王建華，陳小金，張俊哲，王玉玲，肖　妍，趙　丹，譚旭菲，王乃福，陳本龍，董志珍，趙祥平

（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物與食品檢測中心，天津　300456）

H1和H3亞型豬流感病毒二重TaqMan-MGB探針熒光RT-PCR檢測方法的建立

王建華，陳小金，張俊哲，王玉玲，肖妍，趙丹，譚旭菲，王乃福，陳本龍，董志珍，趙祥平

（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物與食品檢測中心，天津300456）

根據(jù)H1和H3亞型豬流感病毒（SIV）血凝素（HA）編碼基因的保守序列，分別設(shè)計(jì)合成特異性引物和TaqMan-MGB探針，建立了一種檢測H1和H3亞型SIV的二重?zé)晒釸T-PCR方法。結(jié)果顯示，該方法僅對H1和H3亞型SIV呈特異性擴(kuò)增，對H9亞型SIV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（SFV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）無交叉擴(kuò)增反應(yīng)；用該方法檢測H1和H3亞型SIV的HA基因的 RNA標(biāo)準(zhǔn)對照（SIV-H1-RNA，SIV-H3-RNA），最適線性檢測范圍分別為3.7×101～3.7×108拷貝數(shù)/反應(yīng)和3.4×100～3.4×108拷貝數(shù)/反應(yīng)，最低檢出限分別為38和34個(gè)拷貝數(shù)；該方法的組內(nèi)試驗(yàn)和組間試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于2.0%，顯示其具有良好的可重復(fù)性。用該方法對520份進(jìn)口豬的鼻拭子樣本和78份國內(nèi)豬鼻拭子樣本進(jìn)行SIV檢測發(fā)現(xiàn)，進(jìn)口豬鼻拭子樣本的SIV檢測結(jié)果均為陰性，12份國內(nèi)豬鼻拭子樣本的H1亞型SIV檢測結(jié)果為陽性，5份國內(nèi)豬鼻拭子樣本的H3亞型SIV檢測結(jié)果為陽性。本方法的建立為H1和H3亞型SIV檢測提供了一種快速、敏感和特異的技術(shù)手段。

豬流感病毒；H1亞型；H3亞型；TaqMan探針；熒光RT-PCR

豬流感（Swine Infl uenza，SI）是由A型豬流感病毒（SIV）引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性和群發(fā)性呼吸道疾病，臨床上以高熱、厭食、咳嗽、呼吸困難和懷孕母豬繁殖障礙為典型表現(xiàn)［1］。SI廣泛流行于全球各主要養(yǎng)豬國家和地區(qū)。目前我國規(guī)?；B(yǎng)豬場的H1N1和H3N2亞型SIV流行和危害比較嚴(yán)重且難以根除［2-4］，需加強(qiáng)對國內(nèi)豬群SIV的監(jiān)測、流行病學(xué)調(diào)查與防控技術(shù)研究，以及對國外進(jìn)口種豬的SIV檢疫工作。目前診斷SI的常規(guī)方法是采用雞胚進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，繼而對培養(yǎng)物進(jìn)行血凝及血凝抑制試驗(yàn)，存在操作繁瑣和診斷周期長等不足［5］。近年來實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)以其靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測快速等優(yōu)點(diǎn)已被用于SIV核酸的檢測［6-8］。本研究基于H1和H3亞型SIV的HA基因保守序列，建立了一種檢測H1和H3亞型SIV的二重?zé)晒釸T-PCR檢測方法。

1　材料與方法

1.1病毒核酸及臨床樣本

H1、H3和H9亞型的SIV核酸，豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（SFV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）的核酸，由天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物與食品檢測中心動物檢疫實(shí)驗(yàn)室保存。2012—2015年期間保存的520份豬鼻拭子樣本（來自美國和丹麥進(jìn)口豬）和78份國內(nèi)豬鼻拭子樣本（來自國內(nèi)豬場的疑似病豬）。

