于珊珊，錢偉鋒，2，許建海，劉　　群

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193；2.河南科技大學(xué)，河南 洛陽(yáng) 471023）

北京地區(qū)犬貓弓形蟲和新孢子蟲感染的檢測(cè)與分析

于珊珊1，錢偉鋒1，2，許建海1，劉群1

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193；2.河南科技大學(xué)，河南 洛陽(yáng) 471023）

了解犬、貓弓形蟲和新孢子蟲感染情況，應(yīng)用SPA-ELISA和ICT對(duì)2008-2011年間收集的北京地區(qū)137份流浪貓、186份寵物貓和763份寵物犬及其他部分省市的57份鄉(xiāng)村犬進(jìn)行血清抗體檢測(cè)；同時(shí)，提取貓及部分犬的血樣DNA，分別擴(kuò)增弓形蟲和新孢子蟲特異性基因片段。結(jié)果顯示，流浪貓和寵物貓弓形蟲抗體陽(yáng)性率分別為24.1%（33/ 137）和13.4%（25/186），寵物犬和鄉(xiāng)村犬分別為14.5%（111/763）和24.6%（14/57），不同來(lái)源的犬或貓抗體陽(yáng)性率差異顯著（P＜0.05）；流浪貓和寵物貓的新孢子蟲抗體陽(yáng)性率分別為7.30%（10/137）和6.45%（12/186），寵物犬和鄉(xiāng)村犬分別為6.06%（8/132）和10.5%（6/57），差異均不顯著（P＞0.05）。寵物貓和流浪貓基因檢測(cè)的陽(yáng)性率分別為3.65%和2.15%，差異不顯著（χ2=0.22，P＞0.05）；132份寵物犬和29份鄉(xiāng)村犬基因檢測(cè)陽(yáng)性率分別為18.2%和6.90%，差異顯著（P＜0.05）。血液中蟲體特異性基因檢出率低于血清抗體檢出率。寵物犬和寵物貓弓形蟲和新孢子蟲感染隨著年齡增加呈上升趨勢(shì)，但各年齡段差異不顯著（P＞0.05）。

犬；貓；弓形蟲；新孢子蟲；抗體；DNA

龔地弓形蟲（Toxoplasma gondii，簡(jiǎn)稱弓形蟲）是能夠寄生于多種動(dòng)物與人有核細(xì)胞的頂復(fù)亞門原蟲。貓既是弓形蟲的終末宿主又是中間宿主，犬、家畜、家禽、野生動(dòng)物、海洋哺乳動(dòng)物和人都是弓形蟲的中間宿主。犬新孢子蟲（Neospora caninum，簡(jiǎn)稱新孢子蟲）是與弓形蟲極其相似的多種動(dòng)物共患原蟲，犬既是終末宿主又是中間宿主，貓、家畜、禽類、野生動(dòng)物等均為中間宿主。弓形蟲和新孢子蟲都是機(jī)會(huì)性病原，均可寄生于宿主的全身有核細(xì)胞，危害形式多樣，健康犬和貓感染后較少表現(xiàn)臨床癥狀，多呈隱性感染長(zhǎng)期帶蟲。免疫力低下動(dòng)物感染弓形蟲后可呈現(xiàn)全身性熱性疾病，新孢子蟲的主要危害是引起感染動(dòng)物的神經(jīng)肌肉功能障礙，幼犬可表現(xiàn)為跛行和皮膚潰瘍。二者共同的臨床表現(xiàn)為懷孕動(dòng)物流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙。

近年來(lái)，寵物犬和貓飼養(yǎng)量不斷增多，流浪犬和貓的數(shù)量也隨之升高，犬貓感染弓形蟲和新孢子蟲的危害及其對(duì)人類的潛在威脅逐漸被關(guān)注。國(guó)內(nèi)外已有多篇關(guān)于犬、貓弓形蟲和新孢子蟲感染的報(bào)道［1-5］。不同報(bào)道中犬貓弓形蟲和新孢子蟲的感染率存在明顯差異，感染情況與動(dòng)物的養(yǎng)殖方式、品種、機(jī)體狀況以及氣候等諸多因素有關(guān)，所用檢測(cè)方法也一定程度影響檢測(cè)結(jié)果。

為了進(jìn)一步了解北京地區(qū)犬、貓弓形蟲和新孢子蟲的感染狀況，我們分別檢測(cè)北京地區(qū)的寵物犬、貓及流浪貓及鄉(xiāng)村犬的血清抗體和血液DNA，為犬貓的弓形蟲和新孢子蟲感染及進(jìn)一步的防控研究提供數(shù)據(jù)和資料。

