韓健鵬，　王改青，　胥　毅，　甄俊平

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磁共振成像評(píng)價(jià)去鐵酮、氯碘羥喹對(duì)大鼠腦出血后鐵超載的干預(yù)效果

韓健鵬1，王改青1，胥毅2，甄俊平2

目的比較去鐵酮、氯碘羥喹對(duì)大鼠腦出血模型鐵含量及腦水腫的干預(yù)效果。方法將24只Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦出血(ICH)組、去鐵酮組、氯碘羥喹組，大鼠右側(cè)紋狀體區(qū)注入膠原酶IV 0.4 U、肝素鈉4 U制作腦出血模型。術(shù)后6 h開(kāi)始灌胃干預(yù)組分別給予去鐵酮[125 mg/(kg·次)，1 次/12 h]、氯碘羥喹[50 mg/(kg·次)，1次/12 h]，假手術(shù)組和腦出血組給予等量溶劑。并于術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d各時(shí)間點(diǎn)行神經(jīng)功能學(xué)行為評(píng)分，通過(guò)ESWAN評(píng)估病灶鐵含量、T2*WI評(píng)估血腫體積、T2WI評(píng)估血腫周?chē)[體積，14 d處死大鼠行腦組織鐵染色。結(jié)果腦出血1 d后即出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損以1～3 d最重。14 d與假手術(shù)組無(wú)明顯差別。與此相似，MRI顯示血腫周?chē)X水腫體積以1～3 d最明顯，7～14 d與假手術(shù)組無(wú)顯著差別。MRI同時(shí)顯示出血后腦鐵含量增加，以7～14 d最明顯，其后逐漸消退。氯碘羥喹可改善大鼠神經(jīng)功能缺損，以第3～7 d最明顯，可減少出血后3 d血腫周?chē)[及3～7 d血腫周?chē)X組織鐵含量，而去鐵酮干預(yù)顯著減輕腦出血后3～7 d鐵含量，血腫周?chē)[體積未見(jiàn)明顯減少、神經(jīng)功能缺損未見(jiàn)明顯改善。結(jié)論MRI顯示腦出血后1～3 d血腫周?chē)[體積、7～14 d腦鐵含量較對(duì)照組顯著增加，去鐵酮、氯碘羥喹均可降低腦鐵含量，氯碘羥喹可降低出血后3d血腫周?chē)[體積，改善出血后3～7 d神經(jīng)功能缺損。

腦出血；去鐵酮；氯碘羥喹；磁共振成像；腦水腫；鐵含量

腦出血是腦卒中重要亞型，病死率、致殘率居高不下。腦出血后病理生理機(jī)制尚未完全闡明，其中鐵離子作為血紅蛋白重要代謝產(chǎn)物，可介導(dǎo)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA氧化損傷而加重腦損害[1～3]。多數(shù)研究采用鐵超載作為藥物干預(yù)靶點(diǎn)，其中去鐵胺使用較多。實(shí)驗(yàn)證實(shí)去鐵胺在大鼠全血腦出血模型中的神經(jīng)保護(hù)作用[1]。去鐵酮臨床去鐵療效確切，具有口服易吸收、血腦屏障通透性高[4]、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，有望替代去鐵胺治療。而二價(jià)鐵螯合劑氯碘羥喹可恢復(fù)神經(jīng)退行性疾病腦內(nèi)鐵水平，逆轉(zhuǎn)神經(jīng)萎縮，神經(jīng)保護(hù)作用已顯現(xiàn)[5]。本課題組前期從腦內(nèi)鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)[2，4]、鐵介導(dǎo)的氧化損傷[5]方面考察上述兩種藥物腦出血干預(yù)效果。MRI作為一種無(wú)創(chuàng)、活體、動(dòng)態(tài)、多參數(shù)定量工具[6]，已廣泛用于腦出血研究。目前尚未有MRI方面鐵螯合劑效果評(píng)價(jià)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在從MRI角度動(dòng)態(tài)觀察去鐵酮、氯碘羥喹對(duì)血腫大小、腦水腫、鐵含量及神經(jīng)功能的影響。

