陳嵐，車紅，任麗麗，王健偉

·論著·

用安德森空氣生物采樣器采集病毒氣溶膠的研究

陳嵐*，車紅*，任麗麗，王健偉

【摘要】

目的以表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）報(bào)告基因的重組腺病毒（rAdvGFP）為模式病毒，進(jìn)行氣溶膠的主動(dòng)發(fā)生實(shí)驗(yàn)和模擬劇烈吹打、振蕩混勻等操作，利用安德森采樣器進(jìn)行氣溶膠的采集，以建立簡單易行的病毒氣溶膠采集檢測體系。

方法用氣溶膠發(fā)生器模擬模式病毒的氣溶膠主動(dòng)發(fā)生，分別在距離發(fā)生器管口 0、10 和 20 cm 處放置采樣器及培養(yǎng)皿，在氣溶膠發(fā)生 30 s 時(shí)開始采集，共采集 5 min。在模擬吹打操作中，將 10 ml 病毒液置于 50 ml 離心管中，用微量移液器反復(fù)吸取吹打病毒液；在模擬振蕩操作中，將10 ml 病毒液置于 50 ml 離心管中蓋緊，以振蕩器最大速度渦旋振蕩 1 min，立即打開管蓋采集 2 min，然后蓋緊再重復(fù)振蕩 30 s 后開蓋繼續(xù)采集。兩種模擬操作均在距離管口 0 和 10 cm 處放置采樣器及培養(yǎng)皿，各采集 5 min。收集各采樣器及培養(yǎng)皿中的液體，利用陽離子聚合物聚凝胺濃縮后用 PCR 方法檢測病毒核酸，并接種人胚腎 293 細(xì)胞進(jìn)行病毒的培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下觀察 GFP 蛋白的表達(dá)。

結(jié)果模擬氣溶膠主動(dòng)發(fā)生時(shí)，將置于距發(fā)生器管口 0、10和 20 cm 的采樣器和培養(yǎng)皿中的采集液接種細(xì)胞均可觀察到綠色熒光，并可檢測到病毒核酸。模擬劇烈吹打時(shí)，置于0 cm 處的培養(yǎng)皿內(nèi)可檢測到病毒，而置于 0 cm、10 cm 處采樣器和 10 cm 處培養(yǎng)皿中均未檢測到病毒。在劇烈振蕩模擬試驗(yàn)中，在距離管口 0 cm 的采樣器和培養(yǎng)皿中均可檢測到病毒，在置于 10 cm 處的采樣器中未檢測到病毒，在置于 10 cm 處的培養(yǎng)皿中可檢測到病毒。

結(jié)論利用 rAdvGFP 模式病毒和安德森采樣器初步建立了病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)氣溶膠收集檢測體系，對模擬危險(xiǎn)操作感染性材料所產(chǎn)生的氣溶膠做出危險(xiǎn)評估，為制定病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范提供了依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】空氣微生物學(xué)； 病毒學(xué)； 安全管理； 危險(xiǎn)性評估； 生物氣溶膠

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2010, 5(5):342-347

氣溶膠是由懸浮于氣體介質(zhì)中的固態(tài)或液態(tài)微小粒子形成的相對穩(wěn)定的分散體系，其粒徑一般為 0.001 ～ 100 μm[1]。懸浮于大氣中的含有微生物或生物大分子等生命活性物質(zhì)的固態(tài)或液態(tài)微粒稱為生物氣溶膠包括病毒、細(xì)菌、真菌、多肽、花粉等微生物[2]。生物氣溶膠對人類的生命健康會(huì)造成極大影響，世界上 41 種主要傳染病中有 14 種可通過空氣氣溶膠傳播，20% 呼吸道感染是由氣溶膠引起，其中以病毒占首位[3]。實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行感染性材料操作時(shí)，在多個(gè)環(huán)節(jié)均可產(chǎn)生氣溶膠，尤其是常見的吹打、移液和渦旋振蕩等操作更容易產(chǎn)生氣溶膠，從而威脅操作人員的安全。對這些危險(xiǎn)操作產(chǎn)生氣溶膠的實(shí)驗(yàn)評價(jià)不僅有助于規(guī)范生物安全實(shí)驗(yàn)室工作人員的操作，避免職業(yè)感染，同時(shí)也為生物安全管理提供切實(shí)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。而如何有效收集操作中可能產(chǎn)生的氣溶膠，是進(jìn)行危險(xiǎn)因素實(shí)驗(yàn)分析的關(guān)鍵。

