性胃腸炎病毒（ TGEV華毒株）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV CV777）：本試驗(yàn) 室擴(kuò)繁保存；ST細(xì)胞：濟(jì)南勁牛生物科技有限公司惠贈(zèng)，本試驗(yàn)室擴(kuò)繁凍存。

豬瘟活疫苗檢驗(yàn)用陽性血清：購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；豬瘟單克隆抗體（A）、豬瘟高免血清（B）、豬 瘟特異性血清（C）：本實(shí)驗(yàn)室保存；FITC標(biāo)記兔抗豬IgG熒光二抗：購自Sigma公司， 利用PBS稀釋32倍使用；FITC標(biāo)記羊抗鼠熒光二抗：購自KPL公司，PBS稀釋100倍使用；豬瘟專用新生牛血清：購自濟(jì)南勁牛生物科技有限公司；MEM：購自北京清大天一科技有限公司；胰酶：購自Gibco公司。其它試劑：滅菌PBS、-20 ℃預(yù)冷的甲醇、-20 ℃預(yù)冷的丙酮等。

1.2豬瘟病毒培養(yǎng)（同步接毒法）

將長滿單層的ST細(xì)胞消化，按照1∶3比例傳代，同時(shí)按照1/10接毒劑量同步接毒，置37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)72～96 h。單層長滿后，將細(xì)胞按1∶2比例帶毒傳代，鋪96孔板，同時(shí)設(shè)不接毒對(duì)照，置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)72 h。

1.3間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）

將96孔板已接毒ST細(xì)胞棄去培養(yǎng)液， PBS洗3次，-20 ℃預(yù)冷的有機(jī)溶劑2～8 ℃固定25 min，棄去有機(jī)溶劑，自然揮干。每孔滴加PBS稀釋的豬瘟抗體，45 μL/孔，37 ℃溫箱作用50 min，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照（非接毒ST細(xì)胞加一抗）、空白對(duì)照（接毒ST細(xì)胞加PBS）。PBS洗3次，每孔加PBS稀釋的FITC標(biāo)記的熒光二抗，40 μL/孔，37 ℃溫箱避光作用40 min。PBS洗3次，熒光顯微鏡鏡檢。

1.4IFA試驗(yàn)條件優(yōu)化

1.4.1不同有機(jī)溶劑的選擇。參照文 獻(xiàn)［5］，分別選用-20 ℃預(yù)冷的甲醇、丙酮、80%丙酮溶液、6∶4的丙酮乙醇溶液、1∶1的甲醇丙酮溶液，對(duì)單層長滿的接毒ST細(xì)胞4 ℃固定25 min，分別從使用的方便性、固定效果和IFA熒光染色亮度，對(duì)有機(jī)溶劑的細(xì)胞固定效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.4.2IFA一抗的篩選。選取96孔板接毒ST細(xì)胞，按照1.4.1中優(yōu)選的固定溶劑進(jìn)行固定。將豬瘟單克隆抗體（A）、豬瘟高免血清（B）、豬瘟特異性血清（C）分別稀釋50倍、100倍和50倍，將豬瘟活疫苗檢驗(yàn)用陽性血清稀釋2 0倍，分別加入到細(xì)胞板不同孔中，進(jìn)行IFA試驗(yàn)，并設(shè)PBS空白對(duì)照，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.4.3豬瘟活疫苗檢驗(yàn)用陽性血清最適工作濃度的確定。選取96孔板接毒ST細(xì)胞，按照1.4.1中優(yōu)選的固定溶劑進(jìn)行固定。將豬瘟陽性血清進(jìn)行1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320倍稀釋，依次加入到細(xì)胞培養(yǎng)板，進(jìn)行IFA試驗(yàn)。熒光二抗的濃度按照說明書，1∶32倍稀釋使用。選取熒光清晰明亮的陽性血清最大稀釋倍數(shù)作為最適工作濃度。同時(shí)，設(shè)陰性和空白對(duì)照。

1.4.4最佳染色時(shí)間確定。將長滿單層的ST細(xì)胞按照1∶2傳代，鋪6塊96孔板，同時(shí)按照10 μL/孔接毒劑量同步接毒，并設(shè)陰性對(duì)照。分別于接毒后24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、96 h，對(duì)96孔板上ST細(xì)胞進(jìn)行固定，并進(jìn)行IFA染色，根據(jù)熒光斑大小和染色亮度進(jìn)行結(jié)果判定。

1.5IFA特異性試驗(yàn)

1.5.1不同病毒抗原交叉反應(yīng)試驗(yàn)。將96孔板上單層長至80%的ST細(xì)胞接種HCLV，接毒劑量為10 μL/孔；48 h后將未接種HCLV的細(xì)胞分別接PRV、TGEV、PEDV，接毒劑量為10 μL/孔，37 ℃ 5% CO2溫箱再培養(yǎng)24 h，并設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。然后按照豬瘟陽性血清和FITC標(biāo)記兔抗豬IgG熒光二抗最適工作濃度進(jìn)行IFA試驗(yàn)，觀察是否存在交叉反應(yīng)，以確定本方法的特異性。

