吳家鑫，尚　　飛，張國棟，劉　　敏，張傳良，徐金雷，趙梅仙，宋　　敏，齊　　鵬，陶蓓蓓

（1.中牧實業(yè)股份有限公司 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化學藥品重點實驗室 北京市獸用多肽疫苗設計與制備工程技術(shù)研究中心，北京 海淀 100095；2.中國牧工商（集團）總公司，北京 海淀 100095；3.北京化工大學分析測試中心，北京 朝陽 100029；4.北京化工大學 生命科學與技術(shù)學院 北京市生物加工過程重點實驗室，北京 朝陽 100029）

UPLC-Q-TOF-MS測定酒石酸泰萬菌素可溶性粉中的泰萬菌素

吳家鑫1，2，尚飛3，張國棟1，2，劉敏4，張傳良1，2，徐金雷1，趙梅仙1，2，宋敏1，2，齊鵬1，2，陶蓓蓓3

（1.中牧實業(yè)股份有限公司 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化學藥品重點實驗室 北京市獸用多肽疫苗設計與制備工程技術(shù)研究中心，北京 海淀 100095；2.中國牧工商（集團）總公司，北京 海淀 100095；3.北京化工大學分析測試中心，北京 朝陽 100029；4.北京化工大學 生命科學與技術(shù)學院 北京市生物加工過程重點實驗室，北京 朝陽 100029）

本試驗建立了酒石酸泰萬菌素可溶性粉中泰萬菌素含量的超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜檢測方法（UPLC-Q-TOF-MS），并對二級質(zhì)譜中的離子碎片進行了比對分析。采用C18色譜柱分離，以乙腈-0.1%甲酸水溶液（含2 mmol/L乙酸銨）為流動相梯度洗脫，流速0.4 mL/min，柱溫40℃。質(zhì)譜條件為電噴霧離子源，檢測方式為正離子全掃描模式，外標法定量。結(jié)果表明，藥物濃度與峰面積在100～2 000 μg/L范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)R2=0.9992；泰萬菌素的檢出限為3 μg/L，定量限為10 μg/L；添加回收率在98.9%～104.7%之間，批內(nèi)變異系數(shù)為1.27%～1.81%，批間變異系數(shù)為1.04%～1.59%。利用Molecular Structure correlator對碎片進行了分析比對，為泰萬菌素的結(jié)構(gòu)驗證提供了依據(jù)。

超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜；泰萬菌素；可溶性粉

泰萬菌素（Tylvalosin），又稱乙酰異戊酰泰樂菌素（Acetylisovaleryltylosin），化學名為3-O-乙酰-4”-O-異戊酰泰樂菌素，是一種高效的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，對支原體、螺旋體、大部分革蘭陽性菌和部分革蘭陰性菌均有較強的抗菌活性，尤其對支原體的抗菌活性特別大，其抗菌和抗支原體活力均高于泰樂菌素［1］；主要用于治療家禽和其他動物的支原體感染，豬的弧菌性痢疾、傳染性胸膜肺炎、喘氣病等，是畜禽專用抗生素［2-4］。

目前泰萬菌素在中國畜牧業(yè)中的應用主要集中于酒石酸泰萬菌素可溶性粉，在獸藥檢測中多使用高效液相色譜法和生物檢測法對泰萬菌素含量進行檢測，食品動物組織中的泰萬菌素同系抗生素的殘留檢測方法也多使用液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜法等方法［5］。超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）是目前分析復雜系統(tǒng)的有效手段，其中UPLC具有超高壓、超高靈敏度、超高分離度等特點［6］，Q-TOFMS具有高靈敏度、高選擇性、能得到高質(zhì)量質(zhì)譜圖和化合物精確分子質(zhì)量的特點［7］。

使用UPLC-Q-TOF-MS檢測泰萬菌素既可以縮短檢測時間、保證較高的檢測靈敏度，又可以通過結(jié)構(gòu)比對確證泰萬菌素的分子結(jié)構(gòu)。本文在前人的基礎(chǔ)上，研究建立了酒石酸泰萬菌素可溶性粉中泰萬菌素含量的UPLC-Q-TOF-MS檢測方法，并對二級質(zhì)譜中的離子碎片進行了比對分析。

1　材料與方法

1.1儀器設備Agilent 7890B超高效液相色譜儀，配備二元梯度泵，真空在線脫氣機，自動進樣器，Agilent 6540Q-TOF質(zhì)譜儀；儀器控制、數(shù)據(jù)采集軟件及數(shù)據(jù)分析軟件采用Agilent公司的MassHnuter系統(tǒng)；碎片分析軟件采用Molecular Structure correlator。

1.2藥品與試劑泰萬菌素標準品（96.6%），中牧實業(yè)股份有限公司；酒石酸泰萬菌素可溶性粉（含量25%），內(nèi)蒙古中牧生物藥業(yè)有限公司；甲酸（Fisher公司）為色譜純試劑，乙腈（Fisher公司）為質(zhì)譜級試劑，所用水均為去離子水。

