常麗賢，章婧嫽，任媛媛，孫聰聰，萬揚(yáng)，安文彬，張英馳，袁衛(wèi)平，竺曉凡

針對(duì)人DNAH2蛋白的鼠源單克隆抗體的制備

常麗賢，章婧嫽，任媛媛，孫聰聰，萬揚(yáng)，安文彬，張英馳，袁衛(wèi)平，竺曉凡△

目的制備特異性的鼠源單克隆抗DNAH2（Homo sapiens dynein，axonemal，heavy chain 2）抗體。方法首先針對(duì)人DNAH2蛋白N端1～300 aa序列，構(gòu)建可表達(dá)His標(biāo)簽的免疫原融合表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌內(nèi)以IPTG誘導(dǎo)His-免疫原的表達(dá)并純化；然后免疫BALB/c小鼠，分離出脾淋巴細(xì)胞，并與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞；最后以酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）、蛋白免疫印跡法（Western blot）篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。結(jié)果利用IPTG有效誘導(dǎo)了大腸桿菌內(nèi)DNAH2免疫原的表達(dá)；篩選的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞檢測(cè)出DNAH2蛋白條帶。結(jié)論成功制備針對(duì)人DNAH2蛋白的鼠源單克隆抗體。

抗體，單克??；雜交瘤；質(zhì)粒；重組，遺傳；DNAH2

DNAH2（Homo sapiens dynein，axonemal，heavy chain 2）蛋白是由定位于17p13.1的DNAH2基因編碼的蛋白質(zhì)，包括4 427個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量約為500 ku，是組成內(nèi)側(cè)動(dòng)力臂的主要成分，可通過三磷酸腺苷（ATP）水解酶的作用參與細(xì)胞纖毛的運(yùn)動(dòng)［1-3］。然而，學(xué)者們對(duì)于DNAH2基因的研究非常有限，目前尚無針對(duì)DNAH2蛋白的單克隆抗體。本研究旨在通過單克隆技術(shù)制備抗人DNAH2蛋白的鼠源單克隆抗體，為DNAH2蛋白的功能研究提供蛋白工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物U2OS細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0）為本實(shí)驗(yàn)室凍存；SPF級(jí)近交系BALB/c小鼠，雌性，4～6周齡，體質(zhì)量12～16 g，購(gòu)自天津科儀嘉欣科技有限公司，飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室SPF環(huán)境中。

1.1.2 試劑與儀器PEG4000購(gòu)自德國(guó)MERCK公司；HAT培養(yǎng)基添加劑、RPMI 1640、胎牛血清（FBS）購(gòu)自GIBCO公司；BCA蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自Pierce公司；血藍(lán)蛋白（KHL）、弗氏（不）完全佐劑、單克隆鼠源抗β-actin一抗購(gòu)自Sigma公司；鼠源抗His抗體購(gòu)自MBL公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠源IgG二抗購(gòu)自KPL公司；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；BeyoECL Plus（超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒）購(gòu)自碧云天公司；牛血清白蛋白（BSA）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、考馬斯亮蘭染色液、SDS上樣緩沖液購(gòu)自天津科儀嘉欣科技有限公司；AKTA蛋白純化系統(tǒng)購(gòu)自GE公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫原的獲取利用MBL抗原檢索系統(tǒng)對(duì)人源DNAH2的功能區(qū)域進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，分析其抗原性，確定多肽候選氨基酸序列，再由北京博爾邁生物技術(shù)有限公司針對(duì)此序列通過基因工程方式將其連接入帶有His標(biāo)簽的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（+）。在大腸桿菌內(nèi)通過IPTG誘導(dǎo)His-免疫原的表達(dá)，然后進(jìn)行考馬斯亮蘭染色和蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)。以LB培養(yǎng)基搖菌擴(kuò)增有His標(biāo)簽的免疫原融合表達(dá)質(zhì)粒（37℃，100 r/min過夜培養(yǎng)）；加入IPTG（24 g/L）誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，28℃，120 r/min繼續(xù)培養(yǎng)2 h；4℃、15 000 r/min，離心5 min；同時(shí)以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的陰性對(duì)照組，再分別以細(xì)菌裂解緩沖液（1×PBS、2%TritonX-100）重懸菌體沉淀；超聲裂解細(xì)菌2次后4℃靜置10 min，13 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至1.5 mL離心管中。分別獲取IPTG（-）未誘導(dǎo)組全液、IPTG（+）誘導(dǎo)組全液、IPTG（+）誘導(dǎo)組上清、IPTG（+）誘導(dǎo)組沉淀樣品，加入SDS上樣緩沖液，99℃熱變性10min，分別進(jìn)行考馬斯亮蘭染色和6%SDS-PAGE電泳。同時(shí)取0.5 μg、1.0 μg、2.0 μg的BSA樣品作為考馬斯亮蘭染色后條帶純度及位置的陽(yáng)性參考。SDS-PAGE電泳結(jié)束后，以濕轉(zhuǎn)法將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h，加入鼠源抗His標(biāo)簽抗體（1∶1 000），4℃孵育過夜。TBST溶液洗膜3次，10 min/次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠源IgG二抗（1∶15 000）室溫孵育1 h。TBST溶液洗膜后加入BeyoECL Plus（超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒）后暗室曝光。檢測(cè)合格后，利用上述方法大量誘導(dǎo)攜帶His標(biāo)簽的免疫原，再通過His標(biāo)簽，利用Ni Sepharose?6 Fast Flow-AKTA蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行免疫原的純化。純化后以考馬斯亮蘭染色進(jìn)行鑒定。

