宋雪梅，張 炎，楊 敏，梁 琪，*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

牦牛乳硬質(zhì)干酪苦味肽的分離與特征鑒定

宋雪梅1，2，張 炎1，2，楊 敏2，3，梁 琪1，2，*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

為了探究牦牛乳硬質(zhì)干酪中苦味肽組成特征，采用氯仿-甲醇法提取苦味肽，通過Sephadex G-25葡聚糖凝膠色譜進(jìn)行分離純化，并利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-MS/MS）對(duì)其分離的苦味較強(qiáng)組分進(jìn)行特征鑒定。結(jié)果表明：經(jīng)Sephadex G-25葡聚糖凝膠色譜分離得到3 個(gè)不同分子質(zhì)量的組分，組分Ⅱ具有明顯苦味。LC-MS/MS鑒定出組分Ⅱ中存在14 種苦味肽，主要為氨基酸殘基數(shù)目7～17個(gè)、分子質(zhì)量小于2 000 D的小肽，苦味肽序列中存在的疏水性氨基酸主要有脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸，800～1 500 D苦味肽占64.29%，源自β-酪蛋白（β-casein，β-CN）降解產(chǎn)物的苦味肽占92.86%。因此，干酪成熟過程中源自β-CN的具有較強(qiáng)疏水性、分子質(zhì)量小于2 000 D的混合多肽的積累可能對(duì)干酪苦味的產(chǎn)生有較大影響。

牦牛乳硬質(zhì)干酪；苦味肽；特征；β-酪蛋白

宋雪梅， 張炎， 楊敏， 等. 牦牛乳硬質(zhì)干酪苦味肽的分離與特征鑒定［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（15）: 160-164. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201615027. http://www.spkx.net.cn

SONG Xuemei， ZHANG Yan， YANG Min， et al. Separation and characterization of bitter peptides from hard cheese made from yak milk［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 160-164. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615027. http://www.spkx.net.cn

在干酪成熟過程中，酪蛋白在凝乳酶、纖維蛋白溶酶、發(fā)酵劑蛋白酶和肽酶等作用下，逐漸降解成寡肽、小肽和游離氨基酸，但是成熟過程中發(fā)生不恰當(dāng)降解時(shí)，干酪將產(chǎn)生苦味等缺陷。研究表明，酪蛋白降解產(chǎn)物——苦味肽對(duì)Cheddar干酪［1］、Ragusano干酪［2］等苦味的產(chǎn)生起了重要作用。

肽的苦味源自于肽的疏水性氨基酸如精氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸，它們是苦味受體的結(jié)合位點(diǎn)［3］。多肽中的疏水性氨基酸不像完整蛋白質(zhì)分子被包藏在內(nèi)部，而是暴露在外，當(dāng)接觸味蕾時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生苦味。疏水性氨基酸側(cè)鏈暴露越多，多肽苦味強(qiáng)度就越大［4］。干酪中苦味肽的產(chǎn)生主要與凝乳酶和發(fā)酵劑有關(guān)［5］。干酪成熟過程中酪蛋白降解程度的增加或者降解過程中形成的中間產(chǎn)物沒有被充分降解時(shí)，將會(huì)產(chǎn)生苦味肽。干酪中積累的苦味肽超過一定閾值后，干酪將產(chǎn)生苦味。干酪苦味影響了消費(fèi)者的接受程度和市場(chǎng)前景，因此，基于重要的經(jīng)濟(jì)原因，干酪苦味及苦味肽受到特別關(guān)注。

近年來，隨著先進(jìn)分析技術(shù)的發(fā)展（如質(zhì)譜），已鑒定出許多苦味肽。Guigoz等［6］從Swiss-Mountain干酪中分離到具有苦感的二肽。Broadbent等［7］認(rèn)為苦味肽β-CN（f193-209）和αs1（f1-9）含量能夠作為Cheddar干酪和模擬干酪產(chǎn)生過度苦味的指標(biāo)。Toelstede等［8-9］通過感官引導(dǎo)分級(jí)技術(shù)，在Gouda干酪中發(fā)現(xiàn)了有助于干酪產(chǎn)生苦味的12 種多肽。Karametsi等［10］通過凝膠色譜、半制備型反相液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜在具有刺激性苦味干酪中鑒定出了5 種苦味肽。Liu Xiaowei等［11］利用液相色譜-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-time of flight-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-TOF-MS/MS）鑒定了乳清蛋白酶解產(chǎn)物中存在的苦味肽。

