梁紹滿 鄧小敏

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【實(shí)驗(yàn)研究】

四逆散對(duì)2型糖尿病大鼠血糖、11βHSD1及GR的影響

梁紹滿1鄧小敏2△

目的 觀察研究四逆散對(duì)2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響及作用機(jī)制。方法 利用高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)的方法建立2型糖尿病大鼠模型。設(shè)空白對(duì)照組、模型組、四逆散高劑量組及四逆散低劑量組，給藥4周后測(cè)各組大鼠體質(zhì)量、空腹血糖 (FPG)、隨機(jī)血糖、血清胰島素(FINS) 水平、血漿皮質(zhì)酮含量，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)，采用Western blot法檢測(cè)肝臟組織中11β-HSD1、GR蛋白表達(dá)。結(jié)果 給藥后，四逆散可以控制糖尿病大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)(P<0.05)，具有降低空腹及隨機(jī)血糖的作用(P<0.01)，且中藥高劑量組降血糖效果更佳，降低血清胰島素水平、胰島素抵抗指數(shù)水平(P<0.05 或P<0.01)，降低血漿皮質(zhì)酮含量(P<0.05)。模型組肝臟11β-HSD1、GR蛋白表達(dá)量上調(diào)，經(jīng)中藥治療后兩種蛋白的表達(dá)量均有所下調(diào)(P<0.01)。結(jié)論 四逆散能夠改善 2型糖尿病大鼠胰島素抵抗，其作用機(jī)制可能與下調(diào)11β-HSD1、GR蛋白的表達(dá)有關(guān)。

四逆散；2型糖尿病；從肝論治；11β-HSD1；GR

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一種由遺傳因素和多種環(huán)境因素引起以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，是一種可伴隨因胰島素分泌絕對(duì)不足或相對(duì)不足，以及靶組織細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性降低引起糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、水和電解質(zhì)代謝紊亂綜合征，臨床常表現(xiàn)為多飲、多食、多尿，體質(zhì)量下降。目前在我國糖尿病患者中大約90%～95%屬于2型糖尿病(TyPe 2 Diabetes Mellitus，T2DM)，而IR和胰島β細(xì)胞分泌功能障礙是T2DM發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的兩個(gè)重要環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)精神創(chuàng)傷、易激易郁或持久性緊張可誘發(fā)或加重糖尿病，這可能由于各種情志刺激影響大腦皮質(zhì)以及皮質(zhì)下中樞以致影響腦垂體、腎上腺、胰腺等，即通過神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)影響糖脂代謝而發(fā)病[1]。也有研究[2]認(rèn)為抑郁是糖尿病的最常見的心理障礙之一，給患者帶來沉重的精神壓力。四逆散是中藥復(fù)方制劑，我們?cè)谂R床主要用于治療2型糖尿病胰島素抵抗并發(fā)情志異常疾病，本研究從糖代謝、糖皮質(zhì)激素方面，采用分子生物學(xué)方法探討四逆散治療糖尿病胰島素抵抗的藥效作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠110只，12周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室溫度恒定為：(26±2)℃，相對(duì)濕度60%～80%。飼養(yǎng)環(huán)境符合醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施要求，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 飼料 動(dòng)物飼料購自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，分為普通基礎(chǔ)飼料和高糖高脂飼料，高糖高脂飼料由基礎(chǔ)飼料67.7%、豬油10%、蔗糖20%、膽固醇2.0%、膽酸鹽0.3%組成，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院加工為顆粒飼料。

