劉文曉，高志強(qiáng)，蒲　靜，張　偉，劉　環(huán)，牛建蕊，張鶴曉

（1.北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司，北京 懷柔 101400；2.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 朝陽 100026）

豬傳染性胃腸炎病毒S基因A、D抗原共表達(dá)的復(fù)制缺陷型重組腺病毒構(gòu)建及鑒定

劉文曉1，高志強(qiáng)2，蒲靜2，張偉2，劉環(huán)2，牛建蕊1，張鶴曉2

（1.北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司，北京 懷柔 101400；2.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 朝陽 100026）

通過RT-PCR技術(shù)和重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增出含有豬傳染性胃腸炎病毒S基因的A抗原表位和D抗原表位，構(gòu)建復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭質(zhì)粒。穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒經(jīng)PacI線性化之后，共同轉(zhuǎn)染AD-293細(xì)胞，獲得共表達(dá)A、D抗原表位的復(fù)制缺陷型重組腺病毒。經(jīng)Western Blotting檢測(cè)，該重組腺病毒能夠正確表達(dá)目的蛋白基因，而且目的蛋白能夠與豬傳染性胃腸炎陽性血清反應(yīng)。本研究結(jié)果為豬傳染性胃腸炎重組疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

豬傳染性胃腸炎；復(fù)制缺陷型腺病毒；疫苗

豬傳染性胃腸炎是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）引起的一種急性、高度傳染性疾病。不同品種和年齡的豬均易感染此病，其中兩周齡以內(nèi)的仔豬病死率高達(dá)100%。近年來，該病在我國(guó)的流行形式日趨嚴(yán)峻，嚴(yán)重影響了我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。由于該病無有效治療方法，疫苗預(yù)防是控制該病流行與發(fā)展的重要措施?，F(xiàn)在應(yīng)用較多的是常規(guī)疫苗（弱毒苗、滅活苗或三聯(lián)苗），但是，其存在很多缺陷，如潛伏感染、散毒、毒力返強(qiáng)等。因此，應(yīng)用基因工程改造技術(shù)研發(fā)新型疫苗對(duì)該病的防控具有重大意義。

TGEV的基因組編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白（S蛋白、M蛋白、N蛋白和sM蛋白）和4種非結(jié)構(gòu)蛋白［1］。S蛋白，又稱纖突蛋白，位于病毒粒子表面，是惟一能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體與提供免疫保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)蛋白。S蛋白的氨基端有4個(gè)抗原位點(diǎn)A、B、C、D，其中A、D位點(diǎn)序列高度保守，是主要誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的抗原位點(diǎn)［2］。

復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體是一種免疫原性很強(qiáng)的高效活疫苗載體。它可以通過注射、口服、滴鼻等途徑進(jìn)行免疫，同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)載體和目的蛋白的體液免疫和細(xì)胞免疫，還能誘導(dǎo)局部產(chǎn)生黏膜免疫應(yīng)答。本研究旨在通過復(fù)制缺陷型腺病毒載體共表達(dá)S蛋白的A、D抗原，模擬野生毒株表面的線性和非線性的抗原表位，刺激機(jī)體產(chǎn)生與自然野毒感染相似的免疫應(yīng)答，為新型疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1質(zhì)粒、菌株與細(xì)胞RAPAD CMV腺病毒表達(dá)系統(tǒng)，購自Cell Biolabs，INC。AD-293細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2主要試劑M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶由北京出入境檢驗(yàn)檢疫局研發(fā)。RNA酶抑制劑，購自Promega公司。病毒RNA柱式提取試劑盒為北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品。限制性內(nèi)切酶、DNA純化試劑盒等，購自寶生物工程（大連）有限公司。Trans-IT-2020轉(zhuǎn)染試劑，購自Mirus bio公司。

