楊　雪，劉翠晶，楊美英

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) a 生命科學(xué)學(xué)院，b 中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

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全基因組范圍禾本科植物GPX基因家族的進(jìn)化分析和表達(dá)模式研究

楊雪a，劉翠晶b，楊美英a

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) a 生命科學(xué)學(xué)院，b 中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

【目的】 研究禾本科植物谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)基因家族的序列及其在正常生長(zhǎng)和脅迫條件下的表達(dá)差異，為揭示GPX基因在植物抵抗逆境脅迫中的作用奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?利用生物信息學(xué)方法，分析水稻、短柄草、高粱中18個(gè)GPX基因的序列特點(diǎn)、基因結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系；采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法，分析18個(gè)GPX基因在正常生長(zhǎng)以及1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)、雙氧水(H2O2)、莠去津(Atrazine)和水楊酸(SA)處理后，水稻、短柄草和高粱的根、莖、成熟葉、幼葉、葉鞘，以及正常生長(zhǎng)條件下發(fā)芽2 d后幼苗根和芽中的表達(dá)情況。【結(jié)果】 從水稻、短柄草和高粱基因組中分別鑒定出6，5，7個(gè)GPX基因，這些基因編碼長(zhǎng)度為168～251個(gè)氨基酸的蛋白，分子質(zhì)量介于18.44～27.42 ku。系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)物種至少有7個(gè)最近的共同祖先GPX基因，物種分化之后水稻和短柄草分別丟失1個(gè)和2個(gè)GPX基因。序列相似性分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)物種GPX蛋白具有較高的序列相似性，介于38.0%～95.2%，且不同基因簇中GPX序列的分化速率不同。3個(gè)物種GPX基因具有保守的基因結(jié)構(gòu)，但SbGPX7發(fā)生了內(nèi)含子插入事件，預(yù)示著其與其他GPX基因之間功能的分化。表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)物種的18個(gè)GPX基因中有15個(gè)在所有檢測(cè)樣品中均為組成型表達(dá)，3個(gè)GPX基因(水稻2個(gè)、高粱1個(gè))為選擇性表達(dá)，表達(dá)模式的分化預(yù)示著功能的分化。【結(jié)論】 作為植物保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的重要酶類，禾本科3個(gè)物種的GPX基因在進(jìn)化過程中發(fā)生了功能分化。

谷胱甘肽過氧化物酶；禾本科；基因進(jìn)化分析；基因表達(dá)模式

植物體在光合作用和呼吸作用過程中會(huì)產(chǎn)生活性氧，生物和非生物脅迫也會(huì)促進(jìn)植物體產(chǎn)生活性氧，活性氧的不斷積累對(duì)生物體是有毒性的，大量的活性氧能夠破壞蛋白、脂質(zhì)和核酸等生物大分子[1-2]。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，植物已經(jīng)發(fā)展出有效的酶和非酶機(jī)制來保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，其中清除活性氧的酶類主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)等[2]。GPX是植物用來清除活性氧的重要酶類，它通過催化過氧化氫、有機(jī)氫過氧化物和脂質(zhì)過氧化物的還原來保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[3]。前人的研究還發(fā)現(xiàn)，GPX通過在氣孔關(guān)閉過程中作為傳感器介導(dǎo)脫落酸和過氧化氫信號(hào)傳導(dǎo)來調(diào)節(jié)植物的蒸騰作用，在植物響應(yīng)干旱脅迫過程中發(fā)揮著重要作用[4]。