1.2主要儀器與試劑

Light Cycler? 480熒光PCR（Rochi）、5417R EPPENDORF冷凍離心機(jī)和ESCO CLASS Ⅱ BSC生物安全柜；TRIzol LS Reagent 購自Invetrogent公司；TaKaRa ExTaqRDNA 聚合酶、PstI 限制性內(nèi)切酶、One Step PrimeScript? RT-PCR Kit（Perfect Real Time），購自大連寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒快速提取試劑盒，購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System、RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System T7，購自Promega公司。其他試劑均為國內(nèi)或進(jìn)口分析純試劑。

1.3引物及探針的設(shè)計(jì)與合成

從GenBank數(shù)據(jù)庫（http∶//www.ncbi.nlm.nih. gov/）下載H1和H3亞型SIV的HA基因序列，進(jìn)行生物學(xué)信息分析，選出高度保守且特異的區(qū)域，用Beacon Designer 7.0軟件設(shè)計(jì)特異引物和TaqMan-MGB探針，由上海百力格生物技術(shù)有限公司合成。針對HA基因的探針序列5′端用FAM標(biāo)記，3′端用MGB標(biāo)記；針對H3基因的探針序列5′端用NED標(biāo)記，3′端用MGB標(biāo)記；預(yù)期擴(kuò)增片段長度分別為74 bp和87 bp。引物和探針序列見表1 。

表1　用于檢測H1和H3亞型SIV的HA基因的引物與探針序列

1.4RNA標(biāo)準(zhǔn)對照制備

根據(jù)H1和H3亞型SIV的HA基因序列（KP336278、KM061018 ）各自設(shè)計(jì)4條寡核酸鏈，用于RNA標(biāo)準(zhǔn)對照的制備，序列見表2。以SIV-H1-M1/ SIV-H1-M2為模板、SIV-H1-F2/ SIVH1-R2為引物，按常規(guī)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增；將擴(kuò)增產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收，與PCR2.1克隆載體連接，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞；挑選陽性重組克隆，由上海英駿生物技術(shù)有限公司測序鑒定。以經(jīng)PstⅠ酶切線性化的陽性重組質(zhì)粒DNA為模板，采用RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7試劑盒，按說明書進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；對獲得的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行RQ1 DNA酶消化及純化后即制備成含有H1亞型SIV HA基因靶序列的RNA標(biāo)準(zhǔn)對照，命名為SIV-H1-RNA。用核酸蛋白分析儀測定NiV-M-RNA的濃度，按公式y(tǒng)（copies/μL）= ［x（g/μL）RNA/（transcript length in nucleotides×340）］×6.02×1023，換算其拷貝數(shù)。以SIV-H3-M1/SIV-H3-M2為模板、SIV-H3-F2/SIVH3-R2為引物，按常規(guī)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。按同法制備含有H3亞型SIV HA基因靶序列的RNA標(biāo)準(zhǔn)對照，命名為SIV-H3-RNA，并換算其拷貝數(shù)。

表2　用于制備RNA標(biāo)準(zhǔn)對照的寡核酸鏈

1.5總RNA提取

按常規(guī)TROZOL試劑方法操作，提取樣本的總RNA， 并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6二重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

采用 One Step PrimeScript? RT-PCR Kit（Perfect Real Time）試劑，在Light Cycler? 480熒光PCR（Rochi）儀上，首先確定SIV-H1-RNA（4.6×106copies /μL）和SIV-H3-RNA（4.1×106copies /μL）單一熒光RT-PCR反應(yīng)的最適引物和探針濃度，然后對25 μL二重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)體系下的混合引物和探針濃度以及56～61 ℃范圍內(nèi)的退火延伸溫度做進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)，以確定最適的反應(yīng)條件。

