殷劍　王曉明　孫慧　錢希銘

?

3種酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑檢測(cè)丙型肝炎抗體結(jié)果研究

殷劍王曉明孫慧錢希銘

目的探討3種酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑檢測(cè)丙型肝炎抗體結(jié)果情況。方法分析2015年1～9月進(jìn)行檢測(cè)丙型肝炎篩查的血液標(biāo)本3 824例，其中丙型肝炎血液標(biāo)本作為觀察對(duì)象，依據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑不同進(jìn)行分組，Ⅰ組采用A試劑，通過間接法進(jìn)行檢測(cè)；Ⅱ組采用B試劑，通過間接法進(jìn)行檢測(cè)；Ⅲ組采用C試劑，采用夾心法進(jìn)行檢測(cè)，通過聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行確診。對(duì)質(zhì)控物進(jìn)行倍比稀釋，分別通過三種檢測(cè)試劑進(jìn)行平行檢測(cè)。結(jié)果Ⅲ組檢測(cè)結(jié)果陽性30例，陰性3 794例；Ⅲ組陽性檢出率高于Ⅰ組(χ2=21.28，P<0.05)，Ⅲ組陽性檢出率高于Ⅱ組(χ2=20.64，P<0.05)；Ⅲ組真陽性標(biāo)本準(zhǔn)確度高于Ⅰ組(χ2=8.49，P<0.05)，Ⅲ組真陽性標(biāo)本準(zhǔn)確度高于Ⅱ組(χ2=8.67，P<0.05)；Ⅲ組質(zhì)控血清靈敏度高于Ⅰ組(χ2=16.37，P<0.05)，Ⅲ組質(zhì)控血清靈敏度高于Ⅱ組(χ2=16.58,P<0.05)；Ⅲ組檢測(cè)陽性標(biāo)本靈敏度高于Ⅰ組(χ2=21.85,P<0.05)，Ⅲ組檢測(cè)陽性標(biāo)本靈敏度高于Ⅱ組(χ2=21.47，P<0.05)。結(jié)論夾心法酶聯(lián)合免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑HCV抗體靈敏度、特異性均高于間接法ELISA檢測(cè)試劑，值得臨床推廣應(yīng)用。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；試劑；檢測(cè)；丙型肝炎抗體

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)形成的一種傳染性疾病，HCV是一種單股正鏈RNA病毒，在黃病毒科之列。目前全世界有1.85億已知的HCV感染者，每年有300～400萬新發(fā)病例[1,2]。感染病例可分為急性感染和慢性感染兩類，其中急性感染者有近80%發(fā)展成為慢性感染，20年后有1/5的患者可能形成肝臟纖維化、終末期肝癌等,對(duì)于丙型感染的診斷、治療顯得尤為重要[3,4]。目前關(guān)于HCV檢測(cè)方法主要以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)為主，采用何種酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)成為檢測(cè)丙型感染抗體結(jié)果準(zhǔn)確性的重要議題。本研究通過對(duì)我院丙型肝炎患者臨床資料進(jìn)行分析，探討不同聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)丙型肝炎抗體結(jié)果情況，報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取我院2015年1～9月進(jìn)行檢測(cè)丙型肝炎篩查的血液標(biāo)本3 824例，其中丙型肝炎血液標(biāo)本作為觀察對(duì)象，依據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑不同進(jìn)行分組，Ⅰ組采用A試劑，通過間接法進(jìn)行檢測(cè)；Ⅱ組采用B試劑通過間接法進(jìn)行檢測(cè)；Ⅱ組采用C試劑，采用夾心法進(jìn)行檢測(cè)，通過聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行確診，免疫印跡法檢測(cè)通過美國RIBA試劑進(jìn)行檢測(cè)。