在植物中，對(duì)GPX的研究主要集中于雙子葉植物上，如擬南芥、菠菜、番茄和煙草等[4-8]，對(duì)單子葉植物GPX的研究較少。禾本科是單子葉植物中的重要科，其中很多物種是重要的糧食作物，如小麥、玉米、高粱和水稻；有些是重要的牧草，如鴨茅、黑麥草、蘇丹草和短柄草等，但干旱、低溫等逆境脅迫限制了它們的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)。本研究以重要的糧食作物水稻(OryzasativaL.ssp.japonica)、優(yōu)良牧草短柄草(Brachypodiumdistachyon)及重要糧食作物和能源植物高粱(Sorghumbicolor)為研究材料，通過在水稻、短柄草和高粱全基因組[9-11]中搜索其GPX基因，對(duì)該基因家族的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系、序列特征、基因結(jié)構(gòu)及其在不同脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)模式進(jìn)行詳細(xì)分析，以期為深入揭示GPX基因在禾本科植物抵抗逆境脅迫中的作用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

總 RNA 提取試劑盒Aurum Total RNA Kit購(gòu)自Bio-Rad公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒RNA PCR Kit (AMV) version 3.0、TaqDNA聚合酶和其他PCR試劑購(gòu)自TaKaRa公司，雙氧水(H2O2)、1-氯-2,4-二硝基苯(1-chloro-2,4-dinitrobenzene，CDNB)、水楊酸(salicylic acid，SA)購(gòu)自Sigma公司，除草劑莠去津(Atrazine)購(gòu)自山東濱農(nóng)科技有限公司。

水稻、短柄草和高粱均采用基因組測(cè)序種，分別為OryzasativaL.ssp.japonica、Brachypodiumdistachyon和Sorghumbicolor。

1.2水稻、短柄草和高粱GPX基因序列的鑒定

以擬南芥的8個(gè)GPX蛋白序列為模板，利用TBLASTN檢索Phytozome v9.0 (http://www.phytozome.net/) 中水稻、短柄草和高粱的全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得與擬南芥8個(gè)GPX序列均具有較高相似性的序列。通過搜索3個(gè)物種的EST庫(kù)檢驗(yàn)獲得自動(dòng)注釋基因的剪接方式，對(duì)于無對(duì)應(yīng)EST的基因，通過與有EST基因的序列比對(duì)檢驗(yàn)基因的剪接方式。確認(rèn)拼接方式正確的基因序列，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi上進(jìn)行CDD 保守結(jié)構(gòu)域分析，分析其編碼蛋白是否具有保守的GPX結(jié)構(gòu)域。

1.3系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系和序列相似性分析

根據(jù)CDD預(yù)測(cè)的GPX結(jié)構(gòu)域，截取3個(gè)物種GPX基因中對(duì)應(yīng)GPX結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，在Bioedit中翻譯為氨基酸序列，然后進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，并進(jìn)行手動(dòng)調(diào)節(jié)，獲得氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果。將氨基酸序列反轉(zhuǎn)為核苷酸序列，利用MEGA 4.0中的neighbour-joining(NJ) 法以Kimura 2-parameter模型構(gòu)建進(jìn)化樹，Bootstrap值為1 000，外類群為EcGPX(Locus tag:UTI89_C1903)。將對(duì)比后的GPX蛋白序列在Alignment中生成序列相似性矩陣，獲得任意兩個(gè)基因所編碼蛋白的序列相似性。