牦牛乳硬質(zhì)干酪營(yíng)養(yǎng)豐富、成熟期較長(zhǎng)，且原料乳中有較高含量的β-酪蛋白（β-casein，β-CN）［12］，因此，鑒于不同干酪在原料乳、制作工藝、成熟方法等方面存在的差異，本研究通過提取牦牛乳硬質(zhì)干酪中的苦味肽，采用葡聚糖凝膠色譜對(duì)其進(jìn)行分離純化，結(jié)合感官評(píng)價(jià)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-MS/MS）技術(shù)對(duì)其苦味肽組分進(jìn)行鑒定，尋求干酪中存在的主要苦味肽，了解其苦味肽特征，為更好地控制牦牛乳硬質(zhì)干酪苦味、獲得干酪良好風(fēng)味提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

15 ℃成熟4 個(gè)月的牦牛乳硬質(zhì)干酪。

藍(lán)色葡聚糖2000、Sephadex G-25葡聚糖凝膠 美國(guó)GE公司；氯仿、甲醇（均為分析純） 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；硫酸奎寧（分析純） 上海源葉生物科技有限公司；甲酸（分析純）、乙腈（色譜純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

1.6mm×75 cm普通層析柱 上海基星生物科技有限公司；MODEL BSZ-160自動(dòng)部分收集器 上海青普滬西儀器廠；754PC型紫外分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；GLZ-0.4冷凍真空干燥機(jī) 北京速原中天科技有限公司；LTQ-Velos LC-MS/MS雙壓線性離子阱質(zhì)譜儀美國(guó)Thermo Finnigan公司。

1.3方法

1.3.1干酪苦味肽的提取

參考Harwalkar等［13］方法，采用氯仿-甲醇法提取干酪中苦味肽，并將提取的苦味肽真空冷凍干燥后貯藏在-18 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2Sephadex G-25凝膠色譜分離純化

將苦味肽配制成70 mg/mL的溶液，上樣體積為1 mL，去離子水洗脫，洗脫速率為0.5 mL/min，每管收集體積為4.0 mL，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，收集液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3苦味肽各組分的苦味程度評(píng)價(jià)

經(jīng)過培訓(xùn)和感官能力測(cè)試后，篩選出7 人組成評(píng)價(jià)小組，以0、2.9×10-3、5.8×10-3、1.2×10-2、2.4×10-2mmol/L硫酸奎寧作為參比溶液，評(píng)定員由弱到強(qiáng)地品嘗參比溶液，記住每種溶液的苦味程度。采用5 分制進(jìn)行評(píng)定、打分，1～5 分表示干酪苦味程度為幾乎檢測(cè)不到苦味、輕微苦味、中等苦味、非常強(qiáng)的苦味、令人難以接受的苦味。為了在相同條件下品嘗苦味肽的苦味程度，在評(píng)定之前，將其配成相同濃度的苦味肽樣品。評(píng)定員用蒸餾水漱口之后，將1 mL苦味肽溶液含在嘴里，大約10 s后吐出，進(jìn)行評(píng)定、打分。

1.3.4LC-MS/MS鑒定苦味肽特征

液相條件：分離柱為RP柱（150 μm×100 mm，5 μm）。流動(dòng)相A：0.1%甲酸-水溶液；流動(dòng)相B：0.1%甲酸-乙腈；上樣量為20 μg，流速為2 μL/min；線行梯度洗脫：0～50 min，4%～50% B；50～54 min，50%～100% B；54～60 min，維持100% B。