1　材料及方法

1.1模型制備選取3月齡雄性Wistar大鼠24只，體重250～300 g，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)和自由飲水，室內(nèi)溫度20～25 ℃，濕度適中。采用隨機(jī)數(shù)字表法，分為4組：假手術(shù)組、腦出血組、去鐵酮組、氯碘羥喹組，每組再分為1 d、3 d、7 d、14 d 4個(gè)亞組，每亞組6只。大鼠稱(chēng)重后腹腔注射5%水合氯醛(0.8 ml/100 g體重)，麻醉程度適宜后將大鼠俯臥位固定于立體定位儀上實(shí)施手術(shù)。頭正中縱行切開(kāi)長(zhǎng)約1 cm手術(shù)切口，充分暴露前囟，將針頭固定在立體定位儀(深圳瑞沃德)上，參照Fan等[7]的方法調(diào)整坐標(biāo)為前囟后0.2 mm，矢狀縫右側(cè)旁開(kāi)3.0 mm，標(biāo)記后鉆孔，抽取配制的藥物：膠原酶IV(美國(guó)Sigma) 0.2 U/μl+肝素鈉2 U/μl共2μl后再次固定微量注射器(上海高鴿)，緩慢進(jìn)針深度為5.5 mm，藥物在5 min內(nèi)注射完畢，停留10 min后緩慢退針?lè)乐顾幰阂绯?，用骨蠟封閉鉆孔，局部消毒，縫合皮膚，做好標(biāo)記后回籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組同之前麻醉、固定、切開(kāi)、定位、鉆孔、進(jìn)針、退針、縫合等步驟，不同的是不注入藥物。因氯碘羥喹(武漢鴻信康)、去鐵酮(加拿大奧貝泰克)分別為脂溶性、水溶性藥物，配制時(shí)用1%羧甲基纖維素鈉生理鹽水溶液2 ml作為溶劑。術(shù)后6 h開(kāi)始灌胃干預(yù)組分別給予去鐵酮(125 mg/(kg·次)，1次/12 h)、氯碘羥喹[50mg/(kg·次)，1次/12 h]。假手術(shù)組和腦出血組灌胃等量溶劑。

1.2行為學(xué)評(píng)分術(shù)后1 d大鼠Rosenberg評(píng)分[8]達(dá)到1級(jí)以上，且MRI掃描示大鼠紋狀體區(qū)局灶性圓形或類(lèi)圓形的出血灶則認(rèn)為造模成功，如無(wú)明顯神經(jīng)功能缺損或MRI上血腫破入腦室的大鼠予以剔除。腦出血組麻醉時(shí)及術(shù)后7 d大鼠各死亡1只，氯碘喹組術(shù)后死亡1只，均再次造模補(bǔ)足數(shù)量。按Garcia 等的方法[9]在術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d等相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)行神經(jīng)功能障礙程度評(píng)分。

1.3MRI檢查利用我院影像科Signa 1.5T HDXMRI設(shè)備、膝關(guān)節(jié)線圈對(duì)各組別各時(shí)間點(diǎn)的大鼠成像。腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠后，將其俯臥置于膝關(guān)節(jié)線圈中，用三維掃描成像序列定位大鼠在磁體中的坐標(biāo)。掃描序列包括T1WI 、T2WI 、T2*WI、ESWAN序列。T1WI、T2WI采用快速自旋回波序列，T2*WI采用梯度自旋回波序列。參數(shù)如下：(1)FSE T1WI：TR：580 ms，TE：25.5 ms，F(xiàn)OV：18.0 mm，phase FOV：0.6，層厚：2.0 mm，間隔：0.2 mm，矩陣：512×448，激勵(lì)次數(shù)：6。(2)FSE T2WI：TR：2380 ms，TE：127.7 ms，F(xiàn)OV：18.0 mm，phase FOV：0.6，層厚：2.0 mm，間隔：0.2 mm，矩陣：512×448，激勵(lì)次數(shù)：8。FOV：16.0，phase FOV：0.6。(3)T2*WI：TR：400 ms，TE：15 ms，層厚：2.0 mm，間隔：0.2 mm，矩陣：448×384，翻轉(zhuǎn)角：15°，激勵(lì)次數(shù)：4。(4)ESWAN：TR：49.5 ms，層厚：21.5 mm，矩陣：448×448，翻轉(zhuǎn)角：15°，激勵(lì)次數(shù)：4，F(xiàn)OV：18.0，phase FOV：0.75。