1.4水稻、短柄草和高粱GPX基因的表達(dá)模式分析

為研究GPX基因在水稻、短柄草和高粱不同時(shí)期、不同部位中的表達(dá)特點(diǎn)，以及對(duì)不同脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，利用基因特異性RT-PCR引物擴(kuò)增目的片段。將測(cè)序種水稻和高粱種植在10 cm×10 cm的方盆中，30 ℃、光照14 h/黑暗10 h條件下，分別培養(yǎng)2個(gè)月和1個(gè)月，生長(zhǎng)至幼苗期；測(cè)序種短柄草種植在10 cm×10 cm的方盆中，23 ℃、光照14 h/黑暗10 h條件下培養(yǎng)1個(gè)月，生長(zhǎng)至幼苗期。對(duì)處于同一時(shí)期的水稻、高粱和短柄草植株，分別進(jìn)行1.0 mmol/L CDNB、體積分?jǐn)?shù)5.0% H2O2、體積分?jǐn)?shù)1.5% Atrazine和1.0 mmol/L SA澆灌根部、噴灑地上部處理，每種處理3個(gè)重復(fù)。經(jīng)CDNB、H2O2和Atrazine處理12 h以及SA處理24 h后，提取3種植物根、莖、成熟葉、幼葉和葉鞘總RNA；同時(shí)提取同一時(shí)期正常生長(zhǎng)的3種植物根、莖、成熟葉、幼葉和葉鞘總RNA，以及發(fā)芽2 d后幼苗根和芽總RNA。以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。序列比對(duì)后根據(jù)基因序列分別設(shè)計(jì)特異性引物 (表1)，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，模板cDNA上樣量為1 μL，以各物種Actin基因作為內(nèi)標(biāo)。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸3 min。PCR結(jié)束后進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳上樣量2 μL。為了進(jìn)一步驗(yàn)證所擴(kuò)增到的是否為目的基因，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

表 1　檢測(cè)水稻、短柄草和高粱GPX基因表達(dá)所用的引物Table 1　Primers used to detect expression of GPX genes in O.sativa,B.distachyon and S.bicolor

注：Os代表水稻，Bd代表短柄草，Sb代表高粱。下表同。

Note:Os,BdandSbrepresentO.sativa,B.distachyonandS.bicolor,respectively.The same below.

2　結(jié)果與分析

2.1水稻、短柄草和高粱GPX基因的序列挖掘

根據(jù)已知的8個(gè)擬南芥GPX蛋白序列，利用TBLASTN檢索Phytozome v9.0中水稻、短柄草和高粱的全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，分別從各物種全基因組中獲得6，5，7個(gè)與擬南芥GPX序列均具有較高相似性的蛋白序列。獲得序列經(jīng)過CDD保守結(jié)構(gòu)域分析，確定其編碼蛋白具有保守的GPX結(jié)構(gòu)域。

水稻的6個(gè)GPX基因分布于5條染色體上，編碼長(zhǎng)度為168～238個(gè)氨基酸的蛋白，蛋白分子質(zhì)量介于18.48～25.84 ku；短柄草的5個(gè)GPX基因分布于3條染色體上，編碼長(zhǎng)度為168～240個(gè)氨基酸的蛋白，蛋白分子質(zhì)量介于18.48～25.90 ku；高粱的7個(gè)GPX基因分布于4條染色體及1條未能組裝到染色體的片段(scaffold10)上，編碼長(zhǎng)度為168～251個(gè)氨基酸的蛋白，蛋白分子質(zhì)量介于18.44～27.42 ku(表2)。

表 2　水稻、短柄草和高粱基因組中鑒定出的GPX基因Table 2　GPX genes identified from O.sativa,B.distachyon and S.bicolor genome

注：-表示基因組未標(biāo)注。

Note:- represents the gene was not annotation in genome.

2.2水稻、短柄草和高粱GPX基因的命名及系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系分析

根據(jù)Margis等[2]的方法將水稻6個(gè)GPX基因分別命名為OsGPX1/2/3/4/5/6，以大腸桿菌GPX為外類群，對(duì)水稻、短柄草和高粱的GPX基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析，根據(jù)與水稻GPX基因的同源關(guān)系，將短柄草的5個(gè)GPX基因分別命名為BdGPX1/2/3/4/5，高粱的7個(gè)GPX基因分別命名為SbGPX1/2/3/4/5/6/7。