LTQ Velos質(zhì)譜儀通過微噴霧接口接到LC設(shè)備上，二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)同時(shí)獲得。全掃描范圍m/z 300～1 800，每次全掃描后采集20 個(gè)最強(qiáng)離子碎片圖譜，動(dòng)態(tài)排除設(shè)置：重復(fù)點(diǎn)2；重復(fù)持續(xù)時(shí)間30 s；排除重復(fù)時(shí)間90 s。二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)自動(dòng)通過BioworksBrowser rev. 3.1在ipi.HUMAN.v3.53中獲得。SEQUEST檢索結(jié)果再用Build Summary軟件進(jìn)行比較，整合刪除冗余信息，保證數(shù)據(jù)的正確性。

針對(duì)LC-MS/MS鑒定出的苦味肽，根據(jù)構(gòu)成它的氨基酸種類和數(shù)目，參考Ney［14］的方法計(jì)算苦味肽的平均疏水性值（Q）。具體計(jì)算公式如下：

式中：Δft為氨基酸自由能改變量；n為肽中氨基酸殘基數(shù)目。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析，Origin 8.0軟件進(jìn)行作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1Sephadex G-25葡聚糖凝膠色譜分離純化結(jié)果

圖1　牦牛乳硬質(zhì)干酪苦味肽的Sephadex G-25葡聚糖凝膠色譜圖Fig. 1 Sephadex G-25 gel filtration chromatogram of bitter peptides in hard cheese made from yak milk

由圖1可知，提取到的苦味肽經(jīng)Sephadex G-25葡聚糖凝膠，被分離成3 個(gè)組分。依據(jù)苦味肽洗脫的前后順序，將3 個(gè)組分分別命名為組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。

2.2干酪中苦味肽各組分苦味程度的比較

圖2　Sephadex G-25葡聚糖凝膠色譜分離的各組分苦味程度的比較Fig. 2 Comparison of bitterness of different components separated by Sephadex G-25 gel column chromatography

由圖2可知，苦味肽組分Ⅱ具有輕微苦味，其苦味程度強(qiáng)于組分Ⅰ和組分Ⅲ?？辔峨慕M分Ⅱ與組分Ⅰ、Ⅲ之間的苦味程度差異顯著（P＜0.05），苦味肽組分Ⅰ、Ⅲ之間的苦味程度差異不顯著（P＞0.05）。

在該實(shí)驗(yàn)中，算法使用RBF核函數(shù)，其中C=120，gamma=0.02。用10組真實(shí)數(shù)據(jù)交叉驗(yàn)證得到經(jīng)驗(yàn)誤差為x=0.012, y=0.009；真實(shí)誤差值為ΔE= 1.21。

2.3苦味肽組分Ⅱ的LC-MS/MS鑒定

通過LC-MS/MS對(duì)苦味肽組分Ⅱ進(jìn)行分離鑒定，得到的樣品基峰離子流色譜見圖3。在質(zhì)譜分析過程中，精確質(zhì)量數(shù)掃描可以確定離子所帶電荷數(shù)，利用二級(jí)質(zhì)譜得到的碎片離子可識(shí)別肽段的氨基酸序列。通過與數(shù)據(jù)庫搜索匹配，結(jié)合肽片段檢測(cè)頻次和文獻(xiàn)［15］報(bào)道，篩選出17 種多肽，其具體結(jié)果見表1。

圖3　Sephadex G-25葡聚糖凝膠色譜分離的苦味肽組分Ⅱ的基峰離子流色譜圖Fig. 3 Base peak ion chromatography of fraction II separated by Sephadex G-25 gel filtration chromatography

表1　Sephadex G-25葡聚糖凝膠色譜分離的苦味肽組分Ⅱ中鑒定的特征肽段Table 1 Specific peptide sequences identified in fraction II separated by Sephadex G-25 gel filtration chromatography

