張楊，李瑩，艾士奇，方旭，劉小胖，王歸歸，高亞梅，王偉東

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶　163319）

基于WSC-9的人工組建的簡化復(fù)合菌系的纖維素分解能力與酶活特性

張楊，李瑩，艾士奇，方旭，劉小胖，王歸歸，高亞梅，王偉東

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶163319）

為了研究復(fù)合菌系分解纖維素的分解特性，將從復(fù)合菌系中分離的一株厭氧細(xì)菌WSC-B（Clostridium sp.）與另外2株好氧細(xì)菌（Bacillus sp.和Clostridiaceae sp.）重新組合為一個(gè)新的復(fù)合菌系F1，通過減重法分析F1纖維素分解能力，利用3，5-二硝基水楊酸顯色法（DNS法）分析F1產(chǎn)生的幾種纖維素酶的活性。結(jié)果表明：復(fù)合菌系在接種后10 d可使水稻秸稈和濾紙分別減重73.9%和70.6%。WSC-B、WSC-A、WSC-5比例為3∶2∶1時(shí)，降解效果最佳。復(fù)合菌系F1的纖維素濾紙酶活、外切酶、內(nèi)切酶、β-葡萄糖苷酶的最大值分別為16.26 U·mL-1、56.25 U·mL-1、30.67 U·mL-1和10.81 U·mL-1。

纖維素；復(fù)合菌系；酶活；生物降解

我國的纖維素資源豐富，僅每年的農(nóng)林廢棄物就有近10×108t，農(nóng)作物秸稈年產(chǎn)量近7×108t［1］，但這些纖維素資源并未得到充分的利用，急需找到秸稈資源化利用的辦法［2-3］。采用微生物降解纖維素是解決這一問題的有效手段之一，因而近年來關(guān)于細(xì)菌產(chǎn)纖維素降解酶的研究日益引起人們的重視［4］。

已報(bào)道的降解纖維素的細(xì)菌主要包括好氧菌屬中的熱酸菌（Acidothermus）、芽孢桿菌（Bacillus）、熱桿菌（Caldibacillus）、纖維弧菌（Cellvibrio）等［5-6］，厭氧菌屬中的厭氧解纖維菌（Anaerocellum）、熱解纖維素菌（Caldicellulosiruptor）、梭菌（Clostridium）等［7］。降解纖維素的真菌有木霉屬（Trichoderma）［8］、青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）［9］。但單一菌株難以達(dá)到降解的目的，需要多個(gè)菌種的協(xié)同作用。多種纖維素降解菌協(xié)同作用可分泌多種纖維素酶［13］：內(nèi)切型纖維素酶、外切型纖維素酶和葡糖苷酶，不同菌源的內(nèi)切與外切酶之間也具有協(xié)同作用，從而能夠快速將纖維素降解［14］。劉長莉［10］經(jīng)馴化篩選出復(fù)合菌系NSC-7，培養(yǎng)5 d，降解稻稈總干重的44.7%；王偉東等［11］構(gòu)建的復(fù)合菌系WSC-6，培養(yǎng)3 d內(nèi)，濾紙和稻稈的降解率可達(dá)到97%和82.2%；溫雪［12］將兩株具有較強(qiáng)分解能力的菌株與一株無纖維素分解能力的菌株進(jìn)行人工組合，發(fā)現(xiàn)組合菌群的纖維素分解能力較單獨(dú)的菌株分解能力穩(wěn)定而高效；Stepanova等［18］將白腐菌與絲狀真菌以燕麥秸稈為碳源進(jìn)行混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)相對于單獨(dú)培養(yǎng)纖維素和木質(zhì)素降解菌有提高；Kato等［19］通過研究復(fù)合系MC1中主要菌株的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)非纖維素降解菌在纖維素的降解中具有重要的作用，通過對關(guān)鍵菌株重新優(yōu)化組合，其纖維素的降解能力要高于單一菌株的降解能力。