1.3儀器檢測方法超高效液相色譜條件：Agilent Extend-C18色譜柱（50×2.1 mm，1.8 μm），柱溫：40℃。流動相：A相為0.1%甲酸水溶液（含2 mmol/ L乙酸銨），B相為乙腈；流速0.4 mL/min。進樣體積為3 μL；梯度洗脫程序：0.00→10.00 min，90%→50% A；10.00→13.00 min，50%→90%A。

質(zhì)譜條件：電噴霧正離子源（ESI+），電壓3 500 V，干燥氣溫度300℃，錐孔電壓65 V，鞘氣溫度350℃，干燥氣和鞘氣流量分別為8 L/min和11 L/min，霧化氣壓力35 psi，全掃描模式（100～1 200 amu）。

1.4樣品提取方法的建立酒石酸泰萬菌素可溶性粉溶解于甲醇后，超聲振蕩30 min，充分混合后經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾后備用。

1.5標準曲線的制定稱取一定量的泰萬菌素標準品，甲醇溶解配置5個標準曲線樣本。標準濃度分別為100 μg/L，250 μg/L，500 μg/L，1 000 μg/L，2 000 μg/L。

1.6添加回收率、準確度與精密度測定設定500 μg/L，1 000 μg/L，1 500 μg/L 3個添加水平，并分別添加于酒石酸泰萬菌素可溶性粉基質(zhì)中，基質(zhì)成分為葡萄糖，配置后泰萬菌素含量為25%，按照1.4的樣品前處理方法進行添加回收試驗，每個水平進行3次檢測，連續(xù)檢測3批不同樣品，計算平均回收率、批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)。

2　結(jié)果與討論

2.1質(zhì)譜條件的選擇按照1.3所示方法對樣品進行檢測，泰萬菌素的質(zhì)譜掃描圖如圖1所示。由圖1可知，一級質(zhì)譜中測得泰萬菌素準分子離子峰［M+H］+m/z 1042.5951；由圖2可知，二級質(zhì)譜中的主要碎片為m/z 109.0647，m/z 174.1119，m/z 402.2444，m/z 640.3692和m/z 815.4576，一級質(zhì)譜泰萬菌素標準品的的提取離子流如圖2所示，其峰形尖銳且對稱，基本符合檢測要求。

2.2方法學驗證

圖1　泰萬菌素標準品的MS1和MS2質(zhì)譜圖

2.2.1標準曲線以一級質(zhì)譜的泰萬菌素提取離子流峰面積與泰萬菌素濃度作圖得到泰萬菌素的標準曲線，結(jié)果表明，泰萬菌素在100～2 000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其線性方程為y= 3849.5x+109606，相關(guān)系數(shù)R2=0.9992。

2.2.2檢測限與定量限以信噪比S/N=3為檢測限（LOD），經(jīng)測定檢測限為3 μg/L；以信噪比S/N=10為定量限（LOQ），經(jīng)測定定量限為10 μg/L。

2.2.3添加回收率、準確度與精密度測定試驗結(jié)果如表1所示，添加回收率在98.9%～104.7%之間，批內(nèi)變異系數(shù)（n=3）為1.27%～1.81%，批間變異系數(shù)（n=3）為1.04%～1.59%，上述數(shù)據(jù)表明本方法具有重復性好，準確度高的特點。

圖2　泰萬菌素一級質(zhì)譜提取離子流圖

表1　　離子碎片結(jié)構(gòu)分析比對

2.3二級質(zhì)譜的碎片分析比對針對泰萬菌素在二級質(zhì)譜中存在的離子碎片，本文利用Molecular Structure correlator對碎片進行了分析比對，其結(jié)果如表2所示，其總體匹配度得分達到96.73，且各個碎片的匹配度得分也均在90分左右，說明二級質(zhì)譜所得的離子碎片與預測碎片具有良好的相關(guān)性，這為泰萬菌素鑒定提供了較好的依據(jù)。

2.4實際樣品檢測采用上述方法對酒石酸泰萬菌素可溶性粉實際樣品進行檢測，一級質(zhì)譜中泰萬菌素提取離子流圖如圖3所示，其出峰時間為7.894 min，與圖2中泰萬菌素標準品出峰時間7.898 min基本一致，峰形良好，說明采用UPLCQ-TOF-MS可以滿足酒石酸泰萬菌素可溶性粉中泰萬菌素的含量檢測要求。

圖3　酒石酸泰萬菌素可溶性粉實際樣品中泰萬菌素提取離子流圖

3　結(jié)論

本文建立了酒石酸泰萬菌素可溶性粉中泰萬菌素含量檢測的UPLC-Q-TOF-MS方法，該方法簡單易行，其靈敏度、準確度、精密度和添加回收試驗均能滿足獸藥檢測的需要；利用Molecular Structure correlator對質(zhì)譜檢測中的離子碎片進行了分析比對，確定了各個碎片的結(jié)構(gòu)，對泰萬菌素的結(jié)構(gòu)驗證提供了依據(jù)。

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S859.79

B

0529-6005（2016）09-0108-03

2015-06-16

吳家鑫（1982-），男，工程師，碩士，從事獸藥研發(fā)工作，E-mail：icebergwujiaxin@163.com