由表1可知，大部分匹配的多肽源自酪蛋白，組分Ⅱ中存在的特征肽均為氨基酸殘基數(shù)目7～17 個(gè)、分子質(zhì)量小于2 000 D的肽段，其中分子質(zhì)量在800～1 500 D的肽段為苦味肽的主要部分，占71%。各肽段中氨基酸出現(xiàn)頻率較高的疏水性氨基酸主要有脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸?？辔峨闹饕醋驭?CN和αs1-酪蛋白（αs1-CN）的降解產(chǎn)物，特別是β-CN。源自于β-CN降解產(chǎn)物的肽鏈13 條，其中大部分主要源自C末端多肽的降解，且肽段中的疏水性殘基比例在71%以上。由于在所有牛乳蛋白中β-CN最疏水，而其C末端序列又是β-CN肽鏈中最疏水的［16］，因此比較容易產(chǎn)生苦味肽。源自于αs1-CN降解產(chǎn)物的苦味肽肽鏈有4 條，主要源自多肽的N末端降解，且肽段中的疏水性殘基比例在62%以下。

2.4組分Ⅱ中各苦味肽疏水性值分析

一般通過肽的疏水程度可以判斷其是否具有苦味，當(dāng)疏水性氨基酸殘基裸露在肽鏈表面時(shí)，刺激舌上的苦味受體（味蕾）產(chǎn)生苦味。因此，按照Ney［14］的方法，計(jì)算出苦味肽組分Ⅱ中17 種多肽的疏水性值，見表2。

表2　牦牛乳硬質(zhì)干酪中苦味肽組分Ⅱ中所鑒定特征肽的疏水性值（Q）Table 2 Hydrophobicity of characteristic peptides from fraction II

由表2可知，除了來自αs1-CN降解產(chǎn)物IKHQGLPQ、HQGLPQE、SDIPNPIGSENSG的多肽Q值＜5 443.1 J/mol之外，其他14 種多肽的Q值＞5 861.8 J/mol。因此，根據(jù)Q值規(guī)則，苦味肽組分Ⅱ中存在14 種具有苦味的肽，源自β-CN降解產(chǎn)物的苦味肽占92.86%，800～1 500 D苦味肽占64.29%。

3　討 論

Champion等［1］發(fā)現(xiàn)Cheddar干酪中苦味肽分子質(zhì)量為190 D。Engel等［17］通過消除實(shí)驗(yàn)，確定苦Camembert干酪的苦味主要由400～3 000 D的小肽所引起。Topcu等［18］利用超濾、凝膠色譜和反相高效液相色譜從Turkish白干酪和Kasar干酪中分離的苦味肽分子質(zhì)量為500～4 000 D和200～700 D。來自血紅蛋白、玉米蛋白、酪蛋白和大豆蛋白等降解物的苦味肽也是由2～27 個(gè)氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量為200～3 000 D。因此，牦牛乳硬質(zhì)干酪中苦味肽分子質(zhì)量（875.09～1 881.25 D）在所報(bào)道的苦味肽分子質(zhì)量范圍之內(nèi)。

Edwards等［19］發(fā)現(xiàn)來自Cheddar干酪的苦味肽中具有較高含量的谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸和纈氨酸，而組氨酸、酪氨酸和甲硫氨基酸的含量較低。Toshikazu等［20］在大豆蛋白苦味肽的研究中也發(fā)現(xiàn)，纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和異亮氨酸含量較高。Fitzgerald等［21］發(fā)現(xiàn)苦味肽中含有較多的脯氨酸。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)苦味肽序列中疏水性氨基酸頻數(shù)從高到低的順序依次為脯氨酸、纈氨酸和亮氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸。肽的苦味作用主要取決于肽側(cè)鏈末端的疏水性氨基酸殘基，這具備了與苦味受體結(jié)合的前提條件。疏水性氨基酸殘基在多肽中比例越高，則該多肽苦味越重［22］，而在本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的大多數(shù)肽段中疏水性殘基比例在71%以上，這使得多肽的苦味程度可能較強(qiáng)。

