林克勤，易文，褚嘉祐

雜交瘤研究中染色體分析的方法及其意義

林克勤，易文，褚嘉祐

【摘要】

目的探討細(xì)胞同步化染色體高分辨技術(shù)檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞染色體的可行性。

方法選擇小鼠骨髓瘤 SP-2/O 細(xì)胞株、人淋巴母細(xì)胞CKM-8 細(xì)胞株、人骨髓瘤 KM 細(xì)胞株、抗小鼠胰腺癌鼠-鼠雜交瘤細(xì)胞株，體外培養(yǎng) 24 ～ 48 h。對(duì) 4 種細(xì)胞株分別進(jìn)行同步化處理，加入 5-氟脫氧尿嘧啶核苷和尿嘧啶培養(yǎng)16 ～ 18 h 后，加入 5-溴脫氧尿嘧啶核苷，并在收集細(xì)胞前加入秋水酰胺；收集細(xì)胞進(jìn)行離心、低滲處理、固定、再固定，制備染色體滴片，應(yīng)用胰蛋白酶-Giemsa 染液對(duì)染色體進(jìn)行 G 顯帶處理。每例標(biāo)本以 30 個(gè)以上分裂象做眾數(shù)分析，按照《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制》（ISCN 1978）對(duì)細(xì)胞株染色體進(jìn)行 G 顯帶分析。

結(jié)果4 種細(xì)胞株的染色體均較長(zhǎng)、分散良好、形態(tài)較好。SP-2/O 細(xì)胞株、CKM-8 細(xì)胞株、KM 細(xì)胞株、抗小鼠胰腺癌鼠-鼠雜交瘤細(xì)胞株的染色體數(shù)目分別為 63、46、42、105，其中抗小鼠胰腺癌鼠-鼠雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目接近小鼠淋巴細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞染色體數(shù)的總和，且多數(shù)為端著絲點(diǎn)染色體。

結(jié)論細(xì)胞同步化染色體高分辨技術(shù)檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞染色體具有良好的效果。

【關(guān)鍵詞】雜交瘤； 細(xì)胞遺傳學(xué)分析； 染色體； 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2010, 5(5):367-370

雜交瘤是通過細(xì)胞融合技術(shù)[1]，將具有分泌抗體能力的致敏 B 淋巴細(xì)胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合成雜交細(xì)胞，可在體外連續(xù)繁殖并能產(chǎn)生性質(zhì)專一的單克隆抗體。但雜交瘤細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，編碼抗體的染色體容易丟失，因此對(duì)雜交瘤細(xì)胞染色體的鑒定就顯得尤為必要。在雜交瘤及單抗研究中，細(xì)胞遺傳分析技術(shù)在鑒定雜交瘤[2]、觀察細(xì)胞株突變、探索抗體特性等方面均具有重要價(jià)值，但雜交瘤細(xì)胞的異質(zhì)性往往使得常規(guī)染色體制備技術(shù)無法獲得滿意的標(biāo)本用于分析。為此，我們嘗試將改進(jìn)的細(xì)胞同步化染色體高分辨技術(shù)引入雜交瘤領(lǐng)域，以探討其檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞染色體的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 小鼠骨髓瘤 SP-2/O 細(xì)胞株由中國(guó)藥品生物制品檢定所惠贈(zèng)；人淋巴母細(xì)胞CKM-8 細(xì)胞株為本研究所遺傳室保存；人骨髓瘤KM 細(xì)胞株為本研究所自建；抗小鼠胰腺癌鼠-鼠雜交瘤細(xì)胞株由云南省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所免疫研究室惠贈(zèng)。

1.1.2 試劑 RPMI 1640 培養(yǎng)液、雙抗（青、鏈霉素）均購(gòu)自美國(guó) Hyclone 公司；小牛血清購(gòu)自蘭州民海生物工程有限公司；KCl、磷酸緩沖液、冰醋酸、甲醇均購(gòu)自北京化工廠；Giemsa 染液、秋水酰胺、5-氟脫氧尿嘧啶核苷（Fdu）、尿嘧啶和5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）均購(gòu)自美國(guó) Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將 4 種細(xì)胞株分別置于含20% 小牛血清、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素的 RPMI 1640 培養(yǎng)液內(nèi)，于 37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng) 24 ～ 48 h。