1.2儀器與方法(1)首先通過試劑A、試劑B進(jìn)行抗-HCV抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，按照操作說明書進(jìn)行操作，灰區(qū)設(shè)置范圍：血液標(biāo)本OD值的范圍在0.7×cut off～1.0×cut off。任何一種試劑檢測(cè)標(biāo)本OD值均在灰區(qū)的設(shè)置范圍之內(nèi)，準(zhǔn)備進(jìn)行復(fù)查。檢測(cè)過程中注意進(jìn)行雙孔復(fù)查，如果雙試劑四孔OD值小于cut off，可以判定為陰性，雙試劑所有孔的OD值≥cut off可以判定為陽性，除此以外的情況判定為弱陽性。通過試劑A、試劑B檢測(cè)結(jié)果判定為弱陽性和陽性標(biāo)本通過PCR和RIBA檢測(cè)，從而確定標(biāo)本中HCV病毒進(jìn)行確認(rèn)，采用3種酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)和確證。將1 NCU/ml質(zhì)控血清進(jìn)行倍比稀釋，獲得9份自制標(biāo)本，聯(lián)合質(zhì)控血清共計(jì)10份，通過試劑A、試劑B、試劑C對(duì)標(biāo)本進(jìn)行平行檢測(cè)。(2)將免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果陽性標(biāo)本通過A、B、C試劑進(jìn)行檢測(cè)，并且對(duì)S/CO值進(jìn)行對(duì)比觀察。

1.3觀察指標(biāo)(1)觀察Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組檢測(cè)結(jié)果比較情況。(2)觀察間接法抗HCV陽性和弱陽性標(biāo)本通過不同組別的檢測(cè)結(jié)果情況。(3)觀察Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組檢測(cè)陽性標(biāo)本準(zhǔn)確度情況。(4)觀察Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組質(zhì)控血清檢測(cè)靈敏度情況。(5)觀察Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組檢測(cè)陽性標(biāo)本靈敏度情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組檢測(cè)結(jié)果比較Ⅲ組檢測(cè)結(jié)果陽性30例，陰性3 794例。見表1。

2.2160份間接法抗HCV陽性和弱陽性標(biāo)本通過不同組的檢測(cè)結(jié)果Ⅲ組陽性檢出率高于Ⅰ組(χ2=21.28,P<0.05)，Ⅲ組陽性檢出率高于Ⅱ組(χ2=20.64，P<0.05)。見表2。

表1　Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組檢測(cè)結(jié)果比較　例

表2　160份間接法抗HCV陽性和弱陽性標(biāo)本通過不同組別檢測(cè)結(jié)果　例(%)

注：與Ⅲ組比較，*P<0.05

2.3Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組檢測(cè)陽性標(biāo)本準(zhǔn)確度情況Ⅲ組真陽性標(biāo)本準(zhǔn)確度高于Ⅰ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.49,P<0.05)；Ⅲ組真陽性標(biāo)本準(zhǔn)確度高于Ⅱ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.67，P<0.05)。見表3。

表3?、窠M、Ⅱ組和Ⅲ組檢測(cè)陽性標(biāo)本準(zhǔn)確度情況

注：與Ⅲ組比較，*P<0.05

2.4Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組質(zhì)控血清檢測(cè)靈敏度情況Ⅲ組質(zhì)控血清靈敏度高于Ⅰ組(χ2=16.37,P<0.05)，Ⅲ組質(zhì)控血清靈敏度高于Ⅱ組(χ2=16.58，P<0.05)。見表4。

表4?、窠M、Ⅱ組和Ⅲ組質(zhì)控血清檢測(cè)靈敏度情況　%

注：與Ⅲ組比較，*P<0.05

2.5Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組檢測(cè)陽性標(biāo)本靈敏度情況Ⅲ組檢測(cè)陽性標(biāo)本靈敏度高于Ⅰ組(χ2=21.85,P<0.05)，Ⅲ組檢測(cè)陽性標(biāo)本靈敏度高于Ⅱ組(χ2=21.47，P<0.05)。見表5。

3　討論

目前國內(nèi)HCV抗體感染率3%左右，其中大約4 000萬例HCV感染患者，已經(jīng)成為全世界的重大公共衛(wèi)生問題[5,6]。HCV傳播途徑主要是通過輸血或者血液制品進(jìn)行傳播。本研究通過分析2015年1～9月進(jìn)行檢測(cè)丙型肝炎篩查的血液標(biāo)本3 824例，其中丙型肝炎血液標(biāo)本為觀察對(duì)象，依據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑不同進(jìn)行分組，Ⅰ組采用A試劑，通過間接法進(jìn)行檢測(cè)，Ⅱ組采用B試劑，通過間接法進(jìn)行檢測(cè)，Ⅲ組采用C試劑，采用夾心法進(jìn)行檢測(cè)，通過聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行確診。對(duì)質(zhì)控物進(jìn)行倍比稀釋，分別通過三種檢測(cè)試劑進(jìn)行平行檢測(cè)。