另外，苦味肽的苦味還與特定分子構(gòu)象相關(guān)。當(dāng)多肽鏈兩端形成回折構(gòu)象時(shí)，苦味較重，而脯氨酸（Pro）殘基對(duì)多肽鏈形成回折構(gòu)象起著重要的作用［23］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大部分鑒定出的多肽末端部位多次出現(xiàn)疏水性氨基酸如脯氨酸、亮氨酸、纈氨酸等，且脯氨酸出現(xiàn)的頻率很高。在—Pro—Pro—基團(tuán)間插入L-型或疏水性氨基酸時(shí)苦味并不減弱，插入苯丙氨酸時(shí)，苦味將大大增強(qiáng)［24］。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的苦味肽序列如YQEPVLGPVRGPFPIIV、YQEPVLGPVRGPFPII、Q E P V L G P V R G P F P、Y Q E P V L G P V R G P F P、V Y P F P G P I P N、Q E P V L G P V R G P F P I I、EPVLGPVRGPFPII中發(fā)現(xiàn)在脯氨酸和脯氨酸基團(tuán)之間插入了疏水性氨基酸或者苯丙氨酸。在牦牛乳硬質(zhì)干酪中發(fā)現(xiàn)存在YQEPVLGPVRGPFPIIV序列，而苦味肽β-CN（f193-209）的序列為YQQPVLGPVRGPFPIIV，將Q變成E，因此可判斷YQEPVLGPVRGPFPIIV具有苦味。在重口味Cheddar干酪［10］和Gouda干酪［8］中發(fā)現(xiàn)的苦味肽YQEPVLGPVRGPFPI也存在于牦牛乳硬質(zhì)干酪中。同時(shí)還存在與YQEPVLGPVRGPFPI 前后差1或2 個(gè)氨基酸肽段YQEPVLGPVRGPFPII、QEPVLGPVRGPFPII、YQEPVLGPVRGPFP、EPVLGPVRGPFPII、QEPVLGPVRGPFP等。Karametsi等［10］發(fā)現(xiàn)GPVRGPFPIIV是重口味Cheddar干酪中苦味程度的主要貢獻(xiàn)者。Singh等［25］曾發(fā)現(xiàn)與β-CN（f193-209）相關(guān)的降解物β-CN（f196-209）、β-CN（f200-209）、β-CN（f202-209）的苦味閾值低于β-CN（f193-209）。Broadbent等［26］在Cheddar干酪中發(fā)現(xiàn)的αs1-CN（f1-7）有助于干酪產(chǎn)生苦味，而在牦牛乳硬質(zhì)干酪中也發(fā)現(xiàn)了類似的多肽序列RPKHPIK。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)所測(cè)定的牦牛乳硬質(zhì)干酪中苦味肽具有呈現(xiàn)苦味的特征，且苦味較強(qiáng)的多肽主要有RPKHPIK、YQEPVLGPVRGPFPIIV、Q E P V L G P V R G P F P、Y Q E P V L G P V R G P F P、VYPFPGPIPN、QEPVLGPVRGPFPII、LPPTVMFPPQ、YQEPVLGPVRGPFPI、TPVVVPPFL、VYPFPGPIPN。

4　結(jié) 論

Sephadex G-25葡聚糖凝膠色譜將苦味肽分離成3 個(gè)不同分子質(zhì)量的組分，且組分Ⅱ具有明顯苦味。經(jīng)LC-MS/MS對(duì)組分Ⅱ進(jìn)行鑒定，組分Ⅱ中有14 種苦味肽，主要是氨基酸殘基數(shù)目為7～17 個(gè)、分子質(zhì)量小于 2 000 D的小肽，其中800～1 500 D的苦味肽占64.29%，苦味肽序列中出現(xiàn)的疏水性氨基酸頻數(shù)從高到低依次為脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸，源自β-CN的降解產(chǎn)物的苦味肽占92.86%。

［1］ CHAMPION H M， STANLEY D W. HPLC separation of bitter peptides from Cheddar cheese［J］. Canadian Institute of Food Science and Technology Journal， 1982， 15（4）: 283-288. DOI:10.1016/S0315-5463（82）72613-6.