1.2.2 同步化處理

1.2.2.1 加入試劑 收集 4 種細(xì)胞，分別加入終濃度為 1 × 10-7mol/L 的 5-氟脫氧尿嘧啶核苷（Fdu）和終濃度為 4 μmol/L 的尿嘧啶[3]，于 37 ℃培養(yǎng) 16 ～ 18 h 后，加入終濃度為 30 μg/ml 的5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu），并在收集細(xì)胞前30 min 加入終濃度為 0.05 ～ 0.1 μg/ml 的秋水酰胺。

1.2.2.2 低滲處理 加入試劑混勻后，將細(xì)胞移入離心管中，212 × g 離心10 min，棄上清液。加入 8 ml 已 37 ℃ 預(yù)熱的濃度為 0.075 mol/L 的KCl，用吸管將沉淀細(xì)胞吹打混勻，置 37 ℃ 水浴中 30 min。

1.2.2.3 固定 在細(xì)胞中加入 1 ml 新鮮配制的固定液（甲醇和冰醋酸按 3:1 比例配制）進(jìn)行預(yù)固定，用吸管輕輕吹打混勻細(xì)胞，212 × g 離心10 min，棄上清液。

再加入 8 ml 固定液（甲醇和冰醋酸按 3:1 比例配制），用吸管輕輕吹打混勻細(xì)胞，室溫下靜置30 min 后，212 × g 離心 10 min，棄上清液。依法重復(fù)固定 2 次。

1.2.2.4 制片 棄上清液，視細(xì)胞數(shù)量余留適量固定液，輕輕吹散細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，于垂直60 cm 高度滴于冰水浸泡的潔凈載玻片上，在酒精燈上略烤，空氣干燥。

1.2.2.5 染色 將涼干的玻片標(biāo)本加入胰蛋白酶-Giemsa 染液（Giemsa 染液和磷酸緩沖液按1:10 比例配制）進(jìn)行顯帶處理，對(duì)染色體進(jìn)行G 顯帶分析（或以吖啶橙染色，在熒光顯微鏡下觀察熒光 R 顯帶；或經(jīng)氯化鈣-紫外線照射-Giemsa染色做 Giemsa R 顯帶）。

1.3 染色體分析

每例標(biāo)本以 30 個(gè)以上分裂象做眾數(shù)分析。按照《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制》（ISCN 1978）對(duì)細(xì)胞株染色體進(jìn)行 G 顯帶分析[4]。

2 結(jié)果

對(duì) 4 種細(xì)胞株進(jìn)行同步化處理，均獲得較長(zhǎng)、分散良好、形態(tài)較好的染色體標(biāo)本，克服了常規(guī)方法制備染色體中常見的染色體短小、分叉、毛發(fā)、分散不良以致不能分析的缺點(diǎn)。

對(duì)細(xì)胞株染色體進(jìn)行 G 顯帶分析，結(jié)果染色體帶型清晰，4 種細(xì)胞株的染色體分析結(jié)果見表 1。其中抗小鼠胰腺癌鼠-鼠雜交瘤細(xì)胞為端著絲點(diǎn)染色體，包含少數(shù)中部著絲點(diǎn)染色體（圖 1），染色體數(shù)目為 105，接近小鼠淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞染色體數(shù)的總和，表明具有鼠-鼠雜交瘤細(xì)胞株的特點(diǎn)。

表 1 同步化處理后 4 種細(xì)胞株的染色體分析結(jié)果Table 1 Results of chromosomal analysis in 4 cell linesafter synchronized processing

圖 1 抗小鼠胰腺癌鼠-鼠雜交瘤細(xì)胞株染色體的胰蛋白酶-Giemsa 染色 G 顯帶分析Figure 1 G-banding analysis of mouse-mouse hybridoma (anti-mouse pancreatic cancer) cells by trypsin-Giemsa chromosomal staining

3 討論

雜交瘤技術(shù)的成功建立為產(chǎn)生抗體分子提供了細(xì)胞物質(zhì)基礎(chǔ)。通過這一途徑獲得的雜交瘤細(xì)胞系，所分泌的抗體生物活性單一、性狀高度均一、與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)，且便于人為處理和質(zhì)量控制，這些優(yōu)點(diǎn)使得它一問世就受到高度重視。盡管單克隆抗體有其局限性，但隨著技術(shù)方法的改進(jìn)，現(xiàn)已可以制備出高效價(jià)的人抗體雜交瘤細(xì)胞株[5]，產(chǎn)生高親和力的人抗體[6]，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，并且為基因工程抗體研究奠定了基礎(chǔ)[7]。