根據(jù)3個(gè)物種的系統(tǒng)發(fā)生樹，鑒定出代表水稻、短柄草和高粱最近共同祖先GPX基因的節(jié)點(diǎn)，這些節(jié)點(diǎn)都具有高的支持率(不小于87%)，如圖1中圓點(diǎn)所示，并且推斷這些節(jié)點(diǎn)代表了3個(gè)物種分化的節(jié)點(diǎn)，每個(gè)節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)水稻、短柄草和高粱的直系同源基因簇。例如，在a1基因簇中，包含OsGPX3、BdGPX3和SbGPX3基因，推測(cè)在3個(gè)物種分化前的祖先物種中存在1個(gè)這一簇所對(duì)應(yīng)的最近的共同祖先基因?；蚪M中也會(huì)發(fā)生基因丟失，因此某些祖先基因在祖先物種中存在，后來在物種分化后的某一物種中丟失，例如，在a5基因簇中，包含OsGPX5和SbGPX5基因，推測(cè)短柄草丟失了對(duì)應(yīng)的基因。根據(jù)鑒定出的直系同源基因簇?cái)?shù)目，推測(cè)這3個(gè)物種的祖先物種中至少存在7個(gè)GPX基因，而在3個(gè)物種分化之后，水稻、短柄草和高粱中都沒有發(fā)生GPX基因家族的擴(kuò)張，且水稻丟失了a2基因簇對(duì)應(yīng)的基因，短柄草丟失了a2和a5基因簇對(duì)應(yīng)的2個(gè)基因。

圖 1水稻、短柄草和高粱GPX基因的系統(tǒng)發(fā)生樹枝上的數(shù)字代表經(jīng)過1 000次重復(fù)算出的支持率(%)；圓點(diǎn)代表3個(gè)物種分化前最近的共同祖先基因

Fig.1Phylogenetic tree ofO.sativa,B.distachyonandS.bicolorGPXNumbers on branches indicate the bootstrap percentages calculated from 1 000 replicates.The nodes that represent the most recent common ancestral genes before theO.sativa,B.distachyonandS.bicolorsplit are indicated by black circles

2.3水稻、短柄草和高粱GPX蛋白序列的分析

分別分析3個(gè)物種中GPX蛋白的序列相似性，結(jié)果見表3。由表3可以看出，在水稻中，OsGPX2與OsGPX4之間的序列相似性最低，只有42.3%；OsGPX1與OsGPX5/6之間的序列相似性最高，為73.2%。在短柄草中，BdGPX2與BdGPX3之間的序列相似性最低，只有38.0%；BdGPX1與BdGPX5之間的序列相似性最高，為71.5%。在高粱中，SbGPX2與SbGPX3之間的序列相似性最低，只有43.6%；SbGPX1與SbGPX7之間的序列相似性最高，為80.4%。在3個(gè)物種的所有GPX中，BdGPX2與BdGPX3之間的序列相似性最低，為38.0%；OsGPX1與SbGPX1之間的序列相似性最高，為95.2%。

進(jìn)一步分析3個(gè)物種中直系同源基因(圖1中同一簇即為直系同源基因)的蛋白序列相似性(表3)可見，BdGPX3與SbGPX3的序列相似性最低，為65.7%；OsGPX1與SbGPX1的序列相似性最高，為95.2%。

表 3　水稻、短柄草和高粱GPX蛋白的序列相似性分析Table 3　GPX protein sequences identity of O.sativa,B.distachyon and S.bicolor

通過對(duì)3個(gè)物種GPX蛋白的序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在3個(gè)物種的所有GPX蛋白中，均存在3個(gè)保守的半胱氨酸(如圖2箭頭所示)，且在GPX結(jié)構(gòu)域區(qū)，GPX蛋白序列高度保守，序列相似性介于59.8%～97.4%，而在非結(jié)構(gòu)域區(qū)，序列差異則較大。

圖 2水稻、短柄草和高粱GPX蛋白序列的比對(duì)分析

在所有GPX蛋白中均保守的氨基酸殘基用黑色背景標(biāo)示;GPX蛋白的3個(gè)保守半胱氨酸殘基用黑色箭頭指示

Fig.2Sequence alignment of GPX proteins ofO.sativa,B.distachyonandS.bicolorConserved residues in all GPX proteins are marked in black.The three conserved cysteine residues of plant GPX proteins are marked with black arrows

