駱曉蕾，郭龍軍，谷偉紅，馮力，王玉娥

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150001）

緊密連接蛋白o(hù)ccludin和claudin-1在豬機(jī)體不同組織的分布研究

駱曉蕾，郭龍軍，谷偉紅，馮力，王玉娥

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150001）

緊密連接蛋白有維持上皮屏障完整性的功能，主要的組成蛋白有occludin和claudin-1。為研究豬體內(nèi)緊密連接蛋白o(hù)ccludin和claudin-1的表達(dá)分布情況，首先用GenBank中發(fā)表的豬源occludin和claudin-1的序列，設(shè)計(jì)并合成了針對(duì)occludin和claudin-1的特異性引物，然后從無(wú)特定病原（SPF）豬體不同組織中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用半定量方法測(cè)定SPF豬不同組織緊密連接蛋白的mRNA水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，occludin和claudin-1在不同組織的分布存在差異。進(jìn)一步測(cè)序發(fā)現(xiàn)，occludin序列相對(duì)保守，而claudin-1則變異較大。

緊密連接蛋白；claudin-1；occludin

緊密連接蛋白是廣泛存在于上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的細(xì)胞連接復(fù)合體［1］，其功能是封閉細(xì)胞間隙，阻止上皮層內(nèi)外物質(zhì)的自由進(jìn)出，是上皮細(xì)胞選擇通透作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，緊密連接蛋白在生理狀態(tài)下通過(guò)調(diào)控作用，能有效的阻止腸腔內(nèi)細(xì)菌、毒素等物質(zhì)的胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)，維持上皮屏障功能的完整［2］。緊密連接蛋白為多種蛋白相互作用下形成的復(fù)合結(jié)構(gòu)［3］，主要由跨膜蛋白和胞質(zhì)蛋白組成，其中主要跨膜蛋白有occludin和claudin-1等，occludin和claudin-1都是四次跨膜蛋白，有兩個(gè)胞外環(huán)，結(jié)構(gòu)十分相似［4］。occludin是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的膜內(nèi)緊密連接蛋白，其在細(xì)胞膜上分布最廣，在細(xì)胞間主要發(fā)揮粘附分子的作用，具有維持和調(diào)節(jié)緊密連接蛋白屏障功能［5］。緊密連接蛋白另一個(gè)重要的組成蛋白claudins是一個(gè)多基因家族，不同的claudins成員在不同的組織細(xì)胞中的分布和功能具有差異性，主要有細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)細(xì)胞連接處選擇滲透性的功能［6］。緊密連接蛋白表達(dá)及分布的異常與很多疾病都相關(guān)，occludin和claudin-1功能的多樣性也許與他們的組織特異性有關(guān)，目前還沒(méi)有關(guān)于occludin和claudin-1在正常豬體不同組織分布情況的研究，本研究主要檢測(cè)了這兩種緊密連接蛋白在豬體不同組織分布情況，為occludin和claudin-1在不同組織的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)試劑Golden MLV Reverse Transcriptase，購(gòu)自海基生物科技有限公司；T4 DNA連接酶、TaKaRa LA Taq和Premix Taq，均購(gòu)自于TaKa-Ra生物科技有限公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒小劑量提取試劑盒，購(gòu)自于AXYGEN公司；LB、PBS試劑為自己實(shí)驗(yàn)室配制；瓊脂，購(gòu)自于BIOWEST公司。

1.2實(shí)驗(yàn)器材電子天平，購(gòu)自Sartorius公司；PCR儀器，購(gòu)自SENSQUEST公司；小型離心機(jī)、和-80冷藏箱，均購(gòu)自Thermo公司；DK-8D型電熱恒溫水箱是由上海一恒科技有限公司生產(chǎn)；醫(yī)用冷藏箱、醫(yī)用低溫保存箱，均購(gòu)自海爾公司；Allegra X-22R離心機(jī)，購(gòu)自BECKMAN公司；HDL潔凈工作臺(tái)由北京哈文制造公司制造；生化培養(yǎng)箱，購(gòu)自Blue pard公司；WD-9405B型水平搖床、DYY-6C型電泳儀，購(gòu)自北京六一儀器廠；UV tuansilluminator，購(gòu)自WEALTEC公司。