1　材料與方法

1.1材料流浪貓137份，采自北京生活小區(qū)及部分收容所。寵物貓186份和寵物犬763份，采自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院的門診病例。鄉(xiāng)村犬57份，采自北京周邊的鄉(xiāng)村散養(yǎng)犬。采集靜脈血，分離血清-20℃冰箱保存?zhèn)溆?；提取血液有型成分DNA保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要儀器分別使用Bio-rad公司的酶標(biāo)儀model680、德國(guó)Eppendorf公司的Centrifuge5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)和移液器、德國(guó)Biometra公司的PCR儀和 Alpha Innotech公司 Alphalmager 2200凝膠成像系統(tǒng)。

1.3主要試劑包被緩沖液（0.05mol/L pH值9.6的碳酸鹽緩沖液）；20×濃縮洗滌液（pH值6.0-6.2的PBST溶液）；封閉液（5%馬血清和1%BSA的PBS）；血清樣本稀釋液（1%BSA的PBS，pH值7.4）；酶標(biāo)記物SPA-HRP稀釋液（1%BSA的PBS，pH值7.4）；酶標(biāo)記物工作液（1∶12 000）；終止液（2 mol/L H2SO4）。酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）。分離緩沖液：按照pH值7.4 Tris·Cl（10 mol/L），NaCl（10 mol/L），pH值8.0 EDTA-Na2（25 mol/L），SDS（1%），蛋白酶K（100 μg/mL）的終濃度在蒸餾水中加入適量上述液體，混勻。1%氯金酸和1%檸檬酸三鈉。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1血清弓形蟲抗體檢測(cè)應(yīng)用本課題組研制的SPA-ELISA試劑盒。

1.4.2血清新孢子蟲抗體檢測(cè)應(yīng)用本課題組建立的膠體金試紙條（ICT）。

1.4.3血液DNA提取常規(guī)方法提取全血沉淀的DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4巢氏PCR擴(kuò)增弓形蟲特異性DNA片段根據(jù)弓形蟲的SAG1基因設(shè)計(jì)、合成兩對(duì)引物，外引物對(duì)Tg1（GCGAATTCATGTCAGATCCCCCTCT）和Tg2（GCGGATTCTCACGCAGGCGACACAAGCT），內(nèi)引物對(duì)Tg3（CGACAGCCGCGGTCATTCTC）和Tg4（GCAACCAGTCAGCGTCGTCC），擴(kuò)增片段大小為522 bp。

PCR反應(yīng)體系為每25 μL體系中加入2×Easy Taq PCR Supper Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL（20 pm），模板DNA 1 μL，分別以超純水和弓形蟲RH株DNA為陰、陽(yáng)性對(duì)照。

反應(yīng)程序：94℃變性4 min；94℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸10 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。循環(huán)結(jié)束后取0.1 μL第一輪產(chǎn)物作為模板，重復(fù)如上擴(kuò)增循環(huán)。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，將擴(kuò)增的特異性條帶回收后送公司測(cè)序，與Gen Bank中的基因序列進(jìn)行比對(duì)。

1.4.5巢氏PCR擴(kuò)增新孢子蟲特異性DNA根據(jù)新孢子蟲Nc-5基因設(shè)計(jì)、合成兩對(duì)引物，其中外引物為Np6（CTCGCAGTCAACCTACGTCTTCT）和Np21（CCCAGTGCGTCCAATCCTGTAAC），內(nèi)引物為 Np9（GTTGCTCTGCTGACGTGTCGTTG）和Np10（CTCAACACAGAACACTGAACTCTCG），擴(kuò)增片段大小為224 bp。

反應(yīng)程序：94℃變性5 min；94℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。循環(huán)結(jié)束后取0.1 μL第一輪產(chǎn)物作為模板，重復(fù)如上擴(kuò)增循環(huán)。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳鑒定，將擴(kuò)增的特異性條帶回收后送公司測(cè)序，與Gen Bank中的基因序列進(jìn)行比對(duì)。

2　結(jié)果

2.1貓的血清弓形蟲抗體與特異性DNA檢測(cè)

137份流浪貓和186份寵物貓血清的弓形蟲抗體經(jīng)SPA-ELISA檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1，陽(yáng)性率分別為24.1%和13.4%，經(jīng)卡方統(tǒng)計(jì)分析表明二者差異顯著（χ2=6.07，P＜0.05）。流浪貓血液弓形蟲DNA檢出率為10.2%，寵物貓為17.2%，差異不顯著（χ2= 0.67，P＞0.05）。PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，陽(yáng)性擴(kuò)增片段大小為522 bp（圖1），序列與弓形蟲RH株的序列相似性達(dá)98%。