1.3引物根據(jù)TGEV Purdue 115株的S基因序列，利用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物P1：5′-GGAATTCATGTTAGTTACCAAACAGCCGT-3′與引物P2：5′-AACTTGGGATCCTATTGTCCAGAAAA-3′，分別帶有EcoR I與BamH I酶切位點(diǎn)，用于擴(kuò)增A抗原表位的序列，長(zhǎng)度為501 bp。引物P3：5′-CGGGATCCCAAGTTGAAAACACAG-3′與引物P4：5′-GCTCTAGAACTATTATCAGACGGT-3′，分別帶有BamH I與Xba I酶切位點(diǎn)，用于擴(kuò)增D抗原表位的序列，長(zhǎng)度為606 bp。

圖1　重疊PCR擴(kuò)增含有TGEV S基因A、 D抗原表位的技術(shù)路線

1.4豬傳染性胃腸炎基因sAD擴(kuò)增通過RTPCR方法分別擴(kuò)增A、D抗原表位的序列，同時(shí)通過重疊PCR技術(shù)合成編碼A、D表位的完整的DNA片斷（圖1）。提取TGEV RNA，以O(shè)ligodT為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得TGEV cDNA，分別擴(kuò)增A、D表位的序列sA、sD，。以P1、P4為引物，sA、sD為模板擴(kuò)增sAD，經(jīng)瓊脂糖凝膠純化回收之后，連接pMD19-T載體，篩選含有sAD序列的pMD19-T陽性重組質(zhì)粒pMD19-T-sAD。將含有陽性克隆質(zhì)粒的菌液送往英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序，進(jìn)行序列分析。

1.5含有Sad基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建利用限制性內(nèi)切酶EcoRI、XbaI酶切質(zhì)粒pMD19-T-sAD與pacAd5 CMV K-N pA，構(gòu)建含有sAD片段的重組質(zhì)粒，PCR鑒定篩選陽性克隆株，命名為pShuttle-sAD。

1.6含有TGEV AD抗原表位的復(fù)制缺陷型重組腺病毒的組裝使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取穿梭質(zhì)粒pShuttle-sAD，pacAd5 CMV eGFP與骨架質(zhì)粒pacAd5 9.2-100，經(jīng)pacI酶切之后，回收。參考轉(zhuǎn)染試劑盒的說明書方法，將酶切之后的穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒DNA共同轉(zhuǎn)染AD-293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染10 d之后，收獲復(fù)制缺陷型重組腺病毒。

1.7復(fù)制缺陷型重組腺病毒的鑒定與遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)取連續(xù)擴(kuò)大傳代的重組腺病毒與正常的AD-293細(xì)胞培養(yǎng)液各1 mL，提取RNA，通過RT-PCR方法檢測(cè)目的基因。

1.8復(fù)制缺陷型重組腺病毒的TCID50的測(cè)定按照常規(guī)方法，將連續(xù)擴(kuò)大傳代的重組腺病毒進(jìn)行10倍梯度稀釋，接種于含有AD-293細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)7 d，逐日觀察細(xì)胞病變，按照Reed-Muench方法計(jì)算TCID50。

1.9目的蛋白的免疫原性檢測(cè)將上一步收獲得到的復(fù)制缺陷型重組腺病毒病毒液進(jìn)行處理，離心取上清進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blotting檢測(cè)。其中，一抗為自制的抗TGEV的豬血清（1∶100稀釋），二抗為HRP標(biāo)記的羊抗豬抗體（1∶1 000稀釋）。

2　結(jié)果與分析

2.1重組腺病毒穿梭質(zhì)粒構(gòu)建通過RT-PCR方法分別擴(kuò)增含有A、D抗原表位的序列，見圖2，利用重疊PCR技術(shù)合成同時(shí)含有A、D表位的序列sAD，見圖3。分別雙酶切sAD片段和質(zhì)粒pacAd5 CMV KN pA，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒。陽性克隆株測(cè)序結(jié)果表明，重組穿梭質(zhì)粒中含A、D抗原基因，無突變，成功構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-sAD。

2.2復(fù)制缺陷型重組腺病毒的包裝利用限制性內(nèi)切酶pacI酶切骨架質(zhì)粒及穿梭質(zhì)粒，質(zhì)粒pacAd5 9.2-100經(jīng)酶切后產(chǎn)生約33.0 kb與2.0 kb的兩條帶（泳道2），酶切后的穿梭質(zhì)粒為單一條帶（泳道4，6），與預(yù)期結(jié)果相符，見圖4。