1.5.2FITC標(biāo)記兔抗豬IgG熒光二抗特異性試驗(yàn)。按照1.5.1方法進(jìn)行HCLV培養(yǎng)，以PBS代替豬瘟陽性血清，按照FITC標(biāo)記兔IgG抗豬熒光二抗最適工作濃度進(jìn)行IFA試驗(yàn)，并設(shè)未加二抗的病毒對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照，觀察有無非特異性熒光產(chǎn)生。1.6 豬瘟疫苗樣品毒價(jià)測(cè)定。利用上述IFA方法，對(duì)牛睪丸細(xì)胞制備的豬瘟疫苗半成品（PCR檢測(cè)無外源病毒污染）進(jìn)行毒價(jià)測(cè)定，并利用SPSS進(jìn)行回歸分析，建立TCID50與兔體感染量（Rabbit infection dose， RID）之間的線性關(guān)系。

2　結(jié)果

2.1IFA試驗(yàn)條件優(yōu)化

2.1.1不同有機(jī)溶劑的選擇。從細(xì)胞固定效果來看，甲醇腐蝕性較小，固定后細(xì)胞形態(tài)較為完整；從染色亮度來看，甲醇、丙酮和丙酮溶液IFA染色亮度略好于其他有機(jī)溶劑；從使用的方便性來看，甲醇較好，且甲醇比丙酮對(duì)操作者呼吸道刺激小。綜合考慮，選取冷甲醇對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定最佳。不同有機(jī)溶劑對(duì)豬瘟接毒ST細(xì)胞的固定效果如圖1所示。

圖1　不同有機(jī)溶劑對(duì)接種豬瘟的ST細(xì)胞的固定效果

2.1.2IFA一抗的篩選。鏡檢結(jié)果顯示，豬瘟活疫苗檢驗(yàn)用陽性血清染色效果較好，胞漿染色明顯，細(xì)胞形態(tài)清晰，熒光亮度較好，其它一抗染色效果則較差。如圖2所示。

2.1.3豬瘟活 疫苗檢驗(yàn)用陽性血清最適工作濃度的確定。 根據(jù)鏡檢結(jié)果，當(dāng)一抗?jié)舛仍?∶20～1∶640時(shí)，均可觀察到特異性熒光，但熒光亮度從1∶80倍開始逐漸減弱，為保證每次染色效果及試驗(yàn)的可重復(fù)性，選取1∶40倍稀釋作為一抗最適工作濃度。IFA染色結(jié)果如圖3所示。

圖2　不同一抗IFA染色結(jié)果

圖3　一抗不同稀釋倍數(shù)IFA染色結(jié)果

2.1.4最佳染色時(shí)間的確定。根據(jù)IFA染色結(jié)果，接毒后24 h未見特異性熒光；接毒后36 h、48 h可見較小的特異性熒光斑；接毒后72 h，熒光達(dá)到最亮；接毒后96 h，熒光亮度略有下降，且死細(xì)胞有所增加。因此，最佳染色時(shí)間定在接毒后72～96 h。不同時(shí)間IFA染色效果如圖4所示。

圖4　接豬瘟病毒后不同時(shí)間IFA染色結(jié)果

2.2IFA特異性試驗(yàn)

2.2.1不同病毒抗原交叉反應(yīng)試驗(yàn)。鏡檢結(jié)果顯示，接種HCLV、PRV、TGEV、PEDV的ST細(xì)胞進(jìn)行IFA，除接種HCLV的ST細(xì)胞具有明顯特異性的綠色熒光外，接種其他3種病毒的ST細(xì)胞均未見特異性熒光染色，表明所建立的HCLV IFA檢測(cè)方法與其他病毒感染細(xì)胞無交叉反應(yīng)，具有較好的特異性。PRV、TGEV、PEDV感染細(xì)胞IFA染色結(jié)果如圖5所示。

圖5　不同病毒接ST細(xì)胞IFA染色結(jié)果

2.2.2FITC標(biāo)記兔抗豬IgG熒光二抗特異性試驗(yàn)。鏡檢結(jié)果顯示，PBS取代一抗進(jìn)行IFA試驗(yàn)，無特異性熒光，表明二抗具有較好的特異性。

2.3豬瘟疫苗半成品毒價(jià)測(cè)定結(jié)果。利用所建立的IFA方法，對(duì)牛睪丸細(xì)胞制備的豬瘟疫苗半成品進(jìn)行毒價(jià)測(cè)定，并利用SPSS建立TCID50與RID之間的擬合線性回歸方程，R2=0.996，線性關(guān)系較好，其數(shù)量關(guān)系為y=2.783x+110 107.213，即RID/ mL=2.783TCID50/mL +110 107.213具體結(jié)果見表1。