目前，關(guān)于細(xì)菌等空氣微生物氣溶膠采集及采樣器采樣效率的比較研究報(bào)道較多[4-6]。但是由于病毒氣溶膠濃度低、采集難，病毒的感染力及活性易降低，且傳統(tǒng)檢測方法靈敏度低，其研究受到限制[3]。為建立簡單快速的病毒氣溶膠采集方法，本研究以表達(dá)綠色熒光蛋白的重組腺病毒（rAdvGFP）為模式病毒，采用了分級采集不同粒度氣溶膠的二級安德森采樣器，并通過病毒濃縮及快速離心法培養(yǎng)鑒定病毒和利用 PCR 檢測病毒核酸等技術(shù)建立了病毒氣溶膠的采集檢測方法，利用該方法對人工主動(dòng)發(fā)生以及劇烈吹打、振蕩等模擬實(shí)驗(yàn)操作中產(chǎn)生的氣溶膠進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株與病毒株 人胚腎 293 細(xì)胞購自美國 Invitrogen 公司；表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）的復(fù)制缺陷型 5 型重組腺病毒 rAdvGFP 為本室構(gòu)建。

1.1.2 試劑與儀器 細(xì)胞培養(yǎng)基 Dulbecco 改良的 Eagle 培養(yǎng)基（Dulbecco modified Eagle medium，DMEM）、血清、碳酸氫鈉和青鏈霉素購自美國 Invitrogen 公司；dNTP 和 Taq 酶購自日本 TaKaRa 公司；Hank 液購自美國 Hyclone 公司。PTC-200PCR 儀為美國 Bio-Rad 公司產(chǎn)品；miniMAG 自動(dòng)核酸提取儀為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品；NU-4750E 細(xì)胞培養(yǎng)箱、NU-425-400E IIA2型生物安全柜為美國 Nuaire 公司產(chǎn)品；ECLIPSE 80i 熒光顯微鏡為日本 Nikon 公司產(chǎn)品；二級安德森微生物氣溶膠采樣器由遼陽市應(yīng)用技術(shù)研究所提供；DV40 型全玻璃直角氣溶膠發(fā)生器由北京比賽福生物安全技術(shù)有限公司提供。

1.2 方法

圖 1 rAdvGFP 病毒氣溶膠主動(dòng)發(fā)生后各采樣器中病毒培養(yǎng)檢測結(jié)果[A：氣溶膠發(fā)生器及采樣器和培養(yǎng)皿放置位置及編號示意圖；B：采樣器和培養(yǎng)皿中的病毒檢測結(jié)果（1：陽性對照；2 ～ 7：距離發(fā)生器 0 cm，10 cm，20 cm 組的采樣器 1，2檢測結(jié)果；8 ～ 10：分別為距離發(fā)生器 0 cm，10 cm，20 cm 組的培養(yǎng)皿 3 中采集液病毒培養(yǎng)結(jié)果；11：陰性對照）；C：PCR 檢測結(jié)果（M：DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：陽性對照；2 ～ 7：分別為距離發(fā)生器 0 cm，10 cm，20 cm 組的采樣器 1，2 的PCR 結(jié)果；8 ～ 10：為距離發(fā)生器 0 cm，10 cm，20 cm 組的培養(yǎng)皿 3 的 PCR 結(jié)果；11：陰性對照）]Figure 1 Results of rAdvGFP expression collected from the dishes and aerosol sampler after the initiative aerosol generation. A: The schematic of positions of aerosol generator, sampler and dishes; B: Fluorescence analysis of rAdvGFP collected from the dishes and aerosol sampler (1: Positive control; 2 - 7: 0 cm, 10 cm, 20 cm groups, aerosol sampler 1, 2, respectively; 8 - 10: 0 cm,10 cm and 20 cm groups, dish 3, respectively; 11: Negative control); C: The detection results of PCR (M: DNA Markers; 1: Positive control; 2 -7: 0 cm, 10 cm and 20 cm groups, aerosol sampler 1 and 2, respectively; 8 - 10: 0 cm,10 cm and 20 cm groups, dish 3, respectively; 11: Negative control).