［2］ FALLICO V， MCSWEENEY P L H， HORNE J， et al. Evaluation of bitterness in Ragusano cheese［J］. Journal of Dairy Science， 2005，88（4）: 1288-1300. DOI:10.3168/jds.S0022-0302（05）72795-8.

［3］ GOMEZ M， GARDE S， GAYA P， et al. Relationship between level of hydrophobic peptides and bitterness in cheese made from pasteurized and raw milk［J］. Journal of Dairy Research， 1997， 64（2）: 289-297. DOI:10.1017/S0022029996002129.

［4］ PRIPP A H， ARD Y. Modelling relationship between angiotensin-（I）-converting enzyme inhibition and the bitter taste of peptides［J］. Food Chemistry， 2007， 102（3）: 880-888. DOI:10.1016/ j.foodchem.2006.06.026.

［5］ LEMIEUX L， SIMARD R E. Bitter flavour in dairy products. 1. A review of the factors likely to influence its development， mainly in cheese manufacture［J］. Le Lait， 1991， 71（6）: 599-636. DOI:10.1051/ lait:1991647.

［6］ GUIGOZ Y， SOLMS J. Isolation of a bitter tasting peptide from“Alpkase”， a Swiss mountain-cheese［J］. LWT Lebensmitt Wissensch Technol， 1974， 7（6）: 356-357.

［7］ BROADBENT J R， BARNES M， BRENNAND C， et al. Contribution of Lactococcus lactis cell envelope proteinase specificity to peptide accumulation and bitterness in reduced-fat Cheddar cheese［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2002， 68（4）: 1778-1785. DOI:10.1128/AEM.68.4.1778-1785.2002.

［8］ TOELSTEDE S， DUNKEL A， HOFMANN T. A series of kokumi peptides impart the long-lasting mouthfulness of matured Gouda cheese［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2009， 57（4）: 1440-1448. DOI:10.1021/jf803376d.

［9］ TOELSTEDE S， HOFMANN T. Quantitative studies and taste reengineering experiments toward the decoding of the nonvolatile sensometabolome of Gouda cheese［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2008， 56（13）: 5299-5307. DOI:10.1021/jf800552n.

［10］ KARAMETSI K， KOKKINIDOU S， RONNINGEN I， et al. Identification of bitter peptides in aged Cheddar cheese［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2014， 62（32）: 8034-8041. DOI:10.1021/jf5020654.

［11］ LIU Xiaowei， JIANG Deshou， PETERSON D G. Identification of bitter peptides in whey protein hydrolysate［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2014， 62（25）: 5719-5725. DOI:10.1021/ jf4019728.

［12］ LI Haimei， MA Ying， DONG Aijun， et al. Protein composition of yak milk［J］. Dairy Science & Technology， 2010， 90（1）: 111-117.

［13］ HARWALKAR V R， ELLIOTT J A. Isolation of bitter and astringent fractions from Cheddar cheese［J］. Journal of Dairy Science， 1971，54（1）: 8-11. DOI:10.3168/jds.S0022-0302（71）85772-7.

［14］ NEY K H. Prediction of bitterness of peptides from their amino acid composition［J］. Zeitschrift fur Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung， 1971， 147（2）: 64-68.

［15］ LEMIEUX L， SIMARD R E. Bitter flavour in dairy products. Il. A review of bitter peptides from caseins: their formation， isolation and identification， structure masking and inhibition［J］. Le Lait， 1992，72（4）: 335-382. DOI:10.1051/lait:1992426 .

［16］ 王立暉. 胃蛋白酶酶解酪蛋白制備酪啡肽的研究［D］. 成都: 西華大學(xué)， 2005: 3-4. DOI:10.7666/d.y906842.

［17］ ENGEL E， NICKLAUS S， SEPTIER C， et al. Evolution of the taste of a bitter Camembert cheese during ripening: characterization of a matrix effect［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2001，49（6）: 2930-2939. DOI:10.1021/jf000967m.

［18］ TOPCU A， SALDAMLI I. Determination of peptides caused bitterness in Turkish white cheese and Kasar cheese［J］. Journal of Food Technology， 2007， 5（2）: 131-134.