1.3RNA的提取取SPF豬的肝、心、脾、肺、腎等15種不同組織加PBS研磨后將組織研磨混合液放-80℃儲(chǔ)存后反復(fù)凍融3次，取不同組織研磨液提取總RNA，置-80℃保存。

1.4RNA的反轉(zhuǎn)錄以SPF豬不同組織的總RNA為模板，Oligo d（T）為引物反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，其反應(yīng)體系及反轉(zhuǎn)錄條件如表1所示，反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA可直接用于PCR反應(yīng)。

1.5引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增根據(jù)GenBank中的豬源occludin和claudin-1全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)特異性引物（表2），以提取的豬不同組織總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板擴(kuò)增occludin和claudin-1的編碼序列，PCR產(chǎn)物純化回收后克隆到pMD18-T載體上，經(jīng)過(guò)PCR和雙酶切鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒由上海華大基因科技股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

表1cDNA反轉(zhuǎn)錄體系及反應(yīng)條件

表2PCR引物

1.6半定量PCR法測(cè)定occludin和claudin-1在豬不同組織的分布情況根據(jù)全長(zhǎng)序列，用Oligo 7軟件設(shè)計(jì)occludin和claudin-1的定量引物以及內(nèi)參β-actin如表3所示，并根據(jù)半定量PCR的方法測(cè)定這兩種蛋白在豬不同組織中的mRNA水平。豬的不同組織分別取自3只不同的SPF豬，試驗(yàn)結(jié)果均獨(dú)立重復(fù)3次而得出，試驗(yàn)結(jié)果用軟件Image J進(jìn)行分析。

表3定量PCR引物

2結(jié)果

2.1用半定量RT-PCR測(cè)定occludin和claudin-1在豬不同組織中的mRNA水平從SPF豬不同組織，如肝、心、脾、肺、腎、不同腸段等，分別提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用設(shè)計(jì)的特異性針對(duì)occludin、claudin-1以及內(nèi)參β-actin的定量引物以cDNA為模板進(jìn)行半定量PCR，結(jié)果表明，occludin和claudin-1在不同組織的分布存在差異。緊密連接蛋白o(hù)ccludin在肝、脾、肺、腦、十二指腸、回腸、腮腺等組織中含量較高，在淋巴結(jié)和胸腺中含量較低，claudin-1在肝、肺、腎、十二指腸、腮腺中含量較高，在淋巴結(jié)和胸腺中含量較低。以上結(jié)果表明，兩者均在部分腸段和一些實(shí)體組織，如：肝、肺、腎等組織中mRNA水平較高，在淋巴結(jié)和一些腺體等免疫組織中含量較低。見(jiàn)圖1和圖2。

2.2豬源不同組織中occludin和claudin-1全長(zhǎng)序列比對(duì)結(jié)果從SPF豬體不同組織，如肝、心、脾、肺、腎、不同腸段等，分別提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用設(shè)計(jì)針對(duì)occludin和claudin-1的全長(zhǎng)引物擴(kuò)增這兩種蛋白的編碼序列，并克隆到pMD18-T上，經(jīng)測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，occludin在豬體不同組織的分布相對(duì)保守，與GenBank中的序列無(wú)明顯差別，而claudin-1則變異較大，如圖3所示，在小腸和肝、脾等一些組織，claudin-1序列的第252個(gè)堿基G被替換成了A，第255位和257位堿基A和T分別被替換成了G和C，第298位和297位堿基T和G分別被替換成了C和A，第310位堿基T被替換成了A，并且在小腸和肝、脾、心、腮腺和淋巴結(jié)中存在部分堿基的缺失，這可能是claudin-1存在不同組織的突變體，這些突變體也許與claudin-1的組織特異性和功能有關(guān)。