1.2.1 氣溶膠主動(dòng)發(fā)生的模擬 在生物安全柜正常運(yùn)轉(zhuǎn)情況下，在柜內(nèi)將 10 ml rAdvGFP 病毒液置于 DV40全玻璃直角氣溶膠發(fā)生器內(nèi)。發(fā)生器和安德森采樣器的擺放位置如圖 1A，發(fā)生器管口距離安全柜臺(tái)面約 12 cm。分別在距離發(fā)生器管口 0、10 和 20 cm 處的安全柜臺(tái)面上放置采樣器和培養(yǎng)皿，用于病毒氣溶膠和沉降病毒顆粒的采集。采樣器分上下兩層，其采樣撞擊孔孔徑分別為 0.5 和0.2 μm，內(nèi)置培養(yǎng)皿，在每組采樣器的內(nèi)側(cè)平行位置放置 3 個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)放置 5 ml 采集液，在氣溶膠發(fā)生 30 s 后，計(jì)時(shí)連續(xù)采集 5 min，收集各采樣器及培養(yǎng)皿中的液體進(jìn)行檢測。

1.2.2 吹打及振蕩模擬試驗(yàn) 將 10 ml 病毒液置于 50 ml 離心管中，離心管距離安全柜操作臺(tái)面約12 cm。在模擬吹打的操作中，用微量移液器反復(fù)吸取吹打病毒液，期間避免病毒液溢灑和噴濺；在模擬振蕩操作中，將 10 ml 病毒液置于 50 ml 離心管中，用振蕩器的最大速度渦旋振蕩病毒液1 min 后立即打開管蓋采集 2 min，然后蓋緊再次震蕩 30 s 后開蓋繼續(xù)采集，模擬振蕩的操作見圖 2A。兩組模擬操作中，均在距離離心管管口0 和 10 cm 處的安全柜臺(tái)面上放置采樣器，在采樣器的內(nèi)側(cè)平行位置放置培養(yǎng)皿進(jìn)行病毒的采集，均采集 5 min 后收集各采樣器及培養(yǎng)皿中的采集液進(jìn)行檢測。

1.2.3 病毒濃縮 將采樣器和培養(yǎng)皿中的采集液收集到 15 ml 離心管中，加入終濃度為 400 μg/μl的陽離子多聚物聚凝胺（polybrene，PB），置 37 ℃孵育 30 min，于室溫 2300 × g 離心 40 min 后棄上清，懸于 800 μl 不含血清的 DMEM 孵育液，得到濃縮后樣本。取濃縮后的樣本 200 μl 接種至24 孔板上培養(yǎng)單層的人胚腎 293 細(xì)胞（8 × 104細(xì)胞/孔），每個(gè)樣本接種 2 孔，700 × g 室溫低速離心 45 min，在 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育 1 h后棄去孵育液，更換含 2% 胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) 48 h 后，在熒光顯微鏡下觀察GFP 熒光。對未見明顯 GFP 熒光出現(xiàn)的樣本連續(xù)培養(yǎng) 3 代，培養(yǎng) 3 代后仍未見 GFP 熒光的則認(rèn)為病毒未復(fù)制。所有試驗(yàn)均重復(fù) 3 次。