圖2　PCR擴(kuò)增TGEV S基因A、D抗原表位的序列

圖3　PCR擴(kuò)增含有A、D抗原表位的序列

圖4　重組腺病毒穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒的線性化

將線性化的穿梭質(zhì)粒與骨架DNA同時(shí)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，10 d出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，細(xì)胞變圓，細(xì)胞核固縮，最后脫落，見圖5。收獲第一代復(fù)制缺陷型重組腺病毒，分別命名為rAd-sAD、rAd-eGFP。

2.3復(fù)制缺陷型重組腺病毒的鑒定及遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)將第一代腺病毒rAd-sAD接種于293細(xì)胞，逐日觀察，3 d后開始出現(xiàn)細(xì)胞病變，收獲病毒，連續(xù)傳代至第10代。檢測(cè)每一代病毒內(nèi)目的基因DNA和轉(zhuǎn)錄水平，均得到大小約為1 107 bp的特異性條帶，結(jié)果表明，sAD基因在rAd-sAD內(nèi)能夠穩(wěn)定存在，見圖6。

圖5　復(fù)制缺陷型重組腺病毒感染AD-293細(xì)胞的細(xì)胞病變（10×40）

測(cè)定各代病毒的TCID50，結(jié)果顯示，隨著病毒傳代，rAd-sAD的病毒滴度逐代增加，至第6代逐漸穩(wěn)定，TCID50為108.375/mL（見圖7）。

第10代重組腺病毒rAd-sAD的sAD基因測(cè)序結(jié)果顯示，無核苷酸突變。綜上所述，該重組腺病毒rAd-sAD遺傳性狀穩(wěn)定。

2.4目的蛋白的免疫原性檢測(cè)將rAd-sAD感染AD-293細(xì)胞，出現(xiàn)細(xì)胞病變之后，收集病毒液，進(jìn)行SDS-PAGE與Western Blotting檢測(cè)。結(jié)果顯示，在40 kD處能夠檢測(cè)到深色印跡，而正常細(xì)胞無此印跡（見圖8）。結(jié)果表明，A、D抗原能夠在該復(fù)制缺陷型重組腺病毒內(nèi)表達(dá)，而且具有反應(yīng)原性。

3　討論

圖6　rAd-sAD的PCR鑒定

圖7　重組腺病毒病毒滴度測(cè)定

圖8　Western Blotting檢測(cè)

豬傳染性胃腸炎病毒致病性強(qiáng)，治療效果不顯著，疫苗防控一直是預(yù)防該病發(fā)生與流行的重要措施。針對(duì)TGEV的疫苗研發(fā)一直以來備受關(guān)注。1996年，研究人員已經(jīng)自主研發(fā)出針對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒的二聯(lián)氫氧化鋁細(xì)胞滅活苗。隨后，又研發(fā)出二聯(lián)弱毒苗［3］。這些常規(guī)疫苗在一定程度上能夠降低TGEV的發(fā)病率和死亡率，但是效果不理想。

現(xiàn)在，多種基因工程疫苗研發(fā)技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到TGEV疫苗研發(fā)領(lǐng)域。S蛋白一直被作為研究新型疫苗的靶點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于亞單位疫苗、活載體疫苗研究領(lǐng)域。Shoup等利用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)提取TGEV S蛋白作為亞單位疫苗，在給豬進(jìn)行弱毒苗免疫之后，再用S蛋白進(jìn)行加強(qiáng)免疫，能夠顯著提高母豬的母源抗體水平，提高對(duì)仔豬的保護(hù)率，但是單獨(dú)使用該蛋白作為亞單位苗免疫效果不佳［4］。Smerdo等利用原核表達(dá)系統(tǒng)將S蛋白克隆至鼠傷寒沙門菌致弱菌株中，該重組疫苗經(jīng)口服免疫可以刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)TGEV的特異性抗體。Tuboly等利用同源重組的方法將全長(zhǎng)的S基因克隆至5型腺病毒載體上，經(jīng)口服免疫，能夠在豬體內(nèi)檢測(cè)到針對(duì)TGEV和5型腺病毒的特異性抗體［1］，解決機(jī)體針對(duì)該載體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)是將其進(jìn)一步推廣使用的關(guān)鍵因素。這些基因工程疫苗候選株在一定程度上克服了現(xiàn)有常規(guī)疫苗存在的缺陷，但是其免疫原性低，仍然不能達(dá)到的預(yù)期免疫效果。盡管如此，這些技術(shù)的出現(xiàn)為新型安全有效疫苗的研發(fā)提供了新的研究思路。

