孫思超，孫東東，王英雪，常宏建，劉　云

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

順鉑誘導(dǎo)體外犬乳腺腫瘤細胞凋亡影響

孫思超，孫東東，王英雪，常宏建，劉云

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

為研究順鉑誘導(dǎo)體外犬乳腺腫瘤細胞CHMp凋亡影響，本試驗采用不同濃度的順鉑以不同作用時間處理細胞，用MTT法檢測細胞活性，通過透射電鏡觀察CHMp細胞形態(tài)學(xué)變化，用流式細胞儀研究CHMp細胞凋亡和周期。結(jié)果顯示，CHMp細胞生長受濃度和時間雙重依賴，濃度越高，時間越長，抑制越明顯，在電鏡下觀察細胞出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)，同時5 μmol/L順鉑作用24 h后細胞阻滯于G1/S期，比例高達75.12%。結(jié)果表明，順鉑能抑制CHMp增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，阻滯細胞G1/S期。

順鉑；犬乳腺腫瘤細胞；細胞凋亡

順鉑應(yīng)用于多種腫瘤的一線聯(lián)合化療方案中。自美國密執(zhí)安州立大學(xué)教授BRos即berg和vCamp發(fā)現(xiàn)順鉑具有抗癌活性以來，鉑族金屬抗癌藥物的應(yīng)用和研究得到了迅速的發(fā)展。順鉑已成為癌癥化療不可缺少的藥物［1］。1995年WHO對上百種治癌藥物進行排名，順鉑的綜合評價（療效，市場等）位居榜前列第2位［2］。另據(jù)統(tǒng)計，在我國以順鉑為主或有順鉑參加配伍的化療方案占所有化療方案的70%～80%。而關(guān)于順鉑對犬乳腺腫瘤的國內(nèi)外報道較少，其相關(guān)機制研究也不是很明確。

本試驗以體外培養(yǎng)犬乳腺腫瘤細胞系CHMp株為模型，以不同濃度的順鉑在不同時間、時間點藥物作用下，對CHMp細胞增殖、細胞毒性作用和細胞形態(tài)學(xué)變化及周期阻滯進行分析，探討順鉑誘導(dǎo)細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，為更進一步研究順鉑誘導(dǎo)犬乳腺腫瘤細胞凋亡機制以及犬乳腺腫瘤的臨床治療提供了部分理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細胞系及主要試劑細胞系CHMp是由日本東京大學(xué)農(nóng)學(xué)部生命科學(xué)學(xué)科犬學(xué)院獸醫(yī)外科研究室饋贈。胎牛血清為美國Gibco公司產(chǎn)品。細胞凋亡和周期檢測均有凱基生物公司提供。順鉑、MTT，均購自Sigma公司。

1.2細胞培養(yǎng)從液氮中取出細胞系CHMp進行復(fù)蘇，用含10%Gibco胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于CO2傳代培養(yǎng)，所設(shè)條件為37℃、95%濕度、5% CO2，待細胞形態(tài)和活力處于最佳狀態(tài)時進行下一步試驗。必要時可加入100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素防止真菌感染。

1.3細胞干預(yù)試驗通過查看相關(guān)文獻最終確定以終濃度為1～7 μmol/L7個濃度階梯的順鉑處理密度為1×106個/mL對數(shù)生長期細胞，分別培養(yǎng)12、24、48 h后對細胞進行檢測。

1.4四唑鹽比色法（MTT法）將密度為5×104/ mL的細胞懸液接種于96孔板，以1～7 μmol/L順鉑7個濃度階梯，6個平行樣進行細胞培養(yǎng)。并按MTT法試劑盒說明書以6 h為時間間隔檢測順鉑的抑制率，并計算IC50（半數(shù)致死量）。抑制率=1-加藥組OD值/對照組OD值，lgIC50=Xm-I（P-（3-Pm-Pn）/4），（Xm：lg最大劑量；I：lg最大劑量/相臨劑量；P：陽性反應(yīng)率之和；Pm：最大陽性反應(yīng)率；Pn：最小陽性反應(yīng)率）。