試劑C是夾心法檢測(cè)HCV抗體的ELISA試劑，筆者通過多種不同的方法，對(duì)HCV抗體進(jìn)行平行性檢測(cè)，通過和間接法ELISA試劑進(jìn)行比較觀察，對(duì)夾心法試劑C進(jìn)行準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)[7,8]。有資料顯示，通過間接法ELISA檢測(cè)過程中，采用酶標(biāo)記抗人IgG作為第二抗體對(duì)血清中HCVIgG抗體，但是HCVIgG抗體出現(xiàn)時(shí)間比HCVIgM抗體晚，在感染早期其采集血液很容易發(fā)生漏檢[9,10]。同時(shí)為了減少因血清中其他非特異性抗體和類風(fēng)濕因子形成干擾，試驗(yàn)第一步需要降低檢測(cè)樣本量和稀釋樣本congress降低反應(yīng)的板底值，同時(shí)也可能降低試劑檢測(cè)靈敏度[11,12]。另外通過間接法ELISA檢測(cè)，很容易受到非特異性IgG抗體、類風(fēng)濕因子等非特異性抗體的影響，從而出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。目前關(guān)于HCV抗體診斷試劑逐步從間接法向夾心法逐步過渡。其原因主要是丙肝重組抗原活性和其空間構(gòu)象有密切關(guān)系，抗原結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和酶標(biāo)記過程中對(duì)于空間構(gòu)象的影響，為夾心法試劑研究重點(diǎn)和難點(diǎn)問題[13,14]。目前對(duì)于HCV抗體檢測(cè)影響因素主要是包被丙型肝炎病毒抗原。目前國內(nèi)常用的兩種間接法ELISA試劑對(duì)HCV抗體進(jìn)行篩查，為的是降低由于不同廠家包被抗原片段形成的漏檢[15,16]。有資料顯示，間接法ELISA檢測(cè)試劑可以增加NS5區(qū)作為包被抗原，提高了檢測(cè)的靈敏度，但本研究結(jié)果顯示，試劑A和試劑B的間接法ELISA檢測(cè)假陽性率比較高，可能增加了檢查HCV抗體成本和負(fù)擔(dān)[17]。有資料顯示，目前HCV感染標(biāo)志物檢測(cè)方法主要有兩種方式，其中一種通過間接法ELISA試劑檢測(cè)HCV抗體，另外一種是通過夾心法ELISA試劑對(duì)HCV抗體檢測(cè)，采用某種試劑對(duì)HCV核酸進(jìn)行檢測(cè)[18]。本結(jié)果表明，Ⅲ組檢測(cè)結(jié)果陽性30例，陰性3 794例，Ⅲ組陽性檢出率高于Ⅰ組，Ⅲ組陽性檢出率高于Ⅱ組，Ⅲ組真陽性標(biāo)本準(zhǔn)確度高于Ⅰ組，Ⅲ組真陽性標(biāo)本準(zhǔn)確度高于Ⅱ組，Ⅲ組質(zhì)控血清靈敏度高于Ⅰ組，Ⅲ組質(zhì)控血清靈敏度高于Ⅱ組，Ⅲ組檢測(cè)陽性標(biāo)本靈敏度高于Ⅰ組，Ⅲ組檢測(cè)陽性標(biāo)本靈敏度高于Ⅱ組，提示通過夾心法和間接法ELISA試劑、HCV核酸試劑進(jìn)行合理配伍，可以提高丙肝感染標(biāo)志物陽性篩查準(zhǔn)確率，降低假陽性，提高血液準(zhǔn)確率，盡可能提高血液檢查效率。

表5?、窠M、Ⅱ組和Ⅲ組檢測(cè)陽性標(biāo)本靈敏度情況　%

注：與Ⅲ組比較，*P<0.05

綜上所述，夾心法ELISA檢測(cè)試劑HCV抗體靈敏度、特異性均高于間接法ELISA檢測(cè)試劑，值得臨床推廣應(yīng)用。

1武麗娟.3種酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑檢測(cè)丙型肝炎抗體結(jié)果分析.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014,35：3246-3248.