圖1occludin在豬體不同組織的分布情況

圖2為claudin-1在豬體不同組織的分布情況

3討論

緊密連接蛋白創(chuàng)造了細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)屏障，具有維持細(xì)胞完整性的功能，緊密連接蛋白的異常表達(dá)可以增加細(xì)胞膜的滲透性，從而引起腸道等器官的疾病以及系統(tǒng)性疾病［7］，因此緊密連接蛋白的正常表達(dá)對(duì)于機(jī)體的生存至關(guān)重要。有研究表明，在正常情況下，緊密連接蛋白是構(gòu)成血腦屏障的重要組分，而occludin是大腦內(nèi)皮細(xì)胞的重要組分，維持血腦屏障的完整性，在人腦自發(fā)性顱內(nèi)出血的研究中，循環(huán)的和血液中的occludin表達(dá)水平明顯升高，因而occludin成為診斷該疾病的一個(gè)重要的生物指標(biāo)［8］；在各種癌癥中，與正常組織相比claudin-1的表達(dá)水平發(fā)生改變，而這種改變可以診斷一些癌癥的復(fù)發(fā)，因此，claudin-1可作為診斷癌癥復(fù)發(fā)的因素和藥物治療靶點(diǎn)［9］。有關(guān)人的緊密連接蛋白表達(dá)水平與疾病的聯(lián)系越來(lái)越多的被發(fā)現(xiàn)，而豬源的很少研究和報(bào)道，所以檢測(cè)正常豬體中緊密連接蛋白在不同組織中的正常水平可以為以后進(jìn)一步的功能研究奠定基礎(chǔ)。本研究表明，occludin在豬體各個(gè)組織中的存在形式比較保守，而在各個(gè)組織中的mRNA水平存在差異，說(shuō)明occludin在各個(gè)組織中功能的差異也許與它的含量存在一定的聯(lián)系；claudin-1在豬體各個(gè)組織中的含量和序列存在形式都存在差異，說(shuō)明claudin-1在各個(gè)組織的功能也許不僅與它的含量有關(guān)，還與它的存在形式有關(guān)。occludin和claudin-1在免疫細(xì)胞豐富的淋巴結(jié)和胸腺中的mRNA水平較低，在免疫細(xì)胞較少的肝、脾、腎和腦等一些實(shí)體組織中的含量較高，說(shuō)明緊密連接蛋白在這些實(shí)體組織中也許補(bǔ)償了免疫細(xì)胞的一些功能，對(duì)機(jī)體發(fā)揮著重要的屏障作用。

圖3豬不同組織中全長(zhǎng)claudin-1的測(cè)序結(jié)果

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Thedistribution of tight junction proteins occludin and claudin-1 in porcinedifferent tissues

LUO Xiao-lei，GUO Long-jun，GU Wei-hong，F(xiàn)ENG Li，WANG Yu-e
（State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150001，China）

Tight junctions are highly specialized membrane domains，which maintain the integrity of the epithelial barrier.The main components of tight junction proteins include occludin and claudin-1.To study the distribution of occludin and claudin-1 in porcine tissues，we designed specific primers according to the published sequences in GenBank.Total RNA was extracted from different SPF pig tissues，and then semi-quantitative RT-PCR was performed to measure both occludin and claudin-1 transcripts level from different porcine tissues.The results showed that the distribution of occludin and claudin-1 in porcine tissues was different. Full-length sequencing revealed that occludin was highly conserved among different tissues，while claudin-1 showed relative differences in tissue distribution.

Tight junction portines；occludin；claudin-1

WANG Yu-e

R 730.2

A

0529-6005（2016）08-0021-04

2016-01-18

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31572497）；黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LC201418）

駱曉蕾（1989-），女，碩士，主要從事動(dòng)物疫苗與分子免疫學(xué)研究，E-mail：1203765310@qq.com

王玉娥，E-mail：wangyue@caas.cn