1.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

對SIV-H1-RNA和SIV-H3-RNA進(jìn)行10倍系列稀釋，使其濃度范圍分別為3.7×101～3.7×107copies/μL和3.4×100～3.4×108copies/μL。在優(yōu)化的25 μL二重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)條件下，對每個(gè)稀釋度的SIV-H1-RNA 吸取1 μL為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，以Ct值為橫坐標(biāo)、SIV-H1-RNA模板起始拷貝數(shù)濃度的對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制定量標(biāo)準(zhǔn)曲線；按同法繪制SIV-H3-RNA的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8敏感性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)和特異性試驗(yàn)

對濃度范圍為3.7×101～3.7×107copies /μL的SIV-H1-RNA和 3.4×100～3.4×108copies /μL的SIV-H3-RNA，分別吸取1 μL按1.6優(yōu)化反應(yīng)條件進(jìn)行試驗(yàn)，以確定該方法可以檢測SIV-H1-RNA和SIV-H3-RNA的最低拷貝數(shù)。對3個(gè)濃度的SIVH1-RNA 和SIV-H3-RNA 分別取1 μL為模板，分別進(jìn)行組內(nèi)試驗(yàn)和組間試驗(yàn)，以確定該方法的重復(fù)性。以H1亞型、H3亞型和H9亞型的SIV核酸，以及PRRSV、SFV、PEDV和TGEV的核酸為模板，按1.6優(yōu)化反應(yīng)條件進(jìn)行試驗(yàn)，以確定該方法的特異性。

1.9臨床樣本檢測

對2012—2015年期間保存的598份豬鼻拭子樣本，采用本研究建立的二重?zé)晒釸T-PCR方法進(jìn)行H1和H3亞型SIV核酸檢測，以評價(jià)該方法的實(shí)用性。當(dāng)Ct值小于35時(shí)判定為陽性，Ct值在35～40之間的判定為可疑，如重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果的Ct值仍在35～40之間時(shí)判定為陰性，無Ct值時(shí)判定為陰性。

2　結(jié)果

2.1熒光RT-PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

以SIV-H1-RNA（4.6×106copies /μL）和SIVH3-RNA（4.1×106copies /μL）為模板，通過對不同濃度組合的引物和標(biāo)記探針以及56～61 ℃范圍內(nèi)退火延伸溫度的優(yōu)化試驗(yàn)，最終確定的二重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)體系為：在25 μL反應(yīng)體系中，依次加入2×One Step RT-PCR bufferⅢ 12.5 μL，TaKaRa Ex TaqHS （5 U/μL）0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ 0.5 μL，SIV-H1-F（10 pmmol/ μL）、SIV-H1-R（10 pmmol/μL）、SIV-H1-P（4 pmmol/μL）SIV-H3-F（10 pmmol/μL）、SIV-H3-R（10 pmmol/μL） 和SIV-H3-P（4 pmmol/μL） 各0.5 μL，模板適量，補(bǔ)足水至25 μL。反應(yīng)參數(shù)為42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 sec，然后95 ℃ 10 sec，60 ℃30 sec，45個(gè)循環(huán)。在每一次循環(huán)的60 ℃延伸擴(kuò)增，結(jié)束前，采集FAM和NED通道的熒光信號。在最適反應(yīng)條件下，對SIV-H1-RNA和SIV-H3-RNA進(jìn)行擴(kuò)增呈現(xiàn)典型的S型熒光定量PCR反應(yīng)動力學(xué)擴(kuò)增曲線（圖1）。

圖1　二重?zé)晒釸T-PCR動力學(xué)曲線

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的的繪制

對10倍系列稀釋的SIV-H1-RNA和SIV-H3-RNA，按優(yōu)化后的二重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行檢測， 擴(kuò)增曲線見圖2-A和圖2-B；以起始模板濃度的對數(shù)為X軸，Ct 值為Y軸繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2-C、圖2-D。對SIV-H1-RNA的定量檢測的線性范圍為3.7×101～3.7×108copies /μL，線性關(guān)系表達(dá)式為Y= -3.311 4X+32.244，相關(guān)系數(shù)（R2）為0. 999 4。對SIV-H3-RNA的定量檢測的線性范圍為3.4×101～3.4×108copies /μL，線性關(guān)系表達(dá)式為Y= -3.308 2X+36.936，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999 6。