2.4水稻、短柄草和高粱GPX基因的結(jié)構(gòu)分析

分析3個(gè)物種GPX基因的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，GPX基因的內(nèi)含子數(shù)目非常保守，除SbGPX7有6個(gè)內(nèi)含子外，其他所有GPX都只有5個(gè)內(nèi)含子，而且所有GPX基因在結(jié)構(gòu)域區(qū)的內(nèi)含子數(shù)目和外顯子長(zhǎng)度都高度保守，除SbGPX2第5個(gè)外顯子比其他基因?qū)?yīng)外顯子的蛋白序列多1個(gè)氨基酸外，其他相對(duì)應(yīng)的外顯子長(zhǎng)度都完全保守；對(duì)應(yīng)內(nèi)含子的長(zhǎng)度差異則比較大，例如，OsGPX5第3個(gè)內(nèi)含子長(zhǎng)度為138 bp，而SbGPX5第3個(gè)內(nèi)含子長(zhǎng)度為5 499 bp。在GPX蛋白N端非GPX結(jié)構(gòu)域區(qū)，外顯子的長(zhǎng)度差別較大，例如OsGPX3第1個(gè)外顯子的非結(jié)構(gòu)域部分長(zhǎng)度為234 bp，而OsGPX1第1個(gè)外顯子非結(jié)構(gòu)域部分長(zhǎng)度只有24 bp。在GPX蛋白C端非GPX結(jié)構(gòu)域區(qū)，外顯子的長(zhǎng)度則比較相近，除BdGPX2為90 bp外，其他都在6～16 bp(圖3)。

圖 3水稻、短柄草和高粱GPX的基因結(jié)構(gòu)灰色方框代表外顯子，橫線代表內(nèi)含子

Fig.3Structures ofGPXgenes ofO.sativa,B.distachyonandS.bicolorExons are indicated by gray boxes,while introns are indicated by lines

2.5水稻、短柄草和高粱GPX基因的表達(dá)模式

通過反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)，分析在正常生長(zhǎng)和脅迫處理?xiàng)l件下，水稻、短柄草和高粱GPX基因在根、莖、成熟葉、幼葉、葉鞘以及未經(jīng)脅迫處理的幼苗根、芽中的表達(dá)模式，結(jié)果見圖4。

圖 4水稻、短柄草和高粱GPX基因的表達(dá)模式

灰格表示檢測(cè)到基因表達(dá)，白格表示未檢測(cè)到基因表達(dá)。NC表示對(duì)照組(正常生長(zhǎng)未經(jīng)脅迫處理)，HO表示H2O2處理，AT表示莠去津處理，CD表示CDNB處理，SA表示水楊酸處理

Fig.4Expression patterns ofGPXgenes ofO.sativa,B.distachyonandS.bicolor

The gray box indicates positive detection of gene expression in the corresponding tissue under normal growth conditions (NC),CDNB (CD),H2O2(HO),atrazine (AT) and salicylic acid (SA) treatments

圖4顯示，短柄草5個(gè)GPX基因在檢測(cè)的所有樣品中都表達(dá)；水稻6個(gè)GPX基因中，有4個(gè) (OsGPX1/2/3/4) 在檢測(cè)的所有樣品中都表達(dá)，有2個(gè) (OsGPX5/6) 是選擇性表達(dá)，其中OsGPX5只在幼苗根和芽以及CDNB處理下的幼葉中表達(dá)，OsGPX6在植株的根和莖、幼苗根、SA處理的成熟葉和幼葉，以及CDNB和SA處理?xiàng)l件下的葉鞘中均不表達(dá)；高粱7個(gè)GPX基因中，有6個(gè) (SbGPX1/2/3/4/5/6) 在檢測(cè)的所有樣品中都表達(dá)，而SbGPX7為選擇性表達(dá)，在正常生長(zhǎng)、Atrazine和SA處理?xiàng)l件下的葉鞘中不表達(dá)。