圖 2 模擬劇烈振搖病毒液后采樣器中病毒培養(yǎng)檢測結(jié)果[A：模擬病毒液劇烈震蕩圖示；B：模擬渦旋振蕩病毒液后采樣器和平皿中的病毒檢測結(jié)果；B（1：陽性對照；2 ～ 4：分別為距離管口 0 cm 組的采樣器 1，2 和培養(yǎng)皿 3 中采集液病毒培養(yǎng)結(jié)果；5 ～ 7：分別為距離管口 10 cm 組的采樣器 1，2 和培養(yǎng)皿 3 中采集液病毒培養(yǎng)結(jié)果； 8：陰性對照）；C：濃縮后 PCR 檢測結(jié)果（M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：陽性對照； 2 ～ 4：分別為距離管口 0 cm 組的采樣器 1，2和培養(yǎng)皿 3 中采集液PCR結(jié)果；5 ～ 7：分別為距離管口 10 cm 組的采樣器 1，2 和培養(yǎng)皿 3 中采集液 PCR 結(jié)果；8 陰性對照）]Figure 2 Results of rAdvGFP collected from the dishes and aerosol sampler after the vortexing of viruses. A: The mimic of vortexing; B: Fluorescence analysis of rAdvGFP collected from the dishes and aerosol sampler (1: Positive control; 2 - 4: 0 cm group, aerosol sampler 1, 2 and dish 3, respectively; 5 - 7: 10 cm group, aerosol sampler 1, 2 and dish 3, respectively; 8: Negative control); C: The detection results of PCR (M: DNA Markers; 1: Positive control; 2 - 4: 0 cm group, aerosol sampler 1, 2 and dish 3, respectively; 5 - 7: 10 cm group, aerosol sampler 1, 2 and dish 3, respectively; 8: Negative control).

1.2.4 PCR 檢測 取 200 μl 濃縮樣本用miniMAG 自動(dòng)核酸提取儀提取病毒核酸，用腺病毒特異性引物進(jìn)行 PCR 檢測。腺病毒檢測引物序列分別是上游 AdVF：5’ GCCSCARTGGKCWTAC ATGCACATC 3’；下游 AdVR：5’ CAGCACSCCICG RATGTCAAA 3’[7]。PCR 反應(yīng)體系，10 × 緩沖液2 μl、10 mmol/L 的 dNTP 0.4 μl、50 μmol/L 上、下游引物各 0.3 μl、5 U/μl 的 Taq DNA 聚合酶0.2 μl、滅菌雙蒸水 14.8 μl、核酸 2 μl，總體積為20 μl。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 預(yù)變性 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。反應(yīng)結(jié)束后取 5 μl 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2% 瓊脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增目的片段大小為301 bp。

2 結(jié)果

2.1 主動(dòng)發(fā)生后氣溶膠的采集

為了評價(jià)安德森采樣器的采樣效率以建立方便的病毒氣溶膠采集體系，首先用氣溶膠發(fā)生器模擬病毒氣溶膠的主動(dòng)發(fā)生，將采樣器和采集沉降病毒的平行放置培養(yǎng)皿中的采集液經(jīng) PB 濃縮后，進(jìn)行核酸檢測和接種 293 細(xì)胞，觀察病毒的復(fù)制。在距離發(fā)生器管口 0 和 10 cm 處放置的各培養(yǎng)皿和采樣器以及在距發(fā)生器管口 20 cm 處放置的培養(yǎng)皿和采樣器 2 中均檢測到病毒核酸，但置于20 cm 處的采樣器 1 未檢測到病毒核酸。用上述樣本接種 293 細(xì)胞，在培養(yǎng) 48 h 后均可在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞中的綠色熒光。這些結(jié)果表明，在距離發(fā)生器管口 0、10 和 20 cm 處放置的不同孔徑的采樣器中均可采集到病毒氣溶膠（圖 1B、1C）。