1.2.2 動(dòng)物免疫將200 μg免疫原與弗氏完全佐劑混合，對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行腹腔注射，每只小鼠免疫量為50 μg。初次免疫后，將200 μg免疫原與弗氏不完全佐劑混合，進(jìn)行2～3次免疫。

1.2.3 細(xì)胞融合首先從免疫后BALB/c雌性小鼠的脾臟組織中分離脾淋巴細(xì)胞，同時(shí)以10%FBS-RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0）；然后將骨髓瘤細(xì)胞與脾淋巴細(xì)胞按2∶1～10∶1的比例混合后離心，加入等量50%PEG，進(jìn)行3次細(xì)胞融合，以形成多個(gè)雜交瘤，以10%FBS-RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，并進(jìn)行編號(hào)，再分離收集上清液為“單克隆前抗體液”，以ELISA進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)。酶標(biāo)板每孔加入50 μL以PBS稀釋的免疫原（1 mg/L），4℃靜置包被過夜；棄去各孔液體后加入封閉液處理1 h；甩干后加入不同稀釋比例的多克隆抗體液，37℃孵育1 h；洗滌后加入POD標(biāo)記的抗小鼠源IgG二抗，37℃孵育1 h；洗滌后TMB顯色，反應(yīng)終止，檢測(cè)光密度（OD）值。當(dāng)OD＞0.2時(shí)進(jìn)一步行Western blot檢測(cè)，其中所采用的樣品為U2OS全細(xì)胞裂解液。在500 ku附近出現(xiàn)條帶視為陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。

1.2.4 單克隆雜交瘤細(xì)胞的篩選在96孔板中以含15% FBS的HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)上述經(jīng)過ELISA、Western blot初步鑒定的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，采用有限稀釋法稀釋細(xì)胞，再采用半量換液法，每隔3 d更換HAT培養(yǎng)基1次，第10天吸取少量上清液為“單克隆抗體液”，再依次以ELISA、Western blot進(jìn)行篩選。2周后更換培養(yǎng)基為HT培養(yǎng)基。將陽(yáng)性孔細(xì)胞陸續(xù)轉(zhuǎn)移至24孔、12孔、6孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。陸續(xù)收集上清，再以Western blot進(jìn)行效價(jià)鑒定。合格者即為制備的單克隆鼠源抗DNAH2抗體。