經(jīng)前期研究得到一個(gè)具有高效纖維素降解能力的復(fù)合菌系WSC-9，從中分離得到了8株細(xì)菌，其中菌株WSC-B（Clostridium sp.）能在厭氧條件下快速高效降解纖維素［12］。為了將來研究復(fù)合菌系的纖維素協(xié)同降解機(jī)制，此次研究以細(xì)菌WSC-B為核心，與其余7株細(xì)菌中的1-2株重新人工組配，期望得到一個(gè)組成簡單且高效快速降解纖維素的新復(fù)合菌系，然后研究新復(fù)合菌系的纖維素分解能力和酶活特性，為研究復(fù)合菌系的纖維素降解機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)菌種

實(shí)驗(yàn)室分離得到的5株好氧細(xì)菌和3株厭氧細(xì)菌，分別命名為WSC-1、WSC-2、WSC-3、WSC-4和WSC-5及WSC-A、WSC-B和WSC-C，見參考文獻(xiàn)［12］。

1.2培養(yǎng)條件

好氧菌使用PCS培養(yǎng)基，其組成成分為（g·L-1）：酵母粉1，蛋白胨5，NaCl 5，CaCO32。在50 mL三角瓶中加入40 mL培養(yǎng)基，秸稈和濾紙的添加量為培養(yǎng)基體積的2%，121℃滅菌15 min。接菌量為10%，50℃下靜置培養(yǎng)10 d。

厭氧菌培養(yǎng)基成分為（g·L-1）：酵母粉2，蛋白胨2，NaCl 1，KCl 0.2，MgCl20.5，NH4Cl 1，K2HPO4·3H2O 3.5，KH2PO41.5，煮沸后加入L-半胱氨酸0.5，微量元素5 mL，維生素1 mL，1‰刃天青5～6滴。煮沸的同時(shí)，用注射器向100 mL青霉素瓶中加入70 mL培養(yǎng)基，同時(shí)氮?dú)庵圃靺捬醐h(huán)境，秸稈和濾紙的添加量為培養(yǎng)基體積的2%，121℃滅菌15 min。接菌量為10%，50℃下靜置培養(yǎng)10 d。

試驗(yàn)中所使用的秸稈為水稻秸稈，前處理方法為：1%NaOH浸泡24 h后用自來水沖洗至pH為7.0，在80℃下烘干。

1.3復(fù)合系的組建

以細(xì)菌WSC-B為核心，將它分別與其他幾株細(xì)菌進(jìn)行組合，每個(gè)組合最多3株細(xì)菌；培養(yǎng)條件和方法與好氧菌的培養(yǎng)條件相同。對有降解情況發(fā)生的組合多次傳代培養(yǎng)，直至其能穩(wěn)定降解。培養(yǎng)10 d后，按1.6.1測定降解率。

1.4較優(yōu)組合各菌株添加比例

接菌量為10%不變，設(shè)置3因素3水平正交試驗(yàn)，菌株的添加比例見表1。培養(yǎng)條件和方法與好氧菌的培養(yǎng)條件相同，3株細(xì)菌的添加總量不變，各菌的添加量根據(jù)比例計(jì)算后添加。每組做3個(gè)平行。培養(yǎng)10 d后，按1.6.1測定降解率。

表1　菌株添加比例正交實(shí)驗(yàn)表Table 1Orthogonal table of strain add proportion

1.5復(fù)合菌系F1纖維素降解過程與纖維素降解有關(guān)的酶活性變化

分別測定與纖維素降解有關(guān)的4種酶活性：濾紙酶活性、纖維素內(nèi)切酶、纖維素外切酶和β-葡萄糖苷酶。所選擇的底物分別為濾紙、羧甲基纖維素鈉（CMC）、微晶纖維素粉和水楊苷。