1.5透射電鏡觀察選取終濃度為0 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L順鉑 處 理 細 胞CHMp，先后用2.5%戊二醛固定液和1%鋨酸固定細胞團，丙酮/醋酸異戊酯脫水，環(huán)氧樹脂包埋后切片，在石蠟片上先后滴加醋酸鈉和檸檬酸鉛雙染色并清洗，透射電鏡觀察細胞凋亡形態(tài)及細胞器的變化。

1.6細胞凋亡的檢測選取終濃度為0 μmol/L、5 μmol/L順鉑處理細胞CHMp，用不含EDTA的胰酶消化收集細胞，經(jīng)2次PBS洗滌后（2 000 r/min離心5 min），加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞，在避光條件下先后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL Propidium lodide混勻，進行流式細胞儀的觀察和檢測。

1.7細胞周期的檢測選取終濃度為0 μmol/L、5 μmol/L順鉑處理細胞CHMp，用胰酶消化細胞，經(jīng)2次PBS洗滌后，1 000 r/min（4℃）離心10 min，加入1 mL預(yù)冷的70%乙醇過夜。次日檢測前用PBS洗滌2次，1 000 r/min離心10 min，每管加入的PI配比為500 μL PBS、25 μL PI和2.5 μL RNase A，在避光條件下用流式細胞儀觀察和檢測。

2　結(jié)果

2.1MTT法檢測細胞活性用MTT比色法檢測順鉑在不同濃度梯度和時間梯度對CHMp細胞的抑制率的影響。結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加，抑制率穩(wěn)步上升，且上升趨勢逐漸變緩，經(jīng)公式計算該細胞株的IC50為5.58 μmol/L（圖1）。用濃度為5.58 μmol/L的順鉑以不同時間梯度作用于該細胞株，結(jié)果顯示，隨著時間的增加，細胞的活性逐漸下降，藥物抑制率緩慢上升（圖2）。順鉑對CHMp細胞具有一定的抑制作用，且抑制效果隨著藥物濃度和時間的增加而增加，具有濃度依賴性和時間依賴性。

圖1　不同濃度順鉑對CHMp的抑制率（24 h）

圖2　順鉑對CHMp的抑制趨勢時間分布

2.2電鏡觀察細胞的凋亡形態(tài)用電鏡觀察24 h后不同濃度的順鉑對CHMp細胞生長的影響，發(fā)現(xiàn)在正常狀態(tài)下，細胞結(jié)構(gòu)完整，胞體清晰，胞核和胞漿界限分明，多數(shù)細胞處于對數(shù)生長期，核分裂，細胞活力強（圖3A）。加入CDDP 2.5 μmol/ L后細胞結(jié)構(gòu)完整，體積變小，偶爾也能見到核分裂現(xiàn)象，胞核和胞漿界限較分明，有些細胞表面出現(xiàn)芽狀突起，細胞活性比對照組弱（圖3B），加入CDDP 5.0 μmol/L后可明顯看到胞核內(nèi)有空泡樣變化，核仁發(fā)生碎裂或消失，細胞大小不一，細胞活性弱（圖3C），加入CDDP10 μmol/L后細胞空泡樣加劇，胞漿內(nèi)細胞器溶解消失，出現(xiàn)許多凋亡小體，細胞基本功能喪失，活性很低（圖3D）。

圖3　透射電鏡下順鉑對犬乳腺腫瘤細胞的形態(tài)學(xué)變化 （6 000×）

2.3細胞凋亡和周期分布將對照組和加藥組（順鉑5.0 μmol/L）細胞培養(yǎng)24 h后，用胰酶消化與PI染料混合送往生科樓進行流式細胞儀檢測。結(jié)果可以看出對照組凋亡率低，為2.3%，細胞主要集中在Q3象限內(nèi)，加藥組細胞凋亡率上升，為13.1%，Q2和Q4象限內(nèi)明顯看到細胞團，細胞凋亡明顯，且Q3象限的細胞團均往右移；對照組細胞以G1期為主，S期次之，G2期相對較少，加藥組細胞G1期比例明顯下降，且S期所占比例最多，高達73.67%。由此可見，順鉑能誘導(dǎo)CHMp細胞發(fā)生凋亡，且阻滯細胞生長于G1/S期。見圖4及中插彩版圖5。