表1　貓弓形蟲抗體與DNA檢測(cè)

對(duì)背景資料清晰的113份貓（46份寵物貓，67份流浪貓）的檢測(cè)結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)公貓血清抗體陽(yáng)性率為20.0%，母貓為22.4%；DNA檢測(cè)為公貓陽(yáng)性率16.4%，母貓10.3%。卡方統(tǒng)計(jì)分析表明不同性別的貓血清抗體及血液DNA陽(yáng)性率差異均不顯著（P＞0.05）。對(duì)年齡資料清晰貓的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，顯示寵物貓弓形蟲感染率隨年齡增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，其中7歲以上的寵物貓抗體陽(yáng)性率達(dá)21.7%，但各個(gè)年齡段血清抗體和DNA陽(yáng)性率差異均不顯著（P＞0.05）。

圖1　貓血液弓形蟲DNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

2.2犬弓形蟲血清抗體和血液DNA檢測(cè)應(yīng)用SPA-ELISA對(duì)763份寵物犬和57份鄉(xiāng)村犬的弓形蟲的血清抗體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，其中鄉(xiāng)村犬血清抗體陽(yáng)性率（24.6%）明顯高于寵物犬（14.5%），二者差異顯著（P＜0.05）。對(duì)其中的132份寵物犬和29份鄉(xiāng)村犬血液DNA的PCR擴(kuò)增，二者的陽(yáng)性率分別為18.2%和6.90%，差異顯著（P＜0.05）。擴(kuò)增的DNA片段測(cè)序結(jié)果為529 bp，同弓形蟲SAG1基因序列相似性均達(dá)99%。

表2　犬弓形蟲抗體與DNA檢測(cè)

對(duì)背景資料清晰的132份寵物犬和29份鄉(xiāng)村犬進(jìn)行性別與弓形蟲陽(yáng)性率關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，公犬抗體陽(yáng)性率為24.1%，母犬為28.2%；血液DNA檢測(cè)公犬陽(yáng)性率為13.3%，母犬為19.2%。不同性別犬的弓形蟲抗體和DNA檢測(cè)陽(yáng)性率差異均不顯著（P＞0.05）。

對(duì)132份年齡清晰的寵物犬分析發(fā)現(xiàn)，犬的抗體和基因檢測(cè)陽(yáng)性率隨年齡增加呈上升趨勢(shì)，但不同年齡段的犬差異不顯著（P＞0.05）。

2.3貓新孢子蟲血清抗體和血液DNA檢測(cè)應(yīng)用ICT檢測(cè)了流浪貓和寵物貓血清新孢子蟲抗體，流浪貓的抗體陽(yáng)性率為7.30%，寵物貓為6.45%，見(jiàn)表3，卡方統(tǒng)計(jì)分析二者的差異不顯著（χ2=0.09，P＞0.05）。新孢子蟲特異性Nc-5基因的陽(yáng)性率分別為3.65%和2.15%，也無(wú)顯著差異（χ2= 0.22，P＞0.05）。DNA擴(kuò)增片段大小為224 bp左右，序列與新孢子蟲Nc1株的Nc-5基因相似性為99%。

表3　貓新孢子蟲抗體與DNA檢測(cè)

圖2

對(duì)背景資料清晰的113份貓血清（67份流浪貓和46份寵物貓）進(jìn)行性別與抗體及DNA陽(yáng)性率相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)性別與新孢子蟲感染率無(wú)顯著相關(guān)性。

表4　犬的新孢子蟲血清抗體與DNA檢測(cè)

2.4犬的新孢子蟲血清抗體與血液DNA檢測(cè)對(duì)犬新孢子蟲抗體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4，寵物犬的陽(yáng)性率為6.06%，鄉(xiāng)村犬為10.5%，二者差異不顯著（χ2=0.60，P＞0.05）。巢氏PCR擴(kuò)增血液DNA，寵物犬和鄉(xiāng)村犬血液DNA陽(yáng)性率分別為9.85%和6.90%，二者無(wú)顯著差異（χ2=0.02，P＞0.05）。擴(kuò)增的DNA片段大小均為224 bp，與NC1株的Nc-5基因的相似性達(dá)99%。不同性別和不同年齡寵物犬的新孢子蟲抗體與DNA陽(yáng)性率差異不顯著（P＞0.05）。