2 結(jié)果

2.1 DNAH2免疫原位點(diǎn)的分析通過MBL抗原檢索系統(tǒng)對(duì)人源DNAH2的功能區(qū)域進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，分析其抗原性。從溶解度（accessibility）、柔韌性（flexibility）、露在分子表面的難易度（surface probability）、抗原性（antigenecity）、親水性（hydrophilicity）、極性（dipole）等因素發(fā)現(xiàn)人DNAH2蛋白（NP_065928.2）N端1～300 aa序列的綜合抗原性分?jǐn)?shù)（total antigenic score）較高，露在分子表面的概率較大。另外，此段序列為人DNAH2蛋白1～3亞型的共有片段，與小鼠DNAH2相比差異很大、特異性較高，故選擇人DNAH2蛋白N端1～300 aa序列來表達(dá)重組蛋白抗原，作為免疫BALB/c小鼠的免疫原，見圖1。

2.2 DNAH2免疫原的鑒定針對(duì)人DNAH2蛋白N端1～300 aa序列，構(gòu)建可表達(dá)His標(biāo)簽的免疫原融合表達(dá)質(zhì)粒，然后在大腸桿菌內(nèi)通過IPTG誘導(dǎo)His-免疫原的表達(dá)，以考馬斯亮蘭染色和Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行純化前的初步鑒定。在分子質(zhì)量37 ku附近有重組蛋白目的條帶出現(xiàn)，而在IPTG（+）誘導(dǎo)組沉淀中目的蛋白表達(dá)量最多，故對(duì)沉淀部分進(jìn)行純化獲取目的蛋白，見圖2。經(jīng)過純化處理后，再次進(jìn)行考馬斯亮蘭染色鑒定。在分子質(zhì)量約37 ku附近檢測(cè)到目的蛋白條帶，且純度較高。純化獲取的重組蛋白總量為3 mg，見圖3。

2.3 單克隆抗DNAH2抗體的Western blot分析以純化后的免疫原免疫BALB/c小鼠后，從脾臟中分離脾淋巴細(xì)胞，并與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞；挑選單克隆后獲得3個(gè)單克隆鼠源抗DNAH2抗體，再進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，分析DNAH2抗體的有效性，以及U2OS細(xì)胞中DNAH2蛋白的表達(dá)。在分子質(zhì)量約500 ku附近檢測(cè)到目的蛋白條帶，表明制備的3個(gè)抗體均有效，U2OS細(xì)胞可表達(dá)DNAH2蛋白，見圖4。

Fig.1Analysis of DNAH2 immunogen site圖1 DNAH2免疫原位點(diǎn)的分析

Fig.2Coomassie blue staining and Western blot assay in unpurified immunogen圖2 未純化免疫原的考馬斯亮蘭染色和Western blot檢測(cè)

Fig.3Coomassie blue staining of purified immunogen圖3 純化后免疫原的考馬斯亮蘭染色

Fig.4Western blot assay showing monoclonal mouse anti-DNAH2 antibody圖4 單克隆鼠源抗DNAH2的Western blot檢測(cè)

3 討論

作為細(xì)胞表面的骨架蛋白特化結(jié)構(gòu)，纖毛是廣泛存在于動(dòng)、植物細(xì)胞中的“運(yùn)動(dòng)器官”［3-4］。纖毛的基本結(jié)構(gòu)包括纖毛膜、纖毛基質(zhì)及軸絲。軸絲是纖毛的骨架結(jié)構(gòu)，由位于中央的中央微管、周圍9排環(huán)形排列的二聯(lián)微管及其附屬蛋白構(gòu)成。二聯(lián)微管包含A管和B管，兩者緊密連接，從A管伸出兩條短臂，分別稱為外側(cè)動(dòng)力臂和內(nèi)側(cè)動(dòng)力臂。其中，內(nèi)側(cè)動(dòng)力臂具有ATP酶活性，可將化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)闄C(jī)械能，促進(jìn)AB微管之間的相對(duì)滑動(dòng)和纖毛的彎曲，導(dǎo)致纖毛運(yùn)動(dòng)［3-4］。