2趙龍友,紀(jì)勇平,王德鑌,等.兩種酶聯(lián)免疫法檢測(cè)丙型肝炎病毒抗體結(jié)果分析.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2013,8：304-306.

3Ghany MG,Strader DB,Thomas DL,et al.Diagnosis, management,and treatment of hepatitis C: an update.Hepatology,2009,49:1335-1374.

4曾艷華，盧香云，張麗，等.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)丙型肝炎抗體的可比性研究.中華臨床實(shí)驗(yàn)室管理電子雜志，2015,3：42-46.

5Thomas DL.Global control of hepatitis C:where challenge meets opportunity.Nat Med,2013,19: 850-858.

6Acar A,Kemahli S,Ntunay H,et al.The significance of repeat testing in Turkish blood donors screened with HBV,HCV and HIV immunoassays and the importance of S/CO ratios in the interpretation of HCV/HIV screening test result and as a determinant for further confirmatory testing.Transfus Med,2010,20:152-159.

7張雪梅,付涌水,黃珂, 等.廣州獻(xiàn)血人群抗-HCV ELISA檢測(cè)S/CO值與確證試驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)性.中國輸血雜志,2013,26:29-33.

8Stefania C,Martin L.Indeterminate third-generation hepatitis C recombinant immunoblot assay and HCV RNA analysis:isolated reactivity against NS5 associated with HCV viraemia in clinical patients but not bloods.Scand J Infect Dis,2005,37:488-492.

9王紅.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)丙型肝炎病毒抗體在酶標(biāo)儀應(yīng)用中的探討.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2012,9：1234-1235.

10Alter MJ,Kuhnert WL,Finelli L,et al.Guidelines for laboratory testing and result reporting of antibody to hepatitis C virus.Centers for Disease Control and Prevention.MMWR Recomm Rep,2003,52:1-13,15.

11湯巧，吳文靜，夏永祥．化學(xué)發(fā)光法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)丙型肝炎病毒缸體的比較分析．國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，32：834-835．

12Ren FR,Lv QS,Zhuang H,et al.Signi cance of the signal-to-cutoff ratios of anti-hepatitis C virus enzyme immunoassays in screening of Chinese blood donors.Transfusion,2005,45:1816-1822.

13薛芳，吳剛.丙型肝炎病毒抗體酶聯(lián)免疫吸附試劑檢測(cè)結(jié)果可信度的分析．中國國境衛(wèi)生檢疫雜志，2009,32：1-3.

14梁華欽，王敏，黎世杰，等.廣州市無償獻(xiàn)血者中抗-HCV陽性人群的比較分析.中國輸血雜志，2012,25：449-451.

15趙金仙，李順祥，蔡英，等.艾滋病病毒感染對(duì)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑檢測(cè)靜脈吸毒人員丙型肝炎病毒抗體反應(yīng)強(qiáng)度影響的探討．疾病監(jiān)測(cè)，2010,25：49-51.

16Sabin CA，Emery V，Devereux HL，et al.Long-term patterns of hepatitis C virus RNA concentrations in a cohort of HIV seronegative men with bleeding disorders．J Med Virol，2002,68：68-75.

17朱忠政，叢文銘.乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒在肝癌發(fā)生中的應(yīng)用研究進(jìn)展．中華肝臟病雜志，2011，11：574.

18Islam S，Antonsson L，Westin J，et al.Cirrhosis in hepatitis C virus-infected patients can be excluded using and index of standard biochemical serum markers.Scand J Gastroenterol，2005,40：867-872.

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.21.034

214000江蘇省無錫市第九人民醫(yī)院檢驗(yàn)科

R 446.11

A

1002-7386(2016)21-3312-03

2016-03-20)