表1　豬瘟疫苗半成品毒價(jià)測(cè)定結(jié)果

3　討論

豬瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）是我國研制的優(yōu)秀疫苗，是國家豬病防治計(jì)劃中強(qiáng)制免疫所用疫苗，對(duì)于我國豬瘟的防控起著重要作用。目前，商品化的豬瘟疫苗品類較多，包括乳兔組織苗、脾淋苗、細(xì)胞苗，并以細(xì)胞苗占據(jù)主導(dǎo)地位。不同疫苗之間效價(jià)差別較大，給豬瘟疫苗質(zhì)量控制，包括病毒含量測(cè)定帶來諸多不便。因此，建立豬瘟疫苗的快速檢測(cè)方法尤為必要。

HCLV在多種細(xì)胞上增殖，包括牛睪丸細(xì)胞、ST細(xì)胞、PK15細(xì)胞等，但不引起細(xì)胞病變。除傳統(tǒng)的RID的方法外，科研人員還建立了其他一些快速檢測(cè)方法，如RT-PCR方法、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法［6-7］、ELISA方法［8］等，也進(jìn)一步探索了這些方法與RID之間的關(guān)系，但由于無法反映有效病毒含量，無法有效推廣。隨著HCLV抗體技術(shù)的發(fā)展，單克隆抗體、兔源陽性血清等被應(yīng)用于IFA方法中［9-10］。該方法可檢測(cè)豬瘟疫苗中有效病毒含量，可重復(fù)性好，可替代RID方法，成為HCLV病毒含量測(cè)定方法，為進(jìn)一步控制和提高豬瘟疫苗質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)。

本研究建立的IFA方法，進(jìn)一步明確了細(xì)胞固定所用的有機(jī)溶劑，并且所選一抗為疫苗檢驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，具有 標(biāo)準(zhǔn)的制備方法，可進(jìn)一步降低檢測(cè)費(fèi)用。在以PCR方法進(jìn)行特異性檢測(cè)的同時(shí)，利用 該法對(duì)商品化豬瘟疫苗進(jìn)行病毒含量的測(cè)定，與RID效價(jià)具有較好的線性關(guān)系，為該方法的應(yīng)用進(jìn)一步奠定了基礎(chǔ)。

［1］ 斯特勞，阿萊爾，蒙家林，等. 豬病學(xué)［M］. 趙德明，張仲秋，沈建忠，等譯. 9版. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2008.

［2］ Edwards S，F(xiàn)ukusho A，Lefèvre P C，et al. Classical swine fever： the global situation ［J］. Vet Microbiol， 2000，73（2/3）：103-119.

［3］ 仇華吉，童光志，沈榮顯. 豬瘟兔化弱毒疫苗——半個(gè)世紀(jì)的回顧［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（8）：1675-1685.

［4］ 中國獸藥典委員會(huì).中華人民共和國獸藥典：2010年版三部［M］. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010.

［5］ 崔尚金，全滟平，李曦，等. 豬圓環(huán)病毒間接免疫熒光方法的建立［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007（1）：63-66.

［6］ 鄧力，張彥明，李維維，等. 豬瘟兔化弱毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011（2）：1-8.

［7］ 葛葉，張興娟，朱慶虎，等. 熒光定量RT-PCR方法與兔體定型熱試驗(yàn)對(duì)于檢測(cè)豬瘟兔化弱毒疫苗的平行關(guān)系［J］. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011（9）：699-703.

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［10］ 戴志紅，蔣卉，李翠，等. 用間接免疫熒光檢測(cè)方法評(píng)價(jià)豬瘟兔化弱毒活疫苗效力的研究［J］. 中國獸藥雜志，2014（1）34-37.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Establishment of an Indirect Immunofl uorescence Assay for HCLV Titer Detection

Niu Chengming1，2，Yao Jing3，Yang Lingzhi1，2，Yang Qin1，2，Ma Jingxia4，Zhu Jie
（1. Shandong Binzhou Wohua Biotech Co.，Ltd.，Binzhou，Shandong 256606；2. Shandong Engineering Laboratory of Animal Pathogenic Microbiology，Binzhou，Shandong 256606；3. Binzhou Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Binzhou，Shandong 256603；4. Binzhou Animal Husbandry and Veterinary Bureau，Binzhou，Shandong 256600）

An indirect immunofluorescence assay（IFA）was developed for detecting HCLV titer rapidly and effectively by using the positive serum of classical swine fever（CSF）as the first antibody and the fluorescein isothiocyanated（FITC）labeled rabbit anti-pig IgG as the second antibody. Results showed the optimum working concentration of the fi rst antibody was 1∶40，and the dilution ratio of second antibody was 1∶32. The IFA displayed clear and specifi c fl uorescence in ST cells inoculated with hog cholera lapinized virus（HCLV）utilizing the above mentioned method，while negative results were obtained in ST cells inoculated with pseudorabies virus （PRV），porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）and transmissible gastroenteritis virus（TGEV）. Detection for different CSF semi-finished vaccines showed good correlation between Rabbit infection dose（RID）tested with rabbits and 50% tissue culture infective dose（TCID50）tested with IFA，and the fitted curve was RID/mL=2.783TCID50/ mL+110107.213.

hog cholera lapinized virus（HCLV）；indirect immunofl uorescence assay；rabbit infection dose

S851.3

B

1005-944X（2016）10-0086-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.10.022