DNAH2蛋白從N端至C端所包含的區(qū)域依次為:（1）動(dòng)力蛋白的莖干Stem（包含DHC N1和DHC N2）。（2）AAA-6（包含AAA1與P-loop-NTPase）。（3）AAA2（包含1個(gè)P-loop-NTPase）。（4）AAA3（包含2個(gè)AAA超家族）。（5）TPR2。（6）AAA4。（7）P-loop-NTPase。（8）Stalk。（9）MT（動(dòng)力蛋白微管結(jié)合莖）。（10）AAA5（包括AAA-9）。（11）重鏈和動(dòng)力蛋白區(qū)D6（包括AAA-6、TRP4及TRP5）11個(gè)區(qū)域［1-3］。另外，位于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的最后一個(gè)P環(huán)往往與C端的區(qū)域呈伸展的“線圈”，該結(jié)構(gòu)可能是與其他蛋白質(zhì)相互作用的位點(diǎn)［1-3］。目前對(duì)于DNAH2蛋白的研究數(shù)據(jù)十分有限，針對(duì)DNAH2蛋白的商品化抗體也均為多克隆抗體。本實(shí)驗(yàn)是以基因工程手段人工表達(dá)DNAH2蛋白N端1～300 aa片段，并以其為免疫原免疫小鼠，通過細(xì)胞融合-雜交瘤細(xì)胞篩選制備抗人DNAH2的小鼠源單克隆抗體。

在形成大分子蛋白質(zhì)嚴(yán)密的空間結(jié)構(gòu)中，特定位點(diǎn)氨基酸的種類、電荷量、極性等屬性與蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)的形成和生理功能的發(fā)揮密切相關(guān)。當(dāng)DNAH2蛋白發(fā)生特定位點(diǎn)的點(diǎn)突變時(shí)，可能會(huì)改變氨基酸所在部位與水的親和力，干擾DNAH2的ATP水解酶活性，從而影響DNAH2的蛋白結(jié)合作用。前期的全外顯子組測(cè)序表明DNAH2蛋白的點(diǎn)突變與范可尼貧血（Fanconi anemia，F(xiàn)A）之前存在潛在的關(guān)聯(lián)［5］。范可尼貧血是一種常染色體或X連鎖隱性遺傳性疾病，以造血衰竭為主要臨床表現(xiàn)，常并發(fā)多種先天軀體畸形或?qū)嶓w腫瘤［6-8］。本實(shí)驗(yàn)室將利用制備的小鼠單克隆抗人DNAH2抗體進(jìn)行免疫共沉淀、質(zhì)譜分析等相關(guān)蛋白組學(xué)研究，探討DNAH2蛋白與范可尼貧血的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)也為DNAH2的功能研究提供了更好的蛋白工具，具有一定的實(shí)用意義。

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（2016-04-09收稿2016-07-08修回）

（本文編輯魏杰）

The preparation of the mouse monoclonal antibodies specific for the DNAH2 protein

CHANG Lixian，ZHANG Jingliao，REN Yuanyuan，SUN Congcong，WAN Yang，AN Wenbin，
ZHANG Yingchi，YUAN Weiping，ZHU Xiaofan△State Key Laboratory of Experimental Hematology，Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Tianjin 300020，China△

ObjectiveTo prepare specific mouse monoclonal antibodies against Homo sapiens dynein，axonemal，heavy chain 2（DNAH2）.MethodsFirstly，recombinant plasmid encoding His tagged immunogen，targeting N-terminal sequence of DNAH2 protein（1-300 aa），in E.coli was constructed.IPTG was used to induce the expression of Hisimmunogen，which was then purified and immunized in BALB/c mice.Hybridoma cells were obtained through the fusion between myeloma cells and splenocytes isolated from BALB/c mice.Finally，ELISA and Western blot assays were performed to screen the positive hybridoma.ResultsIPTG was used efficiently to induce the expression of DNAH2 immunogen in E.coli.DNAH2 protein bands were detected in screened positive hybridoma.ConclusionMouse monoclonal anti-DNAH2 antibody is prepared successfully.

antibodies，monoclonal；hybridomas；plasmids；recombination，genetic；DNAH2

R341.1，R349.83

A

10.11958/20160317

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81500156，81170470）

天津，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院血液學(xué)研究所（郵編300020）

常麗賢（1984），女，醫(yī)師，博士，主要從事范可尼貧血的相關(guān)機(jī)制研究

△通訊作者E-mail:xfzhu@ihcams.ac.cn