由圖4還可見，在3個(gè)物種中，直系同源基因的表達(dá)模式也發(fā)生了分化，例如BdGPX5、SbGPX6和OsGPX6是直系同源基因(圖1中a4簇)，BdGPX5和SbGPX6在檢測(cè)的所有樣品中均表達(dá)，而OsGPX6選擇性表達(dá)；OsGPX5和SbGPX5是直系同源基因(圖1中a5簇)，SbGPX5在檢測(cè)的所有樣品中均表達(dá)，而OsGPX5則表現(xiàn)為選擇性表達(dá)。

3　討　論

GPX是植物體內(nèi)保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的重要酶類[2]。水稻是重要的糧食作物，短柄草是優(yōu)良的牧草，高粱是重要的糧食作物和能源植物，但在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中由于干旱和低溫等逆境脅迫限制了其高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)，因此在這3個(gè)物種中研究與抗性相關(guān)的GPX基因具有重要的理論意義與應(yīng)用價(jià)值。

本研究從水稻、短柄草和高粱基因組中分別搜索到6，5，7個(gè)GPX基因，通過系統(tǒng)發(fā)生分析推測(cè)3個(gè)物種至少有7個(gè)最近的共同祖先GPX基因，在3個(gè)物種分化以后，水稻和短柄草中分別丟失了1個(gè)和2個(gè)GPX基因。基因重復(fù)和丟失是基因功能變化的有力來源，根據(jù)Wapinski等[12]的研究，基因重復(fù)和丟失的可能性與基因功能密切相關(guān)，且與脅迫相關(guān)的基因更容易出現(xiàn)重復(fù)和丟失，而與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因數(shù)目更加穩(wěn)定。GPX基因是抵抗氧化脅迫的基因，其基因數(shù)目的變化預(yù)示了進(jìn)化過程中GPX基因在3個(gè)物種中功能的變化。

本研究對(duì)3個(gè)物種直系同源基因蛋白序列的相似性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，不同基因簇的序列相似性不同，例如，OsGPX3/BdGPX3、OsGPX3/SbGPX3和BdGPX3/SbGPX3的序列相似性分別為77.5%，66.9%和65.7%，而OsGPX1/BdGPX1、OsGPX1/SbGPX1和BdGPX1/SbGPX1的序列相似性分別為89.8%，95.2%和92.2%。不同基因簇序列相似性的不同預(yù)示功能分化速率的差異，序列相似性更高的基因簇中的基因在3個(gè)物種中的功能可能更加保守，而序列相似性低的基因簇中的基因在3個(gè)物種中的功能可能已經(jīng)出現(xiàn)了較大的分化[13]。

通過序列比對(duì)，本研究在GPX蛋白序列中鑒定出3個(gè)保守的半胱氨酸(Cys)，根據(jù)Navrot等[1]的研究結(jié)果，第122和170位的Cys是GPX的催化位點(diǎn)，在催化過程中，首先是第122位Cys殘基與過氧化物反應(yīng)，形成Cys-SOH，然后Cys-SOH與第170位Cys殘基形成一個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，再通過與Trx反應(yīng)將二硫鍵還原，使GPX回到還原態(tài)，當(dāng)2個(gè)Cys中的任意一個(gè)突變之后，GPX蛋白都不能持續(xù)發(fā)揮催化功能；而第151位Cys殘基可影響GPX蛋白對(duì)過氧化物底物的結(jié)合能力，當(dāng)這個(gè)位點(diǎn)的Cys殘基突變以后，GPX對(duì)過氧化底物的結(jié)合能力將明顯降低。