［19］ EDWARDS J， KOSIKOWSKI F V. Bitter compounds from Cheddar cheese［J］. Journal of Dairy Science， 1983， 66（4）: 727-734. DOI:10.3168/jds.S0022-0302（83）81851-7.

［20］ TOSHIKAZU N， SATOSHI Y， MICHIO F， et al. Debittering of enzymatic hydrolysates using all aminopeptidase from the edible basidiomycete Grifola frondosa［J］. Journal of Bioscience and Bioengineering， 2002， 93（1）: 60-63. DOI:10.1016/s1389-1723（02）80055-x.

［21］ FITZGERALD R J， O’CUINN， G. Enzymatic debittering of food protein hydrolysates［J］. Biotechnology Advances， 2006， 24（2）: 234-237. DOI:10.1016/j.biotechadv.2005.11.002.

［22］ 丁建明， 謝小冬， 宋禮， 等. 酶解蛋白產(chǎn)物脫苦技術(shù)研究進(jìn)展［J］. 糧食與油脂， 2012（8）: 5-7. DOI:10.3969/j.issn.1008-9578.2012.08.004.

［23］ ISHIBASHI N， KUBO T， CHINO M， et al. Taste of proline-containing peptides［J］. Agricultural and Biological Chemistry， 1988， 52（1）: 95-98. DOI:10.1271/bbb1961.37.2427.

［24］ NAKATANI M， OKAI H. Convenient synthesis of flavor peptides［C］// ACS Symposium Series， 1993: 149-157. DOI:10.1021/bk-1993-0528. ch011.

［25］ SINGH T K， YOUNG N D， DRAKE M， et al. Production and sensory characterization of a bitter peptide from β-casein［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2005， 53（4）: 1185-1189. DOI:10.1021/jf049058d.

［26］ BROADBENT J R. Peptide accumulation and bitterness in Cheddar cheese made using single-strain Lactococcus lactis starters with distince proteinase specificities［J］. Journal of Dairy Science， 1998，81（2）: 327-337. DOI:10.3168/jds.s0022-0302（98）75581-x.

Separation and Characterization of Bitter Peptides from Hard Cheese Made from Yak Milk

SONG Xuemei1，2， ZHANG Yan1，2， YANG Min2，3， LIANG Qi1，2，*
（1. College of Food Science and Engineering， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China；2. Functional Dairy Product Engineering Laboratory of Gansu， Lanzhou 730070， China；3. College of Science， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China）

The intention of this work was to investigate the structural characteristics of bitter peptides in hard cheese made from yak milk. Bitter peptides were extracted with chloroform-methanol mixture and isolated by using gel chromatography，and the more bitter fractions were identified by liquid chromatography-mass spectrometry （LC-MS-MS）. The results showed that three fractions named as fractions I， II and III were obtained through Sephadex G-25 column chromatography and fraction II tasted the most bitter among these and had a flavor described as slightly bitter. Fourteen peptides were identified in fraction II and these peptides were composed of 7-17 amino acid residues in a molecular weight range less than 2 000 D. Hydrophobic amino acids such as proline， valine， leucine， phenylalanine and isoleucine constituted these bitter peptides. The bitter peptides in a molecular weight range of 800-1 500 D accounted for 64.29% and bitter peptides derived from β-casein（β-CN） accounted for 92.86%. Therefore， polypeptides derived from β-casein with high hydrophobicity and molecular weight below 2 000 D may have a significant influence on the bitterness of cheese.

hard cheese made from yak milk； bitter peptide； characteristic； β-casein

10.7506/spkx1002-6630-201615027

TS252.1

A

1002-6630（2016）15-0160-05

2015-10-20

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31260383）

宋雪梅（1980—），女，博士，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)與技術(shù)。E-mail：springwinter110@126.com

梁琪（1969—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称菲焚|(zhì)、乳品科學(xué)。E-mail：liangqi@gsau.edu.cn

引文格式：