1.6測定方法

1.6.1降解率的測定方法

在培養(yǎng)前，測定所添加的濾紙和秸稈的干重；降解后，收集降解剩余的濾紙和秸稈，80℃下烘干至恒重，測定其質(zhì)量；從而計(jì)算降解率。

1.6.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線按照參考文獻(xiàn)［15］繪制。

緩沖溶液為5.59 g·L-1磷酸氫二鉀和0.41 g·L-1磷酸二氫鉀配制成pH為7.8的磷酸鹽緩沖液。

1.6.3與纖維素降解有關(guān)的4種酶活性測定

（1）粗酶液的提取

在接種后的第二天開始，每天取一定的培養(yǎng)液于2 mL離心管中，8 000 rpm離心10 min后收集上清液［16］，用于酶活性的測定。

（2）4種酶活性測定

測定方法采用3，5-二硝基水楊酸顯色法（DNS法）。方法見參考文獻(xiàn)［15］。

1.6.4分析方法

利用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果

2.1復(fù)合菌系的組建

因?yàn)橐M建一組培養(yǎng)條件與原纖維素降解復(fù)合菌系的培養(yǎng)條件相同的復(fù)合菌系，因此，試驗(yàn)中的每個(gè)組合至少包含一株好氧單菌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)WSC-B與WSC-A、WSC-3及與WSC-A、WSC-5組合，有降解現(xiàn)象產(chǎn)生，其降解效率如表2所示。

表2　組建的復(fù)合系對濾紙和秸稈的降解率Table 2Filter paper and straw degradation rate of composite bacterial system

由以上結(jié)果可知，當(dāng)WSC-B與WSC-A、WSC-5組合時(shí)，濾紙和秸稈的降解率均是最高的，與WSCB、WSC-A、WSC-5組合的差異顯著（P＜0.05），表明其降解效果好，因此選擇該組合為所需復(fù)合系，將其命名為F1。

2.2菌種添加比例

培養(yǎng)10 d后濾紙和秸稈的降解率如表3所示。

表3　三株細(xì)菌不同添加量的降解效果Table 3Cellulose degradation of different composition ratio of three isolates

對以上結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)組8的結(jié)果與其他試驗(yàn)組結(jié)果差異顯著（P＜0.05），即當(dāng)3株單菌的添加比例為3∶2∶1時(shí)，其降解效果最好，濾紙的降解量達(dá)到了70.6%，秸稈的降解量為73.9%。

2.3新復(fù)合菌系F1與纖維素降解有關(guān)的酶活性變化

新復(fù)合菌系F1與纖維素降解有關(guān)的酶活性變化如圖1所示。

圖1　纖維素分解過程中酶活性的變化Fig.1Dynamic of cellulase activity during cellulose decomposition process

圖1將原纖維素降解復(fù)合菌系WSC-9和組建的復(fù)合菌系F1的4種酶活性進(jìn)行了比較。當(dāng)反應(yīng)溫度與培養(yǎng)溫度相同時(shí)，二者的酶活性的變化的整體趨勢相同，均為先升高后降低，且都是在纖維素分解最旺盛時(shí)期各種酶的酶活達(dá)到最大值。復(fù)合菌系WSC-9和F1的濾紙酶活性都在第5 d達(dá)到最大，分別為17.53 U·mL-1和16.26 U·mL-1，二者的濾紙酶活性相差不大。WSC-9和F1的內(nèi)切酶活性都在第6 d達(dá)到最大值，分別為51.48 U·mL-1和30.67 U·mL-1，F(xiàn)1的最大內(nèi)切酶活性比WSC-9的內(nèi)切酶活性低40%。WSC-9的外切酶活性在第5 d達(dá)到最大值，為75.68 U·mL-1；但F1的外切酶活性在第6 d時(shí)最大，為56.25 U·mL-1，與WSC-9相比低了25.7%。WSC-9和F1的β-葡萄糖苷酶都在第6 d時(shí)達(dá)到最大值，分別為11.77 U·mL-1和10.81 U·mL-1，差異不顯著。