3　討論與分析

犬、貓的弓形蟲感染在我國(guó)北京、上海、深圳、新疆等地［4，6-8］均有報(bào)道，弓形蟲感染普遍存在，但不同地區(qū)感染率存在一定差異。Dubey等［4］檢測(cè)了廣州的34份貓血清弓形蟲抗體，陽(yáng)性率高達(dá)79.4%，Zhang等［8］的報(bào)道廣州地區(qū)犬的弓形蟲抗體陽(yáng)性率為33.3%。在巴西，犬和貓弓形蟲感染率高達(dá)85%以上［9-10］。新孢子蟲在世界各地的牛、犬、貓及各種野生動(dòng)物新孢子蟲感染的報(bào)道，血清抗體陽(yáng)性率從0%-100%不等［3］，我國(guó)對(duì)犬和貓新孢子蟲感染報(bào)道較少。

我們前期建立了SPA-ELISA可檢測(cè)多種動(dòng)物的血清弓形蟲抗體，將其應(yīng)用于對(duì)犬、貓血清弓形蟲抗體的檢測(cè)，流浪貓和鄉(xiāng)村犬血清抗體陽(yáng)性率分別為24.1%和24.6%，明顯高于寵物貓（13.4%）和寵物犬（14.5%），原因可能是流浪貓和鄉(xiāng)村犬生活環(huán)境及食物來(lái)源混雜，食入含有弓形蟲包囊的嚙齒動(dòng)物及生肉機(jī)會(huì)較多。在特立尼達(dá)和多巴哥，250只犬中流浪犬弓形蟲陽(yáng)性率最高為60.5%，獵犬為30.5%，寵物犬為25.5%。在匈牙利，鄉(xiāng)村貓（61.3%）的感染率也明顯高于寵物貓（22.4%）和城市周邊地區(qū)貓（50%）［11］。在我國(guó)廣州地區(qū)進(jìn)行的檢測(cè)也顯示，流浪犬（33.3%）和流浪貓（30.77%）弓形蟲抗體陽(yáng)性率明顯高于寵物犬（17.5%）和寵物貓（17.98%）［6］。

在本次檢測(cè)中，對(duì)背景資料清晰的犬、貓血液DNA檢測(cè)，其中流浪貓和寵物貓的DNA陽(yáng)性率分別為10.4%和17.4%，寵物犬和鄉(xiāng)村犬分別為18.2%和6.90%，不同來(lái)源的犬或貓DNA陽(yáng)性率差異均不顯著（P＞0.05）。存在的問(wèn)題是，抗體檢測(cè)和DNA檢測(cè)結(jié)果并不一致，主要原因應(yīng)該是血液中出現(xiàn)可檢出蟲體DNA和血清抗體的時(shí)機(jī)并不一致，檢出抗體或蟲體特異性DNA均可判定動(dòng)物感染。

對(duì)犬、貓血清新孢子蟲的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，流浪貓和寵物貓抗體陽(yáng)性率分別為7.30%和6.45%，鄉(xiāng)村犬和寵物犬分別為10.5%和6.06%，不同來(lái)源的犬或貓抗體陽(yáng)性率差異不顯著。關(guān)于犬和貓新孢子蟲的感染率，不同報(bào)道的結(jié)果差異較大，流浪犬和流浪貓新孢子蟲抗體陽(yáng)性率明顯高于寵物犬和寵物貓，分析原因應(yīng)該與犬貓的生活環(huán)境密切相關(guān)。

犬、貓弓形蟲和新孢子蟲感染隨年齡增長(zhǎng)呈升高的趨勢(shì)，不同性別間也有一定差異，但犬和貓的年齡和性別對(duì)其感染率的相關(guān)性差異均不顯著。

弓形蟲和新孢子蟲的宿主范圍非常相似，本次檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)犬、貓也存在著一定程度的弓形蟲和新孢子蟲共同感染。已有多篇報(bào)道兩種病原的共同感染，如Azevedo等［5］曾報(bào)道過(guò)犬新孢子蟲和弓形蟲共感染率為14%，Bresciani等［12］報(bào)道貓弓形蟲和新孢子蟲共同感染率為10.3%。

對(duì)北京地區(qū)不同來(lái)源犬、貓血清弓形蟲和新孢子蟲抗體及血液DNA的檢測(cè)，再次證明犬和貓的弓形蟲和新孢子蟲感染較為普遍，且流浪犬和貓的感染程度明顯高于寵物犬貓，提醒管理部門應(yīng)該高度關(guān)注流浪動(dòng)物，及時(shí)收容流浪犬和貓，防控流浪動(dòng)物傳播疾病，尤其是人獸共患病的傳播。

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S829.292，S858.293

A

0529-6005（2016）09-0031-04

2015-07-10

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2015-CB150300）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31372424，30871861）

于珊珊（1985-），女，碩士，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)，E-mail：yumengsha123@163.com

劉群，E-mail：qunliu@cau.edu.cn