2.3敏感性試驗(yàn)

對SIV-H1-RNA（3.7×101～3.7×108copies /μL）和SIV-H3-RNA（3.4×101～3.4×108copies /μL），按優(yōu)化后的二重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行檢測，擴(kuò)增曲線見圖2-A和圖2-B。由圖2可知，該方法最低可檢出37個(gè)拷貝的SIV-H1-RNA分子和34個(gè)拷貝的SIV-H3-RNA分子。

2.4重復(fù)性試驗(yàn)

分別選取3個(gè)濃度的SIV-H1-RNA和SIVH3-RNA標(biāo)準(zhǔn)對照為模板，按優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)試驗(yàn)，每個(gè)稀釋度的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）及變異系數(shù)（CV）見表3和表4。3個(gè)濃度的RNA標(biāo)準(zhǔn)對照的Ct值變異系數(shù)均小于2.0%，表明本試驗(yàn)所建立的二重?zé)晒釸T-PCR檢測體系穩(wěn)定，具有良好的重復(fù)性。

圖2　SIV-H1-RNA和SIV-H3-RNA的二重?zé)晒釸T-PCR試驗(yàn)的敏感性和標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3　SIV-H1-RNA標(biāo)準(zhǔn)對照實(shí)時(shí)熒光RT-PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表4　SIV-H3-RNA標(biāo)準(zhǔn)對照實(shí)時(shí)熒光RT-PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.5特異性試驗(yàn)

應(yīng)用本試驗(yàn)建立的二重?zé)晒釸T-PCR方法，對H1、H3和H9亞型的SIV核酸，以及PRRSV、SFV、PEDV和TGEV的核酸進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖3。由圖3可知，僅H1和H3亞型SIV出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，而H9亞型的SIV核酸以及PRSSV、CSFV、PEDV和PGEV均無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，表明該方法檢測H1和H3亞型 SIV核酸有良好的特異性。

2.6臨床樣本的檢測

對2012—2015年保存的520份進(jìn)口豬的鼻拭子樣本（組A）和78份國內(nèi)豬場豬鼻拭子樣本（組B），用本研究建立的二重?zé)晒釸T-PCR方法進(jìn)行H1和H3亞型SIV檢測，結(jié)果見表5。由表5可知，520份進(jìn)口豬鼻拭子樣本的SIV檢測結(jié)果均為陰性，在78份采自國內(nèi)豬場豬鼻拭子樣本中，有12份為H1亞型SIV檢測結(jié)果陽性，有5份為H3亞型SIV檢測結(jié)果陽性。

圖3　二重?zé)晒釸T-PCR檢測H1、H3亞型SIV的特異性

表5　598份實(shí)際樣本的H1和H3亞型SIV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測結(jié)果