3　討論與結(jié)論

通過組配試驗(yàn)得到的纖維素降解復(fù)合菌系F1，組成為三株單菌，能夠在短時(shí)間內(nèi)快速高效的將纖維素分解，其降解效率能夠達(dá)到原復(fù)合菌系的80%以上，達(dá)到了既簡化菌系組成又具有較高纖維素分解能力。F1中有一株好氧細(xì)菌，它可能在培養(yǎng)的初期利用了培養(yǎng)體系中的氧氣，制造了缺氧環(huán)境，為具有降解作用的細(xì)菌WSC-B和WSC-A創(chuàng)造了厭氧環(huán)境，從而使兩株厭氧菌得以繁殖生長，進(jìn)而三者協(xié)同作用分解濾紙。復(fù)合菌系F1的三株組成細(xì)菌WSCB、WSC-A、WSC-5的混合比例為3∶2∶1時(shí)，復(fù)合菌系F1的降解效果最佳，也說明具有纖維素分解能力的厭氧菌F1是最關(guān)鍵的菌株，它主導(dǎo)復(fù)合菌系的分解能力。

復(fù)合菌系F1的纖維素內(nèi)切酶和纖維素外切酶活性分別比原復(fù)合菌系降低了40%和25.7%，濾紙酶活性和β-葡萄糖苷酶活性與原復(fù)合菌系的酶活性相當(dāng)，但F1的纖維素降解效率依舊能夠達(dá)到原復(fù)合菌系的80%以上，證明纖維素分解是在多種纖維素酶的協(xié)同作用下完成的，是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，不能簡單的從一種酶活性的高低來判斷一株細(xì)菌的纖維素分解能力。而在幾種纖維素酶活性指標(biāo)中，最能夠反映纖維素分解能力的指標(biāo)是濾紙酶活，這個(gè)硬指標(biāo)是其他酶活所不能比擬的。因此，在纖維素微生物分解研究中，不論是復(fù)合菌系還是純培養(yǎng)菌株，如果衡量其酶活性，用濾紙酶活具有可比性。

通過把好氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌優(yōu)化組配，得到了簡化的、具有較高纖維素分解能力的復(fù)合菌系，僅由三株細(xì)菌組成，在10 d的培養(yǎng)周期內(nèi)可使水稻秸稈和濾紙分別減重73.9%和70.6%，為下一步研究組成明確的復(fù)合菌系的纖維素降解機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。由此也可說明其他菌株對纖維素降解也有一定作用，尤其是WSC-3。

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Capability of Cellulose Degradation and Enzyme Activities of Simplified Artificial Composite Microbial System Based on WSC-9

Zhang Yang，Li Ying，Ai Shiqi，F(xiàn)ang Xu，Liu Xiaopang，Wang Guigui，Gao Yamei，Wang Weidong
（College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

In order to study the decomposition characteristics of cellulose degradation of composite microbial system（CMS），one anaerobic bacteria strain WSC-B（Clostridiumsp.）that separated from CMS and two aerobic bacteria strains（Bacillus sp.and Clostridiaceae sp.）were recombined a new simple of efficient CMS F1.The cellulose degradation ability of CMS F1 was analyzed by using the gravimetry.3，5-dinitrosalicylic acid development method（DNS）was used to analyze the enzyme activity of CMS.The results showed that the lose ratio of rice straw and filter paper were 73.9%and 70.6%after inoculation first 10 days，respectively. When the ratio of WSC-B，WSC-A and WSC-5 was 3∶2∶1，the degradation effect was the best，the maximum values of cellulose filter paper enzyme activity，exonuclease，endonuclease and β-glucosaccharase of CMS F1were 16.26 U·mL-1，56.25 U·mL-1，30.67 U·mL-1and 10.81 U·mL-1，respectively.

cellulose；composite microbial system；enzyme activity；biodegradation

Q939

A

1002-2090（2016）02-0080-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.02.016

2014-12-31

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD12B05-3）；黑龍江省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2012TD006）；黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目（YJSCX2014-Y51）；黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（20141022311）。

張楊（1989-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院2012級碩士研究生。

王偉東，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：wwdccy@126.com。