2.2 劇烈吹打和振蕩模擬試驗(yàn)的氣溶膠采集

圖 3 模擬吹打病毒液后各采樣器中病毒培養(yǎng)檢測結(jié)果[A：采樣器和培養(yǎng)皿中的病毒檢測結(jié)果（1：陽性對照；2 ～ 4：分別為距離管口 0 cm 組的培養(yǎng)皿 3 和采樣器 1，2 中采集液病毒培養(yǎng)結(jié)果；5 ～ 7：分別為距離管口 10 cm 組的培養(yǎng)皿 3 和采樣器 1，2中采集液病毒培養(yǎng)結(jié)果；8：陰性對照）；B：濃縮后 PCR 檢測結(jié)果（M：DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量；1：陽性對照；2 ～ 4：分別為距離管口 0 cm 組的培養(yǎng)皿 3 和采樣器 1，2 中采集液 PCR 結(jié)果；5 ～7：分別為距離管口 10 cm 組的培養(yǎng)皿 3 和采樣器 1，2 中采集液 PCR結(jié)果；8：陰性對照）]Figure 3 Results of rAdvGFP collected from the dishes and aerosol sampler after the pipetting of viruses. A: Fluorescence analysis of rAdvGFP collected from the dishes and aerosol sampler (1: Positive control; 2 - 4: 0 cm group, dish 3 and aerosol sampler 1, 2, respectively; 5 - 7: 10 cm group, dish 3 and aerosol sampler 1, 2, respectively; 8: Negative control); B: The detection results of PCR (M: DNA Markers; 1: Positive control; 2 - 4: 0 cm group, dish 3 and aerosol sampler 1, 2, respectively; 5 - 7: 10 cm group, dish 3 and aerosol sampler 1, 2, respectively; 8: Negative control).

用主動(dòng)發(fā)生的氣溶膠確定了安德森采樣器對病毒氣溶膠的采集能力后，進(jìn)一步模擬了劇烈吹打和振蕩兩種實(shí)驗(yàn)操作，分析氣溶膠的產(chǎn)生情況。將采樣器和平行放置的培養(yǎng)皿中的采集液濃縮后，進(jìn)行病毒核酸檢測并接種 293 細(xì)胞培養(yǎng)后通過觀察綠色熒光對病毒進(jìn)行檢測。PCR 檢測結(jié)果顯示，在距離發(fā)生器管口 0 cm 處平行放置的培養(yǎng)皿中可檢測到病毒核酸，而在距管口 0 和 10 cm 處放置的采樣器和距管口 10 cm 處放置的培養(yǎng)皿中均未檢測到病毒核酸。熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，在模擬吹打的操作中，在距發(fā)生器管口 0 cm 處平行放置的培養(yǎng)皿內(nèi)采集的樣本中檢測到病毒，而在距管口 0 和 10 cm 處放置的采樣器和距 10 cm 處放置的培養(yǎng)皿內(nèi)采集的樣本中均未檢測到病毒（圖3A、3B）；在模擬振蕩操作中，在距離發(fā)生器管口0 cm 處的氣溶膠采樣器和平行放置的培養(yǎng)皿中均能檢測到病毒，置于距管口 10 cm 處的上層氣溶膠采樣器和平行放置的培養(yǎng)皿中均檢測到病毒。在距離管口 10 cm 的下層氣溶膠采樣器中的熒光觀察和 PCR 檢測兩種方法均未檢測到病毒（圖 2B、2C）。

3 討論

目前，關(guān)于開展空氣微生物氣溶膠采樣研究較多，根據(jù)不同原理制造的采樣器廣泛用于各領(lǐng)域。如：單級或多級撞擊式采樣器，離心式采樣器，氣旋式采樣器，液體沖擊式采樣器，過濾式采樣器等[8]。在這些類型采樣器中，以安德森空氣微生物采樣器采樣效率最高，所采粒子數(shù)較多[4]。在分級采集不同粒度氣溶膠的時(shí)候，經(jīng)常采用安德森采樣器。在實(shí)驗(yàn)中也嘗試使用全玻璃液體沖擊式（AGI）采樣器進(jìn)行病毒氣溶膠的采集，但是沒有檢測到模式病毒。而用安德森采樣器可在距離氣溶膠發(fā)生器0 ～ 20 cm 內(nèi)采集到主動(dòng)發(fā)生的病毒氣溶膠，表明安德森采樣器適用于 rAdvGFP 模式病毒氣溶膠采集。表達(dá) GFP 的重組腺病毒已經(jīng)用于評價(jià)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)中生物安全危險(xiǎn)因素的分析[9]，利用陽離子聚合物 PB 濃縮樣本，結(jié)合病毒快速分離培養(yǎng)，有助于提高檢測效率，縮短檢測周期。