1.4血腫體積、水腫體積測(cè)定參照J(rèn)ack等[10]的方法，在T2*WI測(cè)量血腫病灶各層面的長(zhǎng)徑A 、寬徑 B，取3次測(cè)量平均值，按公式：∏/6×A×B計(jì)算出各個(gè)層面病灶面積，各層面積之和乘以血腫層數(shù)、層厚即為血腫體積。類(lèi)似方法計(jì)算T2WI序列上血腫+水腫帶的體積，兩者相減得到水腫體積。不同時(shí)間點(diǎn)各序列血腫及周?chē)M織信號(hào)的變化特征由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富神經(jīng)科醫(yī)師描述提供，均對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不知情。

1.5鐵含量測(cè)定掃描結(jié)束后，將數(shù)據(jù)傳送至MRI后處理工作站中，利用Functool軟件包處理ESWAN序列獲得幅度圖、相位圖。采用盲法，由1位有MRI診斷經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師選取感興趣區(qū)最清楚的層面并勾畫(huà)出其邊界、測(cè)量數(shù)值。3次測(cè)量的平均值作為最終幅度值，因其數(shù)值分散，故取幅度log值進(jìn)行比較。

1.6鐵染色腦組織后半部分切成層厚2 mm的薄片，放入4%多聚甲醛中4 ℃過(guò)夜，之后入30%蔗糖溶液脫水直至腦組織沉底，行25 μm冰凍切片，入20%亞鐵氰化鉀5 ml、濃鹽酸0.9 ml組成的工作液浸染30 min，蒸餾水洗滌2次每次3 min，伊紅水溶液復(fù)染20 s，再次入蒸餾水水洗3次(同上)，常規(guī)脫水，透明中性樹(shù)膠封片。顯微鏡(10×40)下隨機(jī)選取血腫周?chē)恢丿B視野，照相后利用image J軟件分析計(jì)算每只大鼠腦片鐵沉積顆粒面積。

2　結(jié)　果

2.1行為學(xué)評(píng)分腦出血組及兩個(gè)干預(yù)組在術(shù)后1～14 d的神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著低于各相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的假手術(shù)組(P<0.05)，且4組均呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)，以術(shù)后1～3 d神經(jīng)功能缺損最重；與腦出血組比較，氯碘羥喹干預(yù)腦出血可顯著改善大鼠神經(jīng)功能，以3～7 d最明顯，14 d與腦出血組無(wú)明顯差別。去鐵酮干預(yù)組神經(jīng)功能缺損未見(jiàn)明顯改善(見(jiàn)表1)。

2.2腦血腫體積的比較T2*WI上腦出血后第1 d血腫體積最大，之后血腫逐漸吸收縮小。干預(yù)組血腫體積與腦出血組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即去鐵酮、氯碘羥喹對(duì)血腫演變無(wú)影響。兩個(gè)干預(yù)組間各時(shí)間點(diǎn)血腫體積無(wú)顯著差異(見(jiàn)表2、圖1)。