雜交瘤細(xì)胞為體外培養(yǎng)，由于各種細(xì)胞的異質(zhì)性，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后在 M 期的最恰當(dāng)時(shí)機(jī)收獲細(xì)胞做染色體分析有一定的困難，這常是導(dǎo)致常規(guī)方法制備的染色體分叉、縮短、形態(tài)不佳以至失敗的原因。引入細(xì)胞同步化技術(shù)后，在細(xì)胞體外培養(yǎng)一定時(shí)間后加入 5-氟脫氧尿嘧啶核苷（Fdu），5-氟脫氧尿嘧啶核苷（Fdu）可通過將還原型-磷酸尿苷（dUMP）轉(zhuǎn)化為還原型-磷酸胸苷（dTMP）而拮抗腺嘧啶核苷合成酶，阻斷 DNA 合成[8]。而這一阻斷在 16 ～ 18 h 后加入 5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）時(shí)可“通過補(bǔ)救途徑”恢復(fù) DNA 的合成，細(xì)胞即同步進(jìn)入分裂期，在適當(dāng)時(shí)間以秋水酰胺（或秋水仙素）處理，即可獲得滿意的可用于分析的染色體。這一同步化方法可適用于各種腫瘤和正常細(xì)胞。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，加入 5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）之后的“后培養(yǎng)”時(shí)間應(yīng)根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況做適當(dāng)調(diào)整，生長(zhǎng)迅速者可短至 6 h，生長(zhǎng)緩慢者時(shí)間宜稍長(zhǎng)，可達(dá) 10 h。

作為雜交瘤中的親本細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞，為體外傳代培養(yǎng)建立而成，染色體分析可確定這一細(xì)胞株的來源，如鼠源性骨髓瘤細(xì)胞染色體多為近端著絲粒染色體，而人源性骨髓瘤細(xì)胞較大，A-G 組具有不同的形態(tài)特征。我們?cè)诮⑷斯撬枇黾?xì)胞株的過程中，染色體的 G 顯帶分析提供了人源性的可靠依據(jù)。此外，一個(gè)穩(wěn)定的細(xì)胞株應(yīng)具備染色體眾數(shù)及標(biāo)記染色體相對(duì)穩(wěn)定的特點(diǎn)[9]。我們認(rèn)為，如有 2個(gè)以上穩(wěn)定的眾數(shù)并存，應(yīng)盡可能進(jìn)行顯帶分析，以確定是否存在不同的標(biāo)記染色體或不同的非隨機(jī)性染色體增加或丟失，以便確定是否細(xì)胞株已分化為 2 個(gè)以上亞株。在此需要提及的是，在分析眾數(shù)時(shí)，除明顯散亂、重疊者外，應(yīng)連續(xù)計(jì)數(shù)每一分裂相中的染色體數(shù)目，統(tǒng)計(jì)分析眾數(shù)，不宜簡(jiǎn)單地計(jì)算染色體平均數(shù)作為眾數(shù)。

通過細(xì)胞融合技術(shù)形成雜交瘤細(xì)胞株，對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行染色體分析是驗(yàn)證是否獲得真正雜交瘤細(xì)胞的客觀指標(biāo)之一，并從而明確雜交瘤細(xì)胞染色體的變化。細(xì)胞融合成功，雜交瘤細(xì)胞株形成的標(biāo)志是出現(xiàn)眾數(shù)相對(duì)穩(wěn)定、數(shù)目多于每一單獨(dú)細(xì)胞株而接近于 2 個(gè)單獨(dú)細(xì)胞株相加的染色體。在人-鼠雜交瘤中，通過形態(tài)分析證實(shí)人染色體與鼠染色體并存于同一細(xì)胞是人-鼠細(xì)胞融合成功的依據(jù)。