經(jīng)過上述實(shí)驗(yàn)，成功建立了簡單易行的病毒氣溶膠采集體系，并用于安全柜內(nèi)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)操作氣溶膠采集的研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此氣溶膠采樣體系具有可行性，為有效采集氣溶膠檢測分析提供了有力支持。在模擬病毒氣溶膠的主動(dòng)發(fā)生中，在距離管口 20 cm 組采集器 1 的 PCR 檢測和病毒培養(yǎng)檢測對比結(jié)果中可以看出，病毒培養(yǎng)可見明顯的綠色熒光，而 PCR 未能檢測到病毒核酸。提示進(jìn)行病毒氣溶膠收集和檢測時(shí)聯(lián)合應(yīng)用培養(yǎng)方法和PCR 方法可提高檢測結(jié)果的可靠性。在模擬振蕩病毒液的操作中，在距離管口 0 cm 處能捕捉到氣溶膠的結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)渦旋振蕩病毒液后可產(chǎn)生大量的氣溶膠，提示進(jìn)行渦旋振蕩操作后，要靜置一段時(shí)間后再打開蓋子，避免氣溶膠的產(chǎn)生。在模擬劇烈吹打的操作中，在氣溶膠采樣器中未檢測到病毒，這可能是由于吹打操作產(chǎn)生的氣溶膠較少，超過了本研究中使用的采樣體系的采樣限度。

在病原體分離培養(yǎng)或臨床樣本等的操作過程中，對樣本進(jìn)行移液、振蕩、搖動(dòng)、傾倒等操作時(shí)，除了會(huì)產(chǎn)生肉眼看不見的直徑小于 5 μm 的氣溶膠，也可能產(chǎn)生直徑在 5 ～ 10 μm 的液滴，從而造成臺(tái)面交叉污染，甚至對人體造成潛在危害[10]。在研究中模擬劇烈吹打和振蕩等操作后，在 0 cm 組平行于采樣器放置的用于采集沉降病毒顆粒的培養(yǎng)皿中都檢測到病毒。此結(jié)果進(jìn)一步提示實(shí)驗(yàn)人員在安全柜內(nèi)開展實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格遵守生物安全實(shí)驗(yàn)室通用準(zhǔn)則，規(guī)范個(gè)人的操作行為。

參考文獻(xiàn)

[1] General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People's Republic of China, Standardization Administration of the People's Republic of China. GB 19489-2008 Laboratories — general requirements for biosafety. Beijing: Standards press of China, 2009.(in Chinese)中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局, 中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB 19489-2008 實(shí)驗(yàn)室 生物安全通用要求. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2009.

[2] Qi JH, Gao HW. Environment and climate effect of bioaerosol: A review. Ecol Environ, 2006, 15(4):854-861. (in Chinese)祁建華, 高會(huì)旺. 生物氣溶膠研究進(jìn)展:環(huán)境與氣候效應(yīng). 生態(tài)環(huán)境, 2006, 15(4):854-861.

[3] Li XY, Liu QC, Peng Y, et a1. Detection of adenovirus aerosols by real-time fluorescence quantitative PCR and PK15 cell infection rates. Acta Seientiae Cireumstantiae, 2007, 27(5):785-789. (in Chinese)李曉巖, 劉啟才, 彭燕, 等. 腺病毒氣溶膠的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測和綠色熒光蛋白活細(xì)胞檢測. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 27(5):785-789.

[4] Yang WH, Wen ZB, Yu L, et al. Evaluation of the sampling efficiency of bioaerosol samplers by the aerosol generating method. Chin J Disinfection, 2009, 26(3):245-248. (in Chinese)楊文慧, 溫占波, 于龍, 等. 應(yīng)用氣溶膠發(fā)生法評價(jià)空氣微生物采樣器采樣效率. 中國消毒學(xué)雜志, 2009, 26(3):245-248.

[5] Fabian P, McDevitt JJ, Houseman EA, et al. Airborne influenza virus detection with four aerosol samplers using molecular and infectivity assays: considerations for a new infectious virus aerosol sampler. Indoor Air, 2009, 19(5):433-441.

[6] Hermann JR, Zimmerman JJ. Analytical sensitivity of air samplers based on uniform point-source exposure to airborne porcine reproductive and respiratory syndrome virus and swine influenza virus. Can J Vet Res, 2008, 72(5):440-443.

[7] Allard A, Girones R, Juto P, et al. Polymerase chain reaction for detection of adenoviruses in stools. J Clin Microbiol, 1990, 28(12): 2659-2667.