1.1.3 藥物準(zhǔn)備 四逆散組成：柴胡、白芍、枳實(shí)、甘草，按原方比例1∶1∶1∶1配齊藥物，購于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。加入5倍蒸餾水浸泡60 min，快速加熱至沸騰，而后保持微沸狀態(tài)15 min，趁熱抽濾；剩余藥渣中加入3倍蒸餾水，浸泡30 min，快速加熱至沸，微沸10 min，趁熱抽濾。合并2次濾液，水浴濃縮至含生藥量1 g·mL-1，分裝滅菌，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。灌胃前提前取出藥液，加熱至常溫后使用?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備 所有大鼠均予自由攝食基礎(chǔ)飼料及飲水適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨后高糖高脂組換予高糖高脂飼料飼養(yǎng)。采用高糖高脂飼料加小劑量STZ注射造模。高糖高脂組大鼠在高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后空腹腹腔注射低劑量STZ(35 mg/kg，Sigma公司)1次，正常對(duì)照組腹腔注射等劑量的檸檬酸緩沖液(STZ 用PH4.2的 0.1mmol/L 檸檬酸緩沖液配制)。造模時(shí)，STZ需要現(xiàn)配現(xiàn)用。剔除血糖值升高不符合要求的動(dòng)物并選出健康狀態(tài)相對(duì)較好的60只大鼠在進(jìn)行隨機(jī)分組治療。糖尿病大鼠成模標(biāo)準(zhǔn)為STZ造模72 h(3天)后剪尾取血測(cè)血糖，以隨機(jī)血糖≥16.7mmol/L 認(rèn)為造模成功。

1.2.2 動(dòng)物分組 按隨機(jī)分配原則選取SD大鼠110只，分為空白對(duì)照組20只，高糖高脂組90只。將60只高糖高脂組中造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組，共三組，每組20只。

1.2.3 給藥 造模后空白對(duì)照組與模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組繼續(xù)予標(biāo)準(zhǔn)大鼠基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。正常對(duì)照組給予生理鹽水灌胃(5ml/kg)，模型組給予生理鹽水灌胃(5ml/kg)，中藥高劑量組給予四逆散煎劑濃縮液灌胃(10 g生藥量/kg)，中藥低劑量組給予四逆散煎劑濃縮液灌胃(5 g生藥量/kg)，各組每日灌胃1次，連續(xù)灌胃4周。

1.2.4 取材 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠禁食12 h，空腹血糖的檢測(cè)采用腹主動(dòng)脈取血，不抗凝取血清測(cè)胰島素(FINS)，抗凝取血漿測(cè)皮質(zhì)酮(CORT)，低溫保存，待檢；隨后分離出肝臟組織，取肝右葉下緣2cm×1cm大小組織并分割成數(shù)小塊，用生理鹽水沖洗干凈后，置于濾紙上吸干，放入事先編號(hào)的凍存管中，液氮保存，置于-80℃冰柜冰凍保存，以留待制備蛋白標(biāo)本。

1.2.5 檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA法)測(cè)胰島素(FINS)、皮質(zhì)酮(CORT)，指標(biāo)檢測(cè)嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)的計(jì)算方法：FPG×FINS/22.5；采用Western Blot法檢測(cè)肝臟11β-HSD1、GR蛋白，用Image J軟件對(duì)膠片進(jìn)行掃描，將各組大鼠肝臟蛋白水平以β-actin標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行量化分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量比較 造模前1周模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組大鼠體質(zhì)量較空白對(duì)照組明顯增加，差異具有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示高脂飼料對(duì)比普通飼料更能增加大鼠體質(zhì)量。造模第0周(即造模成功伊始)，造模大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量驟降、血糖增高現(xiàn)象，且造模大鼠的進(jìn)食量、進(jìn)水量較空白對(duì)照組明顯增多，多數(shù)大鼠開始出現(xiàn)多尿的情況，說明成功造成2型糖尿病大鼠模型；但此時(shí)造模的三個(gè)組之間比較，大鼠體質(zhì)量變化并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模第4周(即給藥治療后第4周)，兩個(gè)給藥組體質(zhì)量與模型組比較，明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中藥低劑量組體質(zhì)量與中藥高劑量組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示四逆散治療對(duì)大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)具有抑制作用，不論湯藥劑量的高低均可控制糖尿病大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量(g)的變化 (只，