本研究發(fā)現(xiàn)，水稻、短柄草和高粱GPX基因的結(jié)構(gòu)非常保守，除SbGPX7有6個(gè)內(nèi)含子外，其他所有GPX都只含有5個(gè)內(nèi)含子，而且所有GPX基因結(jié)構(gòu)域區(qū)的內(nèi)含子數(shù)目和外顯子長(zhǎng)度都高度保守。SbGPX7多出的1個(gè)內(nèi)含子可能是內(nèi)含子插入的結(jié)果，從而引起SbGPX7與其他GPX基因結(jié)構(gòu)的分化?；蚪Y(jié)構(gòu)的分化對(duì)重復(fù)基因分化具有重要作用[14]，SbGPX7與其他GPX基因的結(jié)構(gòu)分化預(yù)示其功能的分化。

對(duì)3個(gè)物種GPX基因的表達(dá)模式研究發(fā)現(xiàn)，水稻、短柄草和高粱分別有4，5，6個(gè)GPX基因在所有檢測(cè)的樣品中均表達(dá)，說明這些基因可能是組成型表達(dá)基因，預(yù)示這些基因在正常條件及脅迫條件下的所有部位中均發(fā)揮作用。而水稻OsGPX5、OsGPX6和高粱SbGPX7為選擇性表達(dá)基因，可能只在某些條件下或某些發(fā)育階段的某些部位發(fā)揮作用。表達(dá)的時(shí)空差異預(yù)示著水稻的2個(gè)和高粱的1個(gè)基因功能發(fā)生了分化。

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Genome-wide evolutionary analysis and expression of glutathione peroxidase genes in Gramineae

YANG Xuea,LIU Cuijingb,YANG Meiyinga

(aCollegeofLifeSciences,bCollegeofChineseMedicinalMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

【Objective】 The sequences and expression patterns of glutathione peroxidase (GPX) genes in Gramineae were investigated to provide information for studying the role ofGPXin stress tolerance.【Method】 Sequence characteristics,gene structures and phylogenetic relationship of 18GPXsfromOryzasativa,BrachypodiumdistachyonandSorghumbicolorwere analyzed by bio-informatics tools.Gene expression patterns were analyzed by reverse transcription PCR (RT-PCR) in roots,stem,leaves,and leaf sheath exposed to various treatments (1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB),H2O2,atrazine and salicylic acid (SA)) for 12 or 24 h and in roots and shoots of seedlings 2 d after germination under normal condition.【Result】 The numbers ofGPXgenes identified fromO.sativa,B.distachyonandS.bicolorgenomes were 6,5 and 7,respectively.These genes encoded proteins with 168-251 amino acids and calculated molecular mass of 18.44-27.42 ku.Phylogenetic analysis indicated that there were at least 7 most recent common ancestralGPXgenes before split ofO.sativa,B.distachyonandS.bicolorand one and twoGPXgenes were lost inO.sativaandB.distachyonafter species divergence.Sequence similarity analysis showed GPX proteins had high sequence similarities of 38.0%-95.2%,and GPXs of different clades had different divergent rates.AllGPXgenes of the three species had conserved structures, and an insertion of intron occurred inSbGPX7,indicating functional divergence betweenSbGPX7 and otherGPXs.Reverse transcription PCR revealed that 15 of the 18GPXgenes were constitutive expression genes,while the other three were selectively expressed either in a specific tissue and/or in response to a specific treatment.Expression divergence indicated functional divergence.【Conclusion】GPXsin Gramineae,as key enzymes that protect cellular components from oxidative damage,had functional differences after split ofO.sativa,B.distachyonandS.bicolor.

glutathione peroxidase;Gramineae;gene evolutionary analysis;gene expression pattern

時(shí)間:2016-09-0709:03DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.10.025

2015-04-15

吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(201407)

楊雪(1984-)，女，吉林長(zhǎng)春人，講師，博士，主要從事植物基因家族的功能進(jìn)化研究。

E-mail:xueyang840316@163.com

Q811.4

A

1671-9387(2016)10-0176-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160907.0903.050.html