[8] Chen HW, Chen Y. Progression on air-borne microbes in China. Chin J Dis Control Prev, 2005, 9(6):627-629. (in Chinese)陳皓文, 陳陽. 空氣微生物學(xué)的國內(nèi)研究進(jìn)展. 疾病控制雜志, 2005, 9(6):627-629.

[9] Ren LL, Chen L, Xiao Y, et al. Analysis of the factors interfering the reliability of two microorganism inactivation methods by using adenovirus as a model. Chin Med Biotechnol, 2009, 4(1):19-21. (in Chinese)任麗麗，陳嵐，肖艷，等. 以腺病毒為模式分析影響病原微生物2種常用滅活方法可靠性的因素. 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2009, 4(1):19-21.

[10] Wang QD. Theory and application of bio-safety cabinet. China Med Equipment, 2005, 2(12):22-26. (in Chinese)王秋娣. 生物安全柜原理及其應(yīng)用. 中國醫(yī)學(xué)裝備, 2005, 2(12): 22-26.

ObjectiveTo establish viral aerosol collection system and to evaluate the hazards of dangerous operations, Andersen microbial air sampler was used and two most frequently operations i.e. pipetting or vortex liquid containing viruses were mimicked, by using a recombinant adenovirus expressing green fluorescent protein (GFP) as a model.

MethodsThe recombinant adenovirus expressed green fluorescence protein (rAdvGFP) model viruses were aerosolized using the aerosol generator and sampled by the andersen microbial air sampler. The captured chambers of the sampler were put on the position with 0 cm, 10 cm and 20 cm horizontal distance to the aerosol generator. Viral particles were collected for total 5 minutes (mins) after the artificially produced aerosols for 30 seconds (sec). When mimicking the dangerous operations, 10 ml culture medium contained viruses in 50 ml screw tube was used and chambers of the sampler were put on the position with 0 cm and 10 cm horizontal distance to the tube. The viruses were pipetted violently by using pipettes and aerosol was sampled for 5 mins. When mimicking viruses vibration, the tube was vortexed at the highest speed on the vortex for 1 min and sampled for 2 mins after opening the cap of tube, then snapped the lid on before vortexed again for 30 secs and sampled total for 5mins. The medium in the tube was collected, enriched and cell-culture-propagated on HEK 293 cells. Nucleic acids were tested by using PCR method. Viral propagation was checked by observed GFP expression using fluorescent microscope.

ResultsThe dishes and sampler of 0 cm, 10 cm and 20 cm group showed green fluorescence after the artificially produced aerosols. When mimicking pipetting violently, the 0 cm dishes recovered model viruses, but no model viruses were detected in 10 cm dishes and 0 cm and 10 cm sampler. When mimicking vibration, model viruses were recovered from dishes and samplers at 0 cm group and 10 cm dishes, while no viruses were captured from dishes and samplers at 10 cm group.

ConclusionsBy using rAdvGFP model viruses, a system focus on viral aerosol collection and detection was established. The system facilitate to assay the risk of dangerous operations on aerosol generation and to make the standard operating procedures in biosafety cabinet based on such evaluations.

【Key words】Air microbiology; Virology; Safety management; Risk assessment; Biogenic aerosol;

Author Affiliation: State Key Laboratory for Molecular Virology and Genetic Engineering, Institute of Pathogen Biology (IPB), Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS), Beijing 100730, China

Chin Med Biotechnol, 2010, 5(5):342-347

*同為第一作者

Corresponding Author:REN Li-li, Email: renliliipb@163.com www.cmbp.net.cn

基金項(xiàng)目：國家衛(wèi)生行業(yè)科研專項(xiàng)（200802021）

作者單位：100176 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所病毒基因工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（陳嵐、任麗麗、王健偉）；100041 北京比賽福生物安全技術(shù)有限公司（車紅）

通訊作者：任麗麗，Email：renliliipb@163.com

收稿日期：2010-6-22

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.05.003

Study on the viral aerosol sampling by using Andersen microbial air sampler

CHEN Lan, CHE Hong, REN Li-li, WANG Jian-wei

【Abstract】