注：與空白對(duì)照組比較，1)P<0.01，與模型組比較，2)P<0.05

2.2 各組大鼠隨機(jī)血糖比較 實(shí)驗(yàn)過程中，模型組大鼠與中藥高劑量組、中藥低劑量組血糖均維持在較高水平，明顯高于空白對(duì)照組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。造模伊始，模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組間血糖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)中藥灌胃4周后，模型大鼠的血糖有下降趨勢(shì)，與模型組對(duì)比，中藥高劑量組、中藥低劑量組血糖下降明顯，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，中藥高劑量組血糖對(duì)比其治療前血糖下降明顯(P<0.01)，中藥低劑量組血糖對(duì)比其治療前血糖雖然也有下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示四逆散具有降低糖尿病大鼠隨機(jī)血糖的作用，且高劑量的四逆散降血糖效果更佳。見表2。

表2 各組大鼠隨機(jī)血糖濃度比較(mmol/L) (只，

注：與空白對(duì)照組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.01；同組間，與造模第0周相比，3)P<0.01

2.3 各組大鼠空腹血糖(FBG)及血清胰島素(FINS)水平比較 給藥四周后，檢測(cè)各組FBG，與空白對(duì)照組相比，造模大鼠(模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組)FBG明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。中藥高劑量組較模型組FBG降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，中藥低劑量組對(duì)比模型組血糖有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示四逆散高劑量組可以有效降低空腹血糖。給藥四周后檢測(cè)各組血清胰島素水平，與空白對(duì)照組相比，模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組血清胰島素水平升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。經(jīng)治療后，兩個(gè)中藥組FINS均有降低，中藥高劑量組與模型組相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，中藥低劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，中藥高劑量組和中藥低劑量組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示四逆散高劑量及四逆散低劑量均可降低2型糖尿病大鼠血清胰島素水平，但二者對(duì)血清胰島素的干預(yù)作用沒有很大差別。見表3。

表3 各組大鼠空腹血糖及血清胰島素水平變化情況

組別FBG(mmol/L)FINS(mIU/L)空白對(duì)照組657±1311462±181模型組2212±0851)2841±4231)中藥高劑量組2013±1381)2)2465±2741)2)中藥低劑量組2189±0941)3)2615±3721)4)

注：與空白對(duì)照組比較，1)P<0.01，與模型組比較，2)P<0.01。與高劑量組比較，3)P<0.01

2.4 各組大鼠胰島素抵抗指數(shù)變化比較 給藥四周后根據(jù)大鼠空腹血糖及血清胰島素水平計(jì)算各組大鼠胰島素抵抗指數(shù)，與空白對(duì)照組相比，模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組HOMA-IR明顯升高，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。藥物治療后，兩個(gè)中藥組HOMA-IR較模型組比較均有降低，與模型組相比，中藥高劑量組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，中藥低劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，中藥高劑量組對(duì)比中藥低劑量組HOMA-IR下降具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示四逆散高劑量及四逆散低劑量均可降低2型糖尿病大鼠胰島素抵抗指數(shù)水平，且高劑量組干預(yù)作用優(yōu)于低劑量組。見表4。

表4 各組大鼠胰島素抵抗指數(shù)水平變化情況 ±s)

注：與空白對(duì)照組比較，1)P<0.01，與模型組比較，2)P<0.01，3)P<0.05。與高劑量組比較，4)P<0.01

2.5 各組大鼠血漿皮質(zhì)酮比較 隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展，空白對(duì)照組大鼠血糖處于正常水平，由于空白對(duì)照組未給予任何藥物及飲食干預(yù)，其體質(zhì)量持續(xù)增長(zhǎng)，重量重于各組大鼠，血糖低于各組大鼠。即使空白對(duì)照組此時(shí)的體質(zhì)量較重，但其血漿皮質(zhì)酮含量較模型組低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；并且空白對(duì)照組也低于中藥高劑量組與中藥低劑量組的皮質(zhì)酮含量，與中藥高劑量組、中藥低劑量組對(duì)比，皮質(zhì)酮含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由于經(jīng)中藥治療后，中藥高劑量組、中藥低劑量組CORT含量對(duì)比模型組有下降趨勢(shì)，且中藥高劑量組對(duì)比模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中藥低劑量組對(duì)比模型組雖然也有下降趨勢(shì)，但是差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此提示四逆散高劑量組較低劑量組降低血漿皮質(zhì)酮含量更為有效。見表5。