2.3腦水腫體積測(cè)定與假手術(shù)組相比，T2WI上腦出血組腦水腫體積在腦出血后1 d即顯著升高，術(shù)后1～3 d最顯著，隨后逐漸下降，7～14 d無(wú)顯著差別。兩組干預(yù)組腦水腫體積變化與腦出血組呈現(xiàn)相同趨勢(shì)，但在腦出血后給予氯碘羥喹干預(yù)可顯著減少3～7 d腦水腫體積，且去鐵酮干預(yù)與ICH組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見(jiàn)表3、圖2)。

2.4腦組織含鐵量測(cè)定ESWAN序列顯示腦出血后血腫區(qū)幅度log值逐漸降低，即鐵沉積逐漸增多，術(shù)后3～7 d最明顯，第14 d達(dá)峰值；與腦出血組比較，干預(yù)組各時(shí)點(diǎn)大鼠的幅度log值均顯著高于對(duì)照組，鐵沉積明顯較少，以3～7 d減少最明顯。兩個(gè)干預(yù)組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表4、圖3)。

2.5鐵染色中血腫周?chē)F離子沉積測(cè)定14 d處死大鼠行腦組織學(xué)鐵染色，腦出血組、去鐵酮組、氯碘羥喹組血腫周?chē)F離子沉積量分別為52.43±1.52、24.88±1.01、27.84±3.11，均顯著高于假手術(shù)組，兩個(gè)干預(yù)組鐵含量均低于腦出血組，提示鐵螯合劑可減輕腦鐵含量，而干預(yù)組間鐵顆粒面積無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見(jiàn)圖4)。

表1　不同時(shí)間點(diǎn)行為學(xué)評(píng)分的比較±s，n=6)

與假手術(shù)組比較#P<0.05；與腦出血組比較*P<0.05；與去鐵酮組比較&P<0.05；與同組前一時(shí)間點(diǎn)比較△P<0.05

表2　T2*WI序列測(cè)量的腦血腫體積的比較

與同組前一時(shí)間點(diǎn)比較△P<0.05

表3　T2WI序列測(cè)量的腦水腫體積的比較±s)

與假手術(shù)組比較#P<0.05；與腦出血組比較*P<0.05；與去鐵酮組比較&P<0.05；與同組前一時(shí)間點(diǎn)比較△P<0.05

表4　ESWAN序列幅度log值的比較

與假手術(shù)組比較#P<0.05；與腦出血組比較*P<0.05；與去鐵酮組比較&P<0.05；與同組前一時(shí)間點(diǎn)比較△P<0.05

在T2*加權(quán)上1 d血腫表現(xiàn)為低信號(hào)，而3～7 d圖像表現(xiàn)為相對(duì)低信號(hào)，內(nèi)部混雜少許高信號(hào)，14 d呈低信號(hào)

圖1T2*WI序列顯示各組大鼠相應(yīng)時(shí)點(diǎn)腦血腫及其演變

該圖對(duì)血腫成像較T2*WI清晰，測(cè)量圖中血腫區(qū)感興趣區(qū)可得到幅度值可評(píng)估血腫周?chē)X鐵沉積。結(jié)果顯示鐵沉積逐漸增多，術(shù)后3～7 d最明顯，14 d達(dá)峰值。干預(yù)組較對(duì)照組鐵沉積明顯較少，以3～7 d減少最明顯

圖3ESWAN序列的幅度圖顯示各組大鼠相應(yīng)時(shí)點(diǎn)腦血腫及其演變

1 d以低信號(hào)血腫為主，伴周邊少量高信號(hào)水腫區(qū)，3 d、7 d圖像表現(xiàn)為中心高信號(hào)或混雜信號(hào)伴周?chē)托盘?hào)環(huán)，14 d表現(xiàn)為等信號(hào)或混雜信號(hào)，伴周?chē)托盘?hào)鐵環(huán)，周?chē)[效應(yīng)消失

圖2T2WI序列顯示各組大鼠相應(yīng)時(shí)點(diǎn)腦組組織影像學(xué)表現(xiàn)

圖4　14 d大鼠血腫周?chē)X組織鐵離子沉積(×400)