3　討論

近年來，SIV因作為一種豬呼吸道疾病綜合癥的原發(fā)性病原和同時(shí)具有感染人和禽的潛力而日益受到重視。一方面SIV對豬呼吸道上皮的防御屏障破壞，極易導(dǎo)致豬發(fā)生PRRSV、PCV2、肺炎支原體和胸膜肺炎放線桿菌感染或繼發(fā)感染，從而延長病程和增高死亡率，對豬群危害極大［9］；另一方面，豬被認(rèn)為是人、禽和/或豬流感病毒通過基因重排產(chǎn)生新的亞型流感病毒的“混合器”［10］。因此，對豬群SIV感染的監(jiān)測及分子流行病學(xué)分析不僅可為調(diào)查豬呼吸道疾病綜合癥的病因及制定控制措施提供重要的病原學(xué)依據(jù)，而且在預(yù)防和朔源人類流感流行方面具有重要的公共衛(wèi)生意義。與傳統(tǒng)的檢測SIV的雞胚病毒分離方法和血凝抑制試驗(yàn)相比較，應(yīng)用熒光RT-PCR檢測SIV核酸具有快速而敏感的優(yōu)勢。目前國內(nèi)研究人員已報(bào)道了多種檢測SIV的熒光RT-PCR［6-8］。根據(jù)H1和H3亞型SIV的HA基因保守序列，本研究建立了一種同時(shí)檢測H1和H3亞型SIV核酸的TaqMan 探針二重?zé)晒釸T-PCR檢測方法。試驗(yàn)結(jié)果表明該方法具有良好的特異性，僅對H1和H3亞型SIV核酸呈特異性擴(kuò)增，對豬的其他常見病毒無交叉擴(kuò)增反應(yīng)，該方法對標(biāo)準(zhǔn)對照SIV-H1-RNA和SIV-H3-RNA最低可分別檢出37和34個(gè)拷貝數(shù)，并顯示出良好的定量線性關(guān)系和重復(fù)性。通過對520份進(jìn)口豬的鼻拭子樣本和78份國內(nèi)豬場豬鼻拭子樣本的實(shí)際檢測試驗(yàn)，表明本研究建立的二重?zé)晒釸T-PCR 檢測方法可用于臨床樣本中H1和H3亞型SIV的檢測。

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Development of a Duplex TaqMan-MGB Real-time RT-PCR Assay for Detecting H1 and H3 Subtype Swine Infl uenza Virus

Wang Jianhua，Chen Xiaojin，Zhang Junzhe，Wang Yuling，Xiao Yan，Zhao Dan，Tan Xufei，Wang Naifu，Chen Benlong，Dong Zhizhen，Zhao Xiaoping
（The Animals and Plants and Food Inspection Center of Tianjin Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300456）

Absract：A Taqman-MGB probe duplex real-time RT-PCR was developed to detect H1 and H3 subtype swine infl uenza virus（SIV）. Two pairs of primers and probes were designed according to the conserved regions of HA gene sequences of H1 and H3 subtype. The assay was specifi c to detect subtype H1 and H3 SIV，but had no cross-reaction with H9N2 subtype SIV，classical swine fever virus（CSFV），porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV），porcine epidemic diarrhea virus （PEDV）and transmissible gastroenteritis virus（TGEV）. The assay has a broad linear detection range from 3.7×101copies/μL to 3.7×108copies/μL for RNA standard control of hemagglutinin（HA）of H1 subtype（SIV-H1-RNA）and 3.4×101copies/μL to 3.4×108copies/μL for RNA standard contol of HA of H3 subtype（SIV-H3-RNA），respectively. The detection limit of the assay was 37 copies for the SIV-H1-RNA and 34 copies for the SIV-H3-RNA，respectively. The coeffi cients of variation（CVs）of both inter-assay and intra-assay were less than 2.0 %，showing good reproducibility. 598 nasal swab samples were tested for subtype H1 and H3 detection by the assay. No positive H1 and H3 subtype reaction was found for all 528 samples from imported pigs. 12 and 7 of 78 nasal swab samples of domestic pigs were found to be positive for H1 and H3 respectively. In short，the development of this assay offers a useful method for the simultaneous detection of subtype H1 and H3 SIV in clinical specimens from the pigs.

swine infl uenza virus；subtype H1；subtype H3；TaqMan probe；duplex real-time RT-PCR

S852.65

B

1005-944X（2016）10-0090-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.10.023

天津市科技支撐項(xiàng)目（13ZCZDNCO1300）；天津市濱海新區(qū)惠民項(xiàng)目（2013-BK15H013）

（責(zé)任編輯：朱迪國）