表5 各組大鼠血漿皮質(zhì)酮(CORT)含量 (只，

注：與空白對(duì)照組比較，1)P<0.01，2)P<0.05，與模型組比較，3)P<0.05

2.6 Western Blot法檢測(cè)四逆散對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟組織蛋白中11β-HSD1表達(dá)的影響 11β-HSD1蛋白含量在模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組均明顯升高，與空白對(duì)照組相比具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。中藥高劑量組、中藥低劑量組較模型組表達(dá)下降，且均與模型組相比有顯著性差異(P<0.01)。提示四逆散高低劑量組均可降低11β-HSD1蛋白在糖尿病大鼠肝臟的表達(dá)。見表6，圖1。

表6 各組大鼠11β-HSD1蛋白表達(dá)

組別樣本數(shù)平均光密度空白對(duì)照組20061±004模型組20125±0061)中藥高劑量組20085±0061)2)中藥低劑量組20100±0051)2)

注：與空白對(duì)照組比較，1)P<0.01，與模型組比較，2)P<0.01

2.7 Western Blot法檢測(cè)四逆散對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟組織蛋白中GR表達(dá)的影響 GR蛋白含量在模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組均明顯升高，與空白對(duì)照組相比具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。中藥高劑量組、中藥低劑量組較模型組表達(dá)下降，且均與模型組相比有顯著性差異(P<0.01)。提示四逆散高低劑量組均可降低GR蛋白在糖尿病大鼠肝臟的表達(dá)。見表7，圖2。

表7 各組大鼠GR蛋白表達(dá)

組別樣本數(shù)平均光密度空白對(duì)照組20182±012模型組20279±0161)中藥高劑量組20263±0171)2)中藥低劑量組20271±021)2)

注：與空白對(duì)照組比較，1)P<0.01，與模型組比較，2)P<0.01

圖1

圖2

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)證明在2型糖尿病大鼠中11β-HSD1、GR蛋白的含量均明顯增高，在運(yùn)用四逆散干預(yù)治療后，二者均可以表現(xiàn)出目標(biāo)蛋白的表達(dá)量下降，提示二者之間確實(shí)具有相互調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，造模大鼠血漿皮質(zhì)酮(嚙齒類動(dòng)物血漿中的糖皮質(zhì)激素主要是皮質(zhì)酮)含量也有升高，在中藥治療后可下降。提示三者之間存在緊密的聯(lián)系，通過三者之間相互作用，表達(dá)上調(diào)，從而使肝糖產(chǎn)生過多，導(dǎo)致發(fā)生血糖升高、胰島素抵抗。本課題的研究表明，四逆散高劑量組隨機(jī)血糖、空腹血糖、血清胰島素、胰島素抵抗指數(shù)明顯降低，11β-HSD1、GR蛋白表達(dá)量也有下降，與模型組比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。四逆散低劑量組在血清胰島素、胰島素抵抗指數(shù)上與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高劑量組在降低皮質(zhì)酮含量方面優(yōu)于低劑量組(P<0.05)。由此可知，經(jīng)典名方四逆散能有效降低2型糖尿病大鼠血糖水平，其降血糖機(jī)理可能與降低肝臟11β-HSD1、GR蛋白表達(dá)有關(guān)。該研究結(jié)果可為豐富中醫(yī)藥防治2型糖尿病胰島素抵抗從肝論治理論提供依據(jù)及作用機(jī)制指導(dǎo)。