3　討　論

血腫通過(guò)繼發(fā)凝血級(jí)聯(lián)(特別是凝血酶生成)，血紅蛋白分解產(chǎn)物和炎癥反應(yīng)在ICH誘導(dǎo)的損傷中發(fā)揮重要作用，通過(guò)血腦屏障損害、腦水腫、氧化損傷、病灶周?chē)嗉?xì)胞參與的炎癥反應(yīng)、微循環(huán)障礙等多中間環(huán)節(jié)參與，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞損傷和神經(jīng)功能障礙[11]。其中，腦出血后血紅蛋白(Hb)在血紅素加氧酶1等作用下降解為鐵離子等代謝產(chǎn)物，鐵蛋白未螯合的不穩(wěn)定鐵通過(guò)Fenton反應(yīng)引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生大量活性氧簇，超過(guò)細(xì)胞自身抗氧化能力[2，3]，引發(fā)DNA氧化損傷、脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、Na+-K+-ATP酶損害等加重細(xì)胞損傷[1～3]。原代培養(yǎng)的大鼠小腦顆粒細(xì)胞在加入FeSO4的培養(yǎng)液中發(fā)生的損害證實(shí)了上述觀點(diǎn)[12]。研究說(shuō)明鐵促進(jìn)氧化應(yīng)激產(chǎn)生活性氧在神經(jīng)元損傷、組織水腫中起重要作用。

本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)大鼠紋狀體區(qū)內(nèi)注射膠原酶Ⅳ、肝素建立腦出血模型并給予去鐵酮、氯碘羥喹干預(yù)，通過(guò)核磁成像顯示兩種鐵鰲合劑干預(yù)下腦鐵含量、血腫體積、腦水腫的動(dòng)態(tài)演變。腦出血后血紅蛋白各階段演變可在MRI產(chǎn)生不同的信號(hào)強(qiáng)度。腦出血急性期內(nèi)，T1WI上呈高信號(hào)，T2WI上呈低信號(hào)與缺氧血紅蛋白縮短T2相關(guān)。亞急性期 (3～14 d)，早期紅細(xì)胞內(nèi)Hb氧化成正鐵Hb由血腫外周向中心發(fā)展，故可將血腫區(qū)清楚地劃分中心區(qū)、周?chē)鷧^(qū)[6]。在亞急性晚期，高鐵血紅蛋白沉積在細(xì)胞外，呈短 T1、長(zhǎng) T2，因此在 T1WI和 T2WI上均呈高信號(hào)。灶周水腫在 T1W I上呈低信號(hào)，在T2WI上呈高信號(hào)。我們動(dòng)態(tài)觀察腦出血后MRI信號(hào)特點(diǎn)顯示腦出血后1 d 4組腦鐵含量無(wú)明顯差別；腦鐵含量在對(duì)照組及干預(yù)組3 d、7 d、14 d較假手術(shù)組明顯增高，且以7～14 d最高，之后緩慢下降。提示腦出血后3 d鐵開(kāi)始積累，7 d達(dá)高峰，之后仍維持在較高的水平。大多研究采用perls鐵染色、分光光度分析法對(duì)ICH后腦組織樣本或切片的非血紅素鐵即鐵離子的測(cè)定也得到類(lèi)似結(jié)果。Wu等[13]的研究顯示在腦出血后1 d血腫周?chē)鷧^(qū)域即出現(xiàn)鐵陽(yáng)性細(xì)胞，紅細(xì)胞裂解始于腦出血后1 d。鐵積累時(shí)間晚于紅細(xì)胞裂解，顯示紅細(xì)胞裂解速率快慢、腦組織內(nèi)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白自身清除鐵機(jī)制兩者間的平衡與腦鐵含量變化相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)氯碘羥喹可減少出血后3 d血腫周?chē)[及3～7 d血腫周?chē)X組織鐵含量，改善大鼠神經(jīng)功能缺損，而去鐵酮干預(yù)顯著減輕腦出血后3～7 d鐵含量，血腫周?chē)[體積未見(jiàn)明顯減少、神經(jīng)功能缺損未見(jiàn)明顯改善。兩種鐵螯合劑干預(yù)腦水腫效應(yīng)差異提示二價(jià)鐵在腦損害中可能起關(guān)鍵作用。對(duì)局部Fe2+的有效結(jié)合及轉(zhuǎn)運(yùn)可能阻斷了Haber-Weiss反應(yīng)進(jìn)而減輕氧化應(yīng)激損傷、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、改善腦水腫有關(guān)[14]。去鐵酮、氯碘羥喹在年齡相關(guān)神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病中改善大腦功能和延緩疾病的進(jìn)展的作用差異與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類(lèi)似[3]，可能與其降低線粒體酶CLK-1的活性[15]、刺激腫瘤壞死因子的釋放[16]等神經(jīng)保護(hù)作用相關(guān)，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