腺病毒載體基因組易于改造，病毒滴度高，安全性能好，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫和體液免疫。經(jīng)過研究人員對(duì)其基因組的改造，研發(fā)出新一代復(fù)制缺陷型腺病毒載體。這種載體缺失了負(fù)責(zé)編碼腺病毒早期轉(zhuǎn)錄蛋白的E1區(qū)，缺失E1區(qū)的腺病毒不能有效復(fù)制和產(chǎn)生各種病毒蛋白，必須在能夠提供E1基因功能的細(xì)胞株內(nèi)復(fù)制。這在一定程度上能夠降低機(jī)體針對(duì)載體產(chǎn)生的免疫效應(yīng)。本研究利用腺病毒表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建了同時(shí)含有TGEV S蛋白的A、D抗原表位的穿梭質(zhì)粒，將該穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒線性化之后共同轉(zhuǎn)染AD-293細(xì)胞，獲得復(fù)制缺陷型重組腺病毒。通過RT-PCR、Western Blotting檢測(cè)，結(jié)果表明該復(fù)制缺陷型重組腺病毒能夠成功表達(dá)TGEV S蛋白的A、D抗原，而且能夠與陽性血清發(fā)生反應(yīng)，具有較好的反應(yīng)原性。下一步將重組腺病毒免疫豬，研究其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)TGEV的中和抗體的能力，為新型豬傳染性胃腸炎疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

［1］Gebauer F.PWCI，Residues involved in the antigenic sites of transmissible gastroenteritis virus S glycoprotein［J］.Virology，1991，1：225-238.

［2］佟有恩，馮力，李偉杰，等.豬傳染性胃腸炎與豬流行性腹瀉二聯(lián)弱毒疫苗的研究［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1999，43（6）：406-410.

［3］李樹根，周仲芳，李力復(fù)，等.豬流行性腹瀉弱毒和豬傳染性胃腸炎弱毒二聯(lián)疫苗研究［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2000，36（8）：5-8.

［4］Jones T，PGPD.Transmissible gastroenteritis of pigs［J］.Vet Rec，1997，16：427.

Construction and Identification of Replication defectiveRecombinant Adenovirus Expressing A and D epitopeof S protein genein Transmissiblegastroenteritis virus

LIU Wen-xiao1，GAO Zhi-qiang2，PU Jing2，ZHANG Wei2，LIU Huan2，NIU Jian-rui1，ZHANG He-xiao2
（1.Beijing Senkang Biotech Development Co.，Ltd，Beijing 101400，China；2.Beijing Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026，China）

RT-PCR and overlap PCR were used to amplify the A and D epitope of spikes protein（S protein）gene in Transmissible gastroenteritis virus（TGEV）.The A and D epitope genes were introduced into the shuttle vector.To generate the recombinant adenovirus，the shuttle vector containing the gene of interest and the recombinant adenoviral backbone were co-transfected into AD-293 cells.RT-PCR was applied to detect the genes of A and D proteins in the recombinant adenovirus.The Western blotting results revealed that the A and D genes were properly expressed，and the expressed protein could react with TGEV-positive serum. The study sets a foundation for the preparation of recombinant vaccine to control TGEV infection.

Transmissible gastroenteritis virus；Non-replicative recombinant adenovirus；Vaccine

ZHANG He-xiao

S855.3

A

0529-6005（2016）09-0003-04

2015-11-12

北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)資助青年骨干個(gè)人項(xiàng)目（2015-000097607G290）

劉文曉（1985-），女，博士，主要從事動(dòng)物疫病檢測(cè)技術(shù)研究，E-mail：lwx232210809@163.com

張鶴曉，E-mail：aqlzhx@126.com