動(dòng)態(tài)觀察雜交瘤細(xì)胞株的穩(wěn)定情況，探索染色體丟失與抗體分泌的關(guān)系，染色體分析對(duì)了解雜交瘤分泌單抗的能力有一定意義。雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)初期很不穩(wěn)定，傳代過程中會(huì)不斷丟失染色體。另外，長(zhǎng)期液氮凍存的雜交瘤細(xì)胞復(fù)蘇后，其分泌抗體的功能仍有可能喪失。當(dāng)雜交瘤細(xì)胞一旦丟失與抗體分泌有關(guān)的染色體，其分泌抗體的能力就會(huì)消失。對(duì)于種間雜交瘤細(xì)胞來說，保留一定數(shù)量的人染色體，可能有助于雜交瘤分泌抗體能力的穩(wěn)定性[10]。因此，顯帶分析相應(yīng)的幾條人源性染色體存在與否，有助于了解抗體的分泌情況。如雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目較集中，其分泌能力則高；反之，其分泌能力則低。喪失分泌能力的雜交瘤細(xì)胞株中，多數(shù)是丟失了與抗體分泌有關(guān)的染色體，但也有少數(shù)細(xì)胞株輕、重鏈相關(guān)的染色體都具備。分子遺傳學(xué)的進(jìn)展已使大部分控制抗體分泌的基因編碼于染色體，通過染色體的追蹤觀察，可以了解抗體分泌與雜交瘤染色體演變的關(guān)系。尤其在人-鼠雜交瘤中，人染色體很易逐漸丟失，雜交瘤細(xì)胞常保留編碼抗體重鏈的 14 號(hào)染色體，而丟失編碼 K 輕鏈的2 號(hào)染色體?？茖W(xué)研究的進(jìn)展已經(jīng)使遺傳工程與雜交瘤技術(shù)相互滲透，相信隨著研究的深入，染色體分析在雜交瘤研究中將起到更為重要的作用。

本研究通過測(cè)定臭牡丹粗提物的DPPH自由基清除活性，對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行評(píng)估，進(jìn)一步建立DPPH-HPLC-QTOF-MS/MS技術(shù)，通過比較與DPPH反應(yīng)前后HPLC-QTOF-MS/MS譜圖的變化，對(duì)臭牡丹粗提物中的抗氧化活性成分進(jìn)行快速篩選和結(jié)構(gòu)鑒定，共確定13個(gè)主要的抗氧化活性成分，其中9個(gè)化合物首次報(bào)道存在于該植物中.本工作豐富了臭牡丹抗氧化藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù).

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ObjectiveTo investigate the feasibility of detecting hybridoma chromosome by using synchronized chromosome separation technique.

MethodsMouse myeloma cell line SP-2/O cells, human lymphoblastoid cell line CKM-8 cells, human myeloma cell line KM cells, and mouse-mouse hybridoma (anti-mouse pancreatic cancer) cells were cultured for 24-48 hours in vitro. Chromosomal synchronization was carried out in four cell lines above by treating cells with 5-fluoro-deoxy uridine and uracil for 16-18 hours, then adding 5-BrdU into culture. Cells were treated by Colcemid CCM before harvesting. After centrifugation, cells were treated by hypotonic buffer and followed by double-fix procedures. The liquid form of chromosome pieces were dropped onto glass slides and G-banding was carried out by staining slides with trypsin-Giemsa solution. Mode analysis was performed by using more than 30 separation phase of chromosomes in each case. Chromosomal G-banding analysis was carried out according to “Human Cytogenetics International Naming System” (ISCN 1978).

ResultsThe chromosomes obtained from four cell lines had ideal length with good separation and clear shape. The chromosomal numbers of SP-2/O cells, CKM-8 cells, KM cells and mouse-mouse hybridoma (anti-mouse pancreatic cancer) cells were 63, 46, 42 and 105 respectively. The numbers of chromosomes of the mouse-mouse hybridoma (anti-mouse pancreatic cancer) cells was close to sum of the numbers of chromosomes of the mouse spleen cells and mouse myeloma cells, and most of the chromosomes of mouse-mouse hybridoma (anti-mouse pancreatic cancer) cells were telocentric chromosome.

ConclusionSynchronized chromosome separation technique was effective in detecting hybridoma cells chromosome.

【Key words】Hybridomas; Cytogenetic analysis; Chromosomes; Animal experimentation

Author Affiliat ion:Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Kunming 650118, China

Correspongding Author: CHU Jia-you, Email: chujy@imbcams.com.cn www.cmbp.net.cn

Chin Med Biotechnol, 2010, 5(5):367-370

作者單位：650118 昆明，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所

通訊作者：褚嘉祐，Email：chujy@imbcams.com.cn

收稿日期：2010-06-25

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.05.008

Method and significance of chromosome analysis on hybridoma research

LIN Ke-qin, YI Wen, CHU Jia-you

【Abstract】