氯碘羥喹治療退行性疾病和癌癥療效顯現(xiàn)[3，15，16]，各方面研究成為熱點(diǎn)，氯碘羥喹用于腦出血后治療研究較少，其作用效果和具體的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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The effect evaluation of deferiprone，clioquinol on iron overload in intracerebral hemorrhage rats by MRI

HANJianpeng，WANGGaiqing，XUYi，etal.

(DepartmentofNeurology，ShanximedicalUniversitySecondHospital，Taiyuan030001，China)

ObjectiveTo compare the effect of deferiprone and clioquinol on brain edema and iron contents in intracerebral hemorrhage rats by MRI. Methods24 Wistar rats were randomly assigned to sham group，intracerebral hemorrhage group，deferiprone intervention group，clioquinol intervention group. The right striatum of rats were injected with collagenase IV 0.4 U，heparin 4 U to build intracerebral hemorrhage models. All gavages were administered intragastrically 6 h after ICH. Deferiprone intervention group was given deferiprone gavage(125 mg/kg/times，once every 12 h)，clioquinol intervention group were given clioquinol (50mg/kg/times，once every 12 h)，sham group and intracerebral hemorrhage group received the same amount of solvent. The neurological function scores were evaluated and magnetic resonance imaging was carried out. ESWAN was used for estimating intralesional iron contents，T2*WI for hematoma volumes，T2WI for edema volumes around the hematoma at 1 d，3 d，7 d，14 d after ICH. At day14 rats were sacrificed and the brain tissues collected were used for iron staining. ResultsNeurological deficits appeared on day 1 after cerebral hemorrhage and were most severe on day 1～3.There was no significant differences between intracerebral hemorrhage group and sham group at day 14.Similarly，MRI revealed that brain edema volumes around the hematoma peaked at 1～3 d. No significant differences exited compared with sham group at day 7～14. MRI also showed that cerebral iron contents increased most obviously at 7～14 d，and then gradually subsided. Clioquinol significantly improved nerurological function at day 3～7，reduced brain edema volumes at day 3 and cerebral iron contents around the hematoma at day 3～7 after surgery. However，deferiprone significantly reduced iron contents at day 3～7，without decreasing edema volumes around hematoma and alleviating nerurological deficits. ConclusionMRI showed edema volumes around the hematoma significantly increased at day 1～3 and iron contents at day 7～14 compared with intracerebral hemorrhage group after ICH. Deferiprone，clioquinol as iron chelators can both reduce iron contents，clioquinol can reduce edema volumes at 3 d and alleviate neurological deficits at 3～7 d；There were no significantly reduced brain water contents and no obviously improved neurological deficits observed in deferiprone intervention group.

Intracerebral hemorrhage；Deferiprone；Clioquinol；MRI；Brain edema；Iron contents

1003-2754(2016)05-0420-05

2016-01-20；

2016-04-07

山西省衛(wèi)生廳科研課題(No. 201301010)；山西省基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(No. 2014011041-5)

(1.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院影像科，山西 太原 030001)

王改青，E-mail：wanggq08@126.com

R743.34

A