3　討論

圖4　流式細胞儀檢測細胞凋亡分布

犬乳腺腫瘤的研究越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的重視，一方面因為它是獸醫(yī)臨床中的常見病，約占母犬所有腫瘤的50%，占母犬生殖系統(tǒng)疾病的82%［3］，是犬腫瘤性疾病中最為重要的類型之一；另一方面，因為犬乳腺腫瘤在發(fā)病原因、組織學(xué)來源、分類以及轉(zhuǎn)移等方面都與人乳腺腫瘤相似，是很好的人乳腺癌的動物模型。

順鉑目前被廣泛運用與實力腫瘤的臨床治療，可抑制癌細胞的DNA復(fù)制過程，并損傷其細胞膜上結(jié)構(gòu)，有較強的廣譜抗癌作用［4］。研究表明，順鉑在體外也可抑制細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡［5］。本試驗MTT檢測中，順鉑對CHMp細胞具有明顯的抑制作用，且存在時間依賴性和濃度依賴性。在電鏡下觀察細胞可看到細胞凋亡明顯，胞質(zhì)內(nèi)空泡樣變化，核碎裂甚至消失。本試驗結(jié)果與有關(guān)順鉑抗癌機制研究一致［6］，對犬乳腺腫瘤的治療具有一定的理論依據(jù)。

促進細胞凋亡是治療腫瘤細胞的一個有效途徑，有研究表明，順鉑等鉑類化療藥物能夠阻滯細胞于G1/S期［7］。由于順鉑作用的靶點之一是細胞DNA。當順鉑進入細胞后，可與胞內(nèi)DNA結(jié)合，使DNA發(fā)生結(jié)構(gòu)扭曲，而使細胞DNA損傷，發(fā)生凋亡現(xiàn)象，這一損傷主要發(fā)生于S期。因為順鉑本身是細胞周期特異的藥物（S期特異的殺傷藥物），可將細胞阻滯于G1/S期［8］。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，順鉑能夠促進犬乳腺腫瘤細胞CHMp凋亡，但從結(jié)果看凋亡并不十分明顯，對照組和試驗組凋亡率相差10%左右，而圖中確實存在一部分細胞發(fā)生凋亡，其原因可能是順鉑不僅促進該細胞株細胞凋亡，而且能抑制細胞增殖，兩者作用使細胞活性降低。其有關(guān)抗癌作用機制還有待進一步研究。而細胞周期檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗組G1/S期細胞占總細胞周期的一半以上，明顯高于對照組，與有關(guān)研究一致。由此可見，順鉑確實誘導(dǎo)CHMp細胞凋亡，并阻滯細胞生長于G1/S期。

本試驗證實順鉑對犬乳腺腫瘤細胞CHMp具有抑制作用，阻滯細胞于G1/S期，促進細胞調(diào)亡。然而，順鉑在犬乳腺腫瘤臨床治療上的運用，還需動物試驗進一步對其進行研究。

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Apoptosis with CDDP induced in caninebreast cancer cells

SUN Si-chao，SUN Dong-dong，WANG Ying-xue，CHANG Hong-jian，LIU Yun
（College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

To explore the effects of cisplatin on the induction of apoptosis in CHMp cells，we treated cells with different concentrations of cisplatin at different times.The cell activity was detected by MTT assay and by transmission electron microscopy observation of CHMP morphological changes.We analyzed CHMP apoptosis and cell cycle using flow cytometry.Results showed that CHMP cell growth was the concentration and time dependent.When the concentration was higheer，the time was longer，and the inhibition was more obvious.The cells exhibited apoptotic morphology，and were arrested at the G1/S phase，up to 75.12%.The results showed that cisplatin could inhibit the proliferation of CHMp，induce apoptosis，and arrest cell G1/S phase.

cisplatin；CHMp；apoptosis；Gene downregulation

LIU Yun

S858.292

A

0529-6005（2016）09-0007-02

2016-01-22

孫思超（1991-），男，碩士，主要從事犬乳腺腫瘤細胞研究，E-mail：695223356@qq.com

劉云，E-mail：abliuyun@yeah.net