4 討論

4.1 四逆散從肝論治理論基礎(chǔ) 《黃帝內(nèi)經(jīng)》中認(rèn)為肝的生理功能為“主疏泄”“喜條達(dá)而惡抑郁”， 元代朱丹溪曾經(jīng)說過：“氣血沖和，諸疾不生，一有怫郁，百病生焉”，可見他尤為強(qiáng)調(diào)肝的疏泄功能失調(diào)引發(fā)的情志怫郁在疾病發(fā)生的重要地位。明朝戴元禮的《證治要決·傷食門》提到：“人之飲食由脾入胃，過食傷肝”。清代醫(yī)家唐容川《血證論》認(rèn)為：“木之性主于疏泄，食氣入胃，全賴肝木之氣以疏泄之，則水谷乃化?！边@兩條古文則說明了肝與脾胃之間的緊密聯(lián)系，肝臟促進(jìn)脾胃的運(yùn)化水谷的功能。肝的情志失調(diào)，氣機(jī)不暢，導(dǎo)致氣血運(yùn)行受阻，郁而化熱，傷津耗液，瘀毒病理產(chǎn)物內(nèi)生，發(fā)為消渴。并且現(xiàn)代健康觀念既包含身體健康，又含精神衛(wèi)生、心理等諸多方面，愈加重視情志方面的治療，因此在認(rèn)識(shí)到肝失疏泄是糖尿病早期的胰島素抵抗發(fā)展變化的基本病理后，現(xiàn)代醫(yī)家常選用疏肝理氣的名方——四逆散來輔助治療2型糖尿病，以達(dá)到降低血糖，減少胰島素抵抗，增加胰島素敏感性的目的。

4.2 11HSD1、GR與2型糖尿病胰島素抵抗的相關(guān)性 11β-HSD1是一種微粒體復(fù)合酶體，能催化循環(huán)中無活性的糖皮質(zhì)激素與活性的糖皮質(zhì)激素之間進(jìn)行轉(zhuǎn)化，進(jìn)行受體前調(diào)解，即糖皮質(zhì)激素(GCs)與糖皮質(zhì)激素受體(GR)的結(jié)合，改變局部激素生物效應(yīng)[3]。11β-HSD1廣泛分布于肝臟、脂肪組織、腦組織等，有實(shí)驗(yàn)研究顯示11β-HSD1活性在小鼠的肝、脂肪細(xì)胞的不正常升高與胰島素抵抗和內(nèi)臟型肥胖的發(fā)生有關(guān)[4]。11β-HSD1可逆地控制糖皮質(zhì)激素的代謝，引起GCs濃度變化，影響胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)及血糖變化。11β-HSD1能增加組織中GCs濃度，影響血糖變化。并且流行病學(xué)提示2型糖尿病存在慢性應(yīng)激，如易激易郁或持久性緊張可以造成局部組織糖皮質(zhì)激素水平增高，擴(kuò)大激素效應(yīng)。長(zhǎng)期的慢性應(yīng)激導(dǎo)致某些升糖激素如胰高血糖素、GCs等不恰當(dāng)?shù)胤置赱5]，導(dǎo)致血糖升高。

GR是一種配體激活型核轉(zhuǎn)錄因子，糖皮質(zhì)激素的效應(yīng)就是由GR介導(dǎo)的。GCs與肝臟GR結(jié)合后，使糖異生的兩個(gè)限速酶表達(dá)上調(diào)，加速糖異生的過程，對(duì)抗胰島素活性、外周敏感性，從而使肝糖產(chǎn)生過多，血糖升高。

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廣西壯族自治區(qū)教育廳課題(No.YB2014186)

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院碩士研究生2013級(jí)(南寧 530023)；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)辦公室(南寧 530023)

△通訊作者

10.3969/j.issn.1003-8914.2016.19.017

1003-8914(2016)-19-2799